Summary
Vi beskriver vår protokoll for måling av biologiske rytmer i protein katabolisme via autofagi og proteasomet i mus leveren.
Abstract
Celler benytter flere metoder for gjenvinning av uønskede proteiner og annet materiale, inkludert lysosomal og ikke-lysosomal veier. Den viktigste lysosome-avhengige stien kalles autofagi, mens den primære ikke-lysosomal metoden for protein katabolisme er ubiquitin-proteasomet systemet. Nyere studier i modell organismer tyder på at aktiviteten til både autofagi og det ubiquitin-proteasomet systemet ikke er konstant over dagen, men i stedet varierer i henhold til en daglig (døgn) rytme. Evnen til å måle biologiske rytmer i protein omsetning er viktig for å forstå hvordan mobil kvalitetskontroll oppnås og for å forstå dynamikken i bestemte proteiner av interesse. Her presenterer vi en standardisert protokoll for kvantifisere autophagic og proteasomal Flux in vivo som fanger opp den biologiske komponenten av protein omsetning. Vår protokoll inneholder detaljer for mus håndtering, vev prosessering, fraksjonering, og autophagic Flux kvantifisering bruker mus leveren som utgangsmaterialet.
Introduction
Døgnrytme refererer til daglige, forutsigbare variasjoner i biologisk funksjon som er åpenbare i naturen. De eksisterer på alle biologiske skala, fra makroskopisk atferd som søvn-våkne sykluser, til molekylære fenomener som rytmisk overflod av biomolekyler. I de senere årene har forskning på døgn rytmer blitt forvandlet av oppdagelsen av "klokke gener" som er avgjørende for generering av døgnrytme. Studier i klokke genet knockout mus har avdekket en sentral rolle for døgnrytme i timelig organisering kjerne cellulære prosesser som metabolisme1. Blant de måtene døgnrytmen gjør dette på, er ved å formidle en timelig struktur til protein katabolisme.
Flere grupper, inkludert vår har vist at de to store veier for mobilnettet protein katabolisme, autofagi og ubiquitin-proteasomet systemet, er underlagt dagaktive rytmer2,3,4,5. Autofagi representerer den lysosome armen av protein katabolisme der proteiner av interesse blir levert til denne degradative organelle enten gjennom byggingen av en roman vesicle (macroautophagy) eller gjennom direkte translokasjon om en kanal (Anstandsdame mediert autofagi)6. Den ubiquitin-proteasomet systemet er den viktigste ikke-lysosomal veien, hvor proteiner er Poly-ubiquitinated og deretter matet inn i proteasomet, en makro molekylære degradative maskin funnet i hele cytoplasma og nucleus7,8. Rytmer i autophagic og proteasomal aktivitet er viktig fordi de sannsynligvis spiller en rolle i mobilnettet housekeeping. Som et resultat, er det verdifullt å ha en standardisert prosedyre som kan oppdage daglig svingninger i protein katabolisme som er kompatibel med pre-klinisk sykdom modeller.
Her gir vi vår protokoll for kvantifisere dagaktive variasjoner i autophagic Flux i mus leveren, som har fungert som grunnlag for arbeid i vårt laboratorium3,9. Vår metode er klassifisert som en "omsetning analysen"10, en tilnærming som brukes av mange grupper for å måle proteolytiske aktivitet (eller Flux). I denne tilnærmingen, protease hemmere spesifikke for lysosomer eller proteasomes administreres til mus og deretter vevsprøver er oppnådd etter en fast tidsintervall. Parallelt er vevsprøver innhentet fra mus utsatt for humbug injeksjoner. Vevsprøvene er homogenisert og deretter biokjemisk separert for å oppnå de lysosome-beriket og cytoplasmatiske fraksjoner. Disse fraksjoner blir deretter analysert parallelt via vestlige blotting ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for macroautophagy markører (LC3b og p62) eller proteasomal underlag (Poly-ubiquitinated protein). Over tid, dyr injisert med protease hemmere akkumulere proteiner som normalt ville ha blitt resirkulert. Som et resultat, er frekvensen av omsetningen utledes ved å sammenligne overflod av markør proteiner i protease-hemmere behandlet prøvene til humbug-behandlet prøvene. Ved å gjenta denne metoden ved faste tidsintervaller på dagen er det mulig å rekonstruere døgnvariasjoner i proteinolyse (figur 1a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen som beskrives her ble godkjent av Washington University i St. Louis Animal Care og use Committee (IACUC).
1. mus bolig og eksperimentell design
- For å oppdage daglige rytmer i protein omsetning, er hus mus (hann eller hunn C57BL/6J, 4 − 8 uke gammel, 20 − 25 g) under standard 12 h lys/mørke sykluser med mat levert Ad lib. For å unngå å understreke dyrene, acclimate mus i minst en uke i anlegget før bruk og unngå enkelt boliger. For å bevise at rytmer i protein katabolisme er virkelig døgn (dvs. drevet av dyrets interne biologiske klokke), hus mus under konstant mørke forhold, ta vare for å unngå å utsette musene for eksogene lys.
Merk: For mer informasjon om muse boliger for eksperimenter med døgnrytme, se følgende referanse11. - For hvert tids punkt, bevilge tre mus som humbug kontroller og minst tre mus for hver type protease inhibitor brukes (leupeptin for autophagic Flux og bortezomib for proteasomal Flux målinger). Plan for seks tid poeng jevnt fordelt på 4 h intervaller over dag/natt syklus å få vevsprøver.
Merk: Et 24 h, 6 tids punkt eksperiment med fosfat-bufret saltvann (PBS), leupeptin, og bortezomib vil kreve totalt 54 mus (3 per behandling x 3 behandlinger x 6 ganger poeng).
2. utarbeidelse av homogenisering løsning, inhibitor Stock Solutions, og ampuller for mus Liver Collection
- Forbered fersk homogenisering buffer (HB) og holde på isen: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM sukrose, 5 mM EDTA pH 8,0, og 1 protease inhibitor tablett per 100 mL.
Merk: Det trengs ca. 10 mL HB per mus. - For nedstrøms behandling av biologiske prøver, krever hver prøve en 15 mL konisk rør for å holde grov homogenate, en 15 mL rør for å holde post-kjernefysiske supernatanten, to 1,5 mL mikrosentrifugen rør for å holde 3 000 x g og 20 000 x g pelleted materiale, henholdsvis, og en 1,5 mL mikrosentrifugen rør for å holde cytoplasmatiske brøkdel. Tilsett 7 mL kald HB til hvert rør beregnet for grov homogenate og holde på isen.
- Forbered en 2 mg/mL lagerløsning av leupeptin hemi-sulfat i steril PBS. Forbered også en 50 mg/mL oppløsning av bortezomib i dimethyl sulfoxide (DMSO). Alikvot og oppbevar løsningene ved-80 ° c.
3. protease inhibitor administrasjon
- Tin leupeptin (2 mg/mL) og bortezomib (50 mg/mL) til romtemperatur 15 min før hvert tidspunkt. Den leupeptin aksjen er klar for injeksjon. Fortynne bortezomib i steril PBS å gi en 50 μg/mL arbeids løsning.
Merk: Bortezomib er lysfølsom, så Beskytt arbeids bestanden fra lys til bruk. - Veie mus og utføre intraperitoneal injeksjoner av "humbug" PBS (0,5 mL), leupeptin (40 mg/kg), eller bortezomib (1,6 μg/kg). Returner mus til riktig merket bur gruppert etter hvilken type injeksjon de fikk. Registrere tidspunktet når musene behandles eller manipuleres i en standardisert tabell (se supplerende fil "sample data").
Merk: En dose Kalkulator er inkludert som et hjelpemiddel i tilleggsfilen "sample data". Det er viktig å utføre injeksjoner expeditiously og i samme rekkefølge fra timepoint til timepoint for å minimere variasjon.
4. vev oppkjøp og lagring
- To timer etter injeksjon, euthanize mus en om gangen i samsvar med institusjonelt godkjent IACUC protokollen. For eksempel, bedøve mus deretter euthanize av cervical forvridning. Fortsett til disseksjon trinnet umiddelbart etter døds aktiv.
Merk: Sikre fullstendig anestesi før cervical forvridning ved å knipe foran poter uten en synlig refleks. - Fjern venstre flik av leveren ved å lage en 1,5 til 2,0 cm snitt med Metzenbaum saks på musen er ventrale magen. Externalize venstre flik av leveren og avgiftsdirektoratet det med kirurgisk saks. Senk lever prøven i 7 mL iskald HB i en passende merket 15 mL konisk slange. Oppbevar prøven på isen gjennom hele behandlingen.
Merk: Prøvene kan oppbevares på is eller ved 4 ° c over natten før du fortsetter. Hvis standard markører for macroautophagy og proteasomal aktivitet er de eneste tiltenkte readouts, kan lever prøvene blinke frosset i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c for senere behandling. For å undersøke andre mål for degradering (f.eks. via Proteomikk), må du behandle prøvene uten å fryse. - Fortsett til euthanize og analysere den neste musen til alle prøvene er ervervet. Behandle mus i samme gruppe rekkefølge som de ble injisert, og Registrer varigheten av dette trinnet (se tilleggsfil "eksempel data"). Hver mus skal behandles på under 5 min å begrense forskjellen i eksponeringstider for injisert hemmere.
5. biokjemiske Fraksjonering av Leverprøver
Merk: Figur 1B viser fraksjonering ordningen.
- Overfør hver lever prøve og 7 mL HB inn i en 15 mL kapasitet Dounce homogenisator. Homogenisere prøven med 10 slag av det løse stempelet og 15 slag i det stramme stempelet. Returner den resulterende råolje homogenate til 15 mL konisk rør den stammer fra. Gjenta til alle lever prøvene har blitt homogenisert.
- Spin råolje homogenate prøver på 700 x g for 10 min ved 4 ° c til pellets kjerner og rusk. Overfør topp 4 mL av post-kjernefysiske supernatanten (S1) til et friskt 15 ml konisk rør.
- Bestem protein konsentrasjonen av brøk S1 bruker Bradford eller bicinchoninic acid (BCA) analyser i henhold til produsentens instruksjoner. Neste utjevne konsentrasjonen av alle prøvene til 2,1 mg/mL eller til ønsket konsentrasjon ved å legge fersk HB til S1 der det er nødvendig. Normalisert prøvene er "total protein" (tot) brøk. For nedstrøms analytiske formål og kvalitet forbedring, alikvot 500 μL av tot brøk og lagre ved-80 ° c.
- Overfør 1,5 mL av den resterende tot -fraksjonen i et mikrosentrifugen rør og snurr ved 3 000 x g i 15 min ved 4 ° c. Overfør 1 mL av den resulterende supernatanten (S2) til et friskt mikrosentrifugen rør og satt på is.
- Aspirer de resterende supernatanten og vask 3 000 x g pellet (3KP) to ganger med 1,5 ml kald HB. 3KP pellet kan oppbevares tørt ved-80 ° c Hvis nedstrøms Proteomikk er forventet. Hvis bare vestlig blotting er forventet, resuspend 3KP pellet i 200 μL av natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel ELEKTROFORESE (SDS-side) prøve buffer (tabell av materialer) og kok ved 95 ° c i 5 min.
- Snurr S2 -fraksjonen ved 20 000 x g i 20 min ved 4 ° c. Overfør den resulterende supernatanten (S3) til et friskt mikrosentrifugen rør. S3 er den cytoplasmatiske (cyto) brøk. For SDS-side, Kombiner 150 μL av cyto brøkdel med 50 μL av 4X SDS-side prøve buffer og kok ved 95 ° c i 5 min.
- Aspirer de resterende supernatanten fra 20 000 x g pellet (20KP) og vask to ganger med 1,5 ml kald HB. 20KP pellet kan oppbevares tørt ved-80 ° c Hvis nedstrøms Proteomikk er forventet. Hvis bare vestlig blotting er forventet, resuspend den 20KP pellet i 100-ΜL av SDS-side prøve buffer og kok ved 95 ° c i 5 min.
6. vestlig blotting avlesning
- For å kvantifisere macroautophagic og proteasomal Flux via vestlig blotting, komponere en lagerløsning av renset GST-LC3b (2 μg/mL), p62-hans6 (2 μg/ml), og lys48 knyttet Polyubiquitin (K48-UB, 50 μg/ml) i 1x SDS-side sample buffer. Etter koking ved 95 ° c i 5 min, alikvot og oppbevares ved-80 ° c for fremtidig bruk.
- På tidspunktet for SDS-PAGE, generere en 6-punkts standard kurve av standard protein blanding av serielt fortynning 1:3 i 1x SDS-side sample buffer. Last 10 μL av hver standard kurve prøve på en 26 brønn 4 − 12% SDS-side MIDI-gel, etterfulgt av prestained protein standarder (tabell av materialer), en kommersiell molekylvekt standard.
- For å måle autophagic Flux, Last 12 μL av 3KP prøve i hver brønn.
Merk: Forutsatt humbug, bortezomib, og leupeptin behandlinger ble gjort og antar 3 mus per behandling, hver gang punktet bør bestå av 9 prøver. Derfor, hver MIDI-gel kan romme 2 tid poeng pluss standard kurve og en typisk tidsserie eksperiment vil kreve 3 MIDI-gels for avlesning. - For å måle proteasomal Flux, Last 12 μL av cyto brøk i hver brønn.
- Skill protein prøver av SDS-PAGE og Overfør til Polyvinylidene fluor (PVDF) membraner ved hjelp av standardprotokoller. Hvis det forventes vestlig blotting for LC3b, overfører du gels ved hjelp av 20% metanol som inneholder overføringsbuffer. Ellers, bruk 10% metanol-inneholdende overføringsbuffer da dette vil muliggjøre mer effektiv overføring av høy molekylvekt protein arter.
- Utføre vestlige blotting ved hjelp av standardprotokoller. For å analysere macroautophagic Flux, blot membraner som inneholder 3KP prøver med anti-p62 eller anti-LC3b antistoffer (1:1000) over natten ved 4 ° c. For å analysere proteasomal Flux, blot membraner inneholder cyto prøver med anti-lys48 spesifikke polyubiquitin (1:1000) over natten ved 4 ° c.
- Bilde vestlig blots bruker standard sekundære antistoffer og bildeenheter. Image alle membraner som utgjør en gitt tidsserie eksperiment sammen.
7. data analyse
Merk: Se tilleggsfil "eksempel data".
- For å utføre densitometri på Western Blot prøver, Bruk standard grafikkprogramvare, bilde Studio, eller alternativt ImageJ.
- Utfør densitometric målinger på bånd av interesse for både standardkurven og de eksperimentelle prøvene. I image Studio, bruker p62 som et eksempel, tegne et langt rektangel som omfatter protein monomer på bunnen og strekker seg til toppen av membranen. Kopier, lim inn og Flytt rektangelet til de resterende prøvene. Det er viktig å holde rektangelet brukes for kvantifisering konsistent mellom prøvene.
- Lagre kvantifisering i et regneark ved å trykke på rapporter og starte regneark nederst til høyre i analyse vinduet.
- Generer en densitometric standard kurve med regneark ved hjelp av serielt fortynnet standard prøve og bruk enten lineær eller polynom regresjon for å oppnå en best mulig tilpasset standard kurve ligning. Ved hjelp av denne ligningen, ekstrapolere mengden av p62, LC3b-II eller lys48-Poly UB i den eksperimentelle prøvene.
- For å oppnå Flux målinger, subtrahere den ekstrapolert protein mengden av hvert inhibitor-behandlet utvalg fra den gjennomsnittlige verdien av PBS prøvene fra samme tidspunkt (se tilleggsfil "sample data").
- Evaluer den statistiske betydningen av timelig variasjon i protein omsetning ved hjelp av 1-veis ANOVA. Dette kan gjøres ved hjelp av standard regnearkprogram vare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative data er presentert i figur 2A, B, og kvantifisering av disse dataene er gitt i figur 2C, D (se også supplerende fil "sample data"). For enkelhets skyld har vi ikke avbildet lasting kontroller i figur 2 men disse bør fås parallelt. Vanligvis er vestlige blots mot β-utgangen brukes til dette formålet, men en total protein flekk (som Ponceau S) vil være nok. Den primære avlesning for autophagic Flux til enhver tidpunktet er forskjellen i mengden av macroautophagy spesifikke markører (p62 eller LC3b-II) mellom leupeptin-behandlet versus humbug prøver i lysosome beriket 3KP brøkdel av 2 (antall timer mellom injeksjon av protease inhibitor og vev innhøsting). Lignende data kan fås fra 20KP prøver, som også er lysosome beriket, men vår erfaring med mus lever er at det meste av signalet segregerer i 3KP brøk. Vanligvis er resultatene normalisert til gjennomsnittet som forenkler sammenligning på tvers av uavhengige eksperimenter (figur 2C, D). Den primære avlesning for proteasomal omsetning er forskjellen i mengden lys48-polyubiquitinated protein mellom bortezomib-behandlet versus humbug prøvene i cytosolic ("cyto") brøk delt på 2. Fordi p62 kan være et mål for både macroautophagy og proteasomet3, en alternativ markør for proteasomal Flux er endringen i p62-innhold +/-BORTEZOMIB i 3KP brøkdel (se eksempel data). Men vi finner denne markøren er mindre robust i forhold til lys48-polyubiquitinated protein og er best brukt som støttende data.
Figur 1: eksperiment trinn og prøve behandling. (A) skjematisk av en typisk tidsserie eksperiment for å måle daglige rytmer i autophagic og proteasomal aktivitet (Flux) i mus leveren. (B) fraksjonering ordning for å skaffe lysosome-beriket og cytosolic lever protein fraksjoner for Western Blot analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: prøve eksperimentelle resultater av forandring. Western blots fra en representativ tid serie eksperiment for å måle daglige rytmer i autophagic Flux (a), og proteasomal Flux (B) i mus leveren. Vær oppmerksom på at under leupeptin forhold går p62 som en stige som spenner fra monomere skjemaet til ca 50 kDa til SDS-stable komplekser på ca 250 kDa. Klokkeslett vises i zeitgeber tidsenheter (ZT), der ZT0 representerer lys og ZT12 representerer lys. Observasjons tider som faller under lysene av er farget svart. (C,D) Kvantifisering av disse dataene. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet ± SE (n = 3). Statistisk betydning via enveis ANOVA er avbildet. Vennligst se tilleggsfilen "sample data" for en tabell fremstilling av disse dataene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil: eksempel data. Laboratorieanalyse av densitometric data og påfølgende statistisk analyse. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår protokoll beskriver en teknisk grei måte å måle biologiske rytmer i protein omsetning i mus ved hjelp av allment tilgjengelig molekylærbiologi utstyr. På grunn av lengden på tidsserien eksperimenter og antall biologiske prøver involvert, er det viktig å være konsekvent på tvers av hele eksperimentet om hvordan musene injiseres, tidspunktet for vev oppkjøp og biokjemiske behandling av Prøver. Trinnene for injeksjon, døds aktiv og cervical forvridning kan kreve operatør praksis før et fullskala eksperiment starter. Det er en best for en enkelt betjene å utføre alle tissue dissections siden annerledes individer analysere for annerledes setter fart i, bortsett fra hvis denne er umulig den kanskje være som er bryet verdt å forhøye klokken imellom protease inhibitor injeksjon og tissue innhøsting fra 2 h å 3 eller 4 h ( forutsatt at dette gjøres konsekvent over tid poeng).
Vanlige årsaker til feilsøking omfatter variasjon i forandring mellom biologiske replikere prøver og dårlig Western Blot-kvalitet. Når det gjelder utvalgs variasjon, kan dette skyldes bruk av flere operatorer med ulik dissekere hastighet eller erfaringsnivå. Dette kan gjøres ved å utføre praksis eksperimenter til gjennomsnittlig dissekere ganger er mindre enn 5 min per mus. Alternativt kan en enkelt operatør brukes til å utføre dissections. Høy bakgrunn på vestlig blots kan oppstå fra ujevn overføring, utilstrekkelig blokkering, primær antistoff med lav kvalitet eller utilstrekkelige vasketrinn. Best resultater oppnås ved overnatting våt overføring av SDS-side separerte protein prøver til PVDF i 10 − 20% metanol som inneholder overføringsbuffer, med 10% ikke-fett tørr melk for blokkering, og omfattende vasking mellom trinn (3x 10 min minimum på en mekanisk rocker).
Denne teknikken har flere begrensninger. Først protokollen beskrevet krever betydelig antall dyr og er derfor ressurskrevende. Mens en minimal tid serie eksperiment spenner 24 h, eksperimenter av minst 2 sykluser er ideelle for å bekrefte at de daglige variantene som observeres i protein omsetning er reproduserbar, og for å estimere rytme egenskaper som periodisitet og fase12 . Fordi tiden må gå mellom når protease hemmere administreres til mus og tids prøvene høstes (for å tillate proteinolyse mål å akkumulere), representerer omløps målingene en gjennomsnittlig aktivitet over et intervall på 2 timer snarere enn et punktestimat. Som et resultat, det er en grense for oppløsningen denne analysen kan gi for å oppdage dynamiske endringer i protein katabolisme. Til slutt, denne protokollen er optimalisert for mus leveren og biokjemiske fraksjonering prosedyren som presenteres her ville trolig må endres for å effektivt få lysosomer fra andre typer vev.
Dette er den første metoden for å direkte måle daglige rytmer i autophagic Flux som også muliggjør proteom observasjoner av dette fenomenet. Fremtidige anvendelser av denne teknikken inkluderer analyse av proteolytiske rytmer i ulike sykdoms modeller, inkludert autoimmune sykdommer, kreft, og akutt infeksjon. I prinsippet kan denne metoden tilpasses andre mus organer og eksplanterte menneskelige prøver, som representerer en spennende fremtid program med høy translational potensial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av RO1HL135846 og en Children ' s Development Institute Grant (PD-II-2016-529).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W.
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L.
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P.
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
