Summary
Nous décrivons notre protocole pour mesurer des rythmes biologiques dans le catabolisme de protéine par l'autophagie et le protéasome dans le foie de souris.
Abstract
Les cellules utilisent plusieurs méthodes pour recycler les protéines indésirables et d'autres matériaux, y compris les voies lysosomal et non-lysosomal. La voie lysosome-dépendante principale est appelée autophagie, alors que la méthode non-lysosomale primaire pour le catabolisme de protéine est le système ubiquitine-protéasome. Des études récentes sur des organismes modèles suggèrent que l'activité de l'autophagie et du système ubiquitine-protéasome n'est pas constante tout au long de la journée, mais varie plutôt selon un rythme quotidien (circadien). La capacité de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines est importante pour comprendre comment le contrôle de la qualité cellulaire est atteint et pour comprendre la dynamique de protéines spécifiques d'intérêt. Ici nous présentons un protocole normalisé pour quantifier le flux autophagique et protéasomal in vivo qui capture la composante circadienne du chiffre d'affaires de protéine. Notre protocole inclut des détails pour la manipulation de souris, le traitement de tissu, la fractionnement, et la quantification automatique de flux utilisant le foie de souris comme matériel de commencement.
Introduction
Les rythmes circadiens se réfèrent à des variations quotidiennes et prévisibles de la fonction biologique qui sont apparentes dans toute la nature. Ils existent à toutes les échelles biologiques, des comportements macroscopiques comme les cycles veille-sommeil, aux phénomènes moléculaires comme l'abondance rythmique des biomolécules. Ces dernières années, la recherche sur les rythmes circadiens a été transformée par la découverte de « gènes de l'horloge » qui sont essentiels pour la génération de rythmes circadiens. Les études dans les souris knock-out de gène d'horloge ont indiqué un rôle central pour des rythmes circadiens en organisant temporellement des processus cellulaires de noyau tels que le métabolisme1. Parmi les façons dont les rythmes circadiens y arriver est de transmettre une structure temporelle au catabolisme protéique.
Plusieurs groupes, dont le nôtre, ont montré que les deux principales avenues pour le catabolisme des protéines cellulaires, l'autophagie et le système ubiquitine-protéasome, sont soumises à des rythmes diurnes2,3,4,5. L'autophagie représente le bras lysosome-dépendant du catabolisme protéique dans lequel les protéines d'intérêt sont livrées à cet organelle dégradante soit par la construction d'une vésicule nouvelle (macroautophagie) ou par translocation directe par un canal (autophagie médiée par chaperon)6. Le système ubiquitine-protéasome est la principale voie non-lysosomale, où les protéines sont poly-ubiquitinated et ensuite alimentés dans le protéasome, une machine de dégradation macromoléculaire trouvée dans tout le cytoplasme et le noyau7,8. Les rythmes dans l'activité autophagique et protéasomale sont importants parce qu'ils jouent probablement un rôle dans l'entretien ménager cellulaire. En conséquence, il est utile d'avoir une procédure standardisée qui peut détecter les oscillations quotidiennes dans le catabolisme protéique qui est compatible avec les modèles précliniques de maladie.
Ici, nous fournissons notre protocole pour quantifier les variations diurnes dans le flux autophégique dans le foie de souris, qui a servi de base pour le travail dans notre laboratoire3,9. Notre méthode est classée comme un « ruse »10, une approche utilisée par de nombreux groupes pour mesurer l'activité protéolytique (ou flux). Dans cette approche, des inhibiteurs de la protéase spécifiques aux lysosomes ou aux protéasomes sont administrés à des souris, puis des échantillons de tissus sont obtenus après un intervalle de temps fixe. En parallèle, des échantillons de tissus sont obtenus à partir de souris soumises à des injections fictives. Les échantillons de tissus sont homogénéisés, puis biochimiques séparés pour obtenir les fractions lysosome-enrichies et cytoplasmiques. Ces fractions sont ensuite analysées en parallèle par le biais de ballonnements occidentaux à l'aide d'anticorps spécifiques aux marqueurs macroautophanes (LC3b et p62) ou de substrats protéasomals (protéines poly-ubiquitinated). Au fil du temps, les animaux injectés avec des inhibiteurs de la protéase accumulent des protéines qui auraient normalement été recyclées. En conséquence, le taux de rotation est déduit en comparant l'abondance des protéines marqueurs dans les échantillons traités par protéase-inhibiteur aux échantillons traités par faux. En répétant cette méthode à intervalles fixes tout au long de la journée, il est possible de reconstituer les variations circadiennes de la protéolyse (Figure 1A).
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Protocol
Le protocole décrit ici a été approuvé par l'Université de Washington à St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Logement de souris et conception expérimentale
- Pour détecter les rythmes quotidiens dans le renouvellement des protéines, les souris domestiques (mâles ou femelles C57BL/6J, 4 à 8 semaines, 20 à 25 g) dans le cadre de cycles standard de lumière/obscurité de 12 h avec de la nourriture fournie ad libitum. Pour éviter de stresser les animaux, acclimater les souris pendant au moins une semaine dans l'établissement avant d'utiliser et éviter le logement unique. Pour prouver que les rythmes dans le catabolisme protéique sont vraiment circadiens (c.-à-d., entraînés par l'horloge biologique interne de l'animal), les souris de maison dans des conditions sombres constantes, en prenant soin d'éviter d'exposer les souris à la lumière exogène.
REMARQUE: Pour plus de détails sur le logement de la souris pour les expériences de rythme circadien voir la référence suivante11. - Pour chaque point de temps, allouer trois souris comme contrôles fictifs et au moins trois souris pour chaque type d'inhibiteur de la protéase utilisé (leupeptin pour le flux autophagique et bortezomib pour les mesures de flux protéasomal). Planifiez six points de temps uniformément espacés à intervalles de 4 h tout au long du cycle jour/nuit pour obtenir des échantillons de tissus.
REMARQUE: Une expérience de 24 h, 6 points de temps avec la saline tamponnée de phosphate (PBS), la leupeptin, et le bortezomib exigera un total de 54 souris (3 par traitement x 3 traitements x 6 points de temps).
2. Préparation de la solution d'homogénéisation, des solutions de stock d'inhibiteur, et des vials pour la collection de foie de souris
- Préparer un tampon d'homogénéisation frais (HB) et garder sur la glace : 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM de saccharose, 5 mM EDTA pH 8,0 et 1 comprimé inhibiteur de la protéase par 100 ml.
REMARQUE: Environ 10 ml de HB sont nécessaires par souris. - Pour le traitement en aval d'échantillons biologiques, chaque échantillon nécessite un tube conique de 15 ml pour contenir l'homogénéisation brute, un tube de 15 ml pour contenir le supernatant post-nucléaire, deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml pour contenir les 3 000 x g et 20 000 x g granulés matériau, respectivement, et un tube de microcentrifuge de 1,5 ml pour tenir la fraction cytoplasmique. Ajouter 7 ml de HB froid à chaque tube destiné à l'homogénéisation brute et conserver sur la glace.
- Préparer une solution de stock de 2 mg/mL de leupeptin hemi-sulfate dans le PBS stérile. Préparez également une solution de 50 mg/mL de bortezomib dans du sulfoxide de diméthyle (DMSO). Aliquot et stocker les solutions à -80 oC.
3. Administration d'inhibiteur de protéase
- Décongeler les solutions de leupeptin (2 mg/ml) et de bortezomib (50 mg/ml) à température ambiante 15 min avant chaque point de temps. Le stock de leupeptin est prêt pour l'injection. Diluer le bortezomib dans un PBS stérile pour obtenir une solution de travail de 50 g/mL.
REMARQUE: Bortezomib est sensible à la lumière, afin de protéger le stock de travail de la lumière jusqu'à l'utilisation. - Peser les souris et effectuer des injections intrapéritones de PBS « fictif » (0,5 ml), de leupeptin (40 mg/kg) ou de bortezomib (1,6 g/kg). Retournez les souris dans des cages bien marquées regroupées par le type d'injection qu'elles ont reçue. Enregistrez l'heure à laquelle les souris sont traitées ou manipulées dans un tableau standardisé (voir Fichier supplémentaire « Donnéesd'échantillons»).
REMARQUE: Un calculateur de dose est inclus comme une aide dans le fichier supplémentaire "Données d'échantillon". Il est important d'effectuer des injections rapidement et dans le même ordre de temps en temps pour minimiser la variabilité.
4. Acquisition et stockage de tissus
- Deux heures après l'injection, euthanasiez les souris une à la fois conformément au protocole approuvé par l'AIIACUC. Par exemple, anesthésier les souris puis euthanasier par luxation cervicale. Passez à l'étape de dissection immédiatement après l'euthanasie.
REMARQUE: Assurer une anesthésie complète avant la luxation cervicale en pinçant les pattes avant sans réflexe observable. - Enlever le lobe gauche du foie en faisant une incision de 1,5 à 2,0 cm avec des ciseaux Metzenbaum sur l'abdomen ventral de la souris. Extérisez le lobe gauche du foie et expirez-le avec des ciseaux chirurgicaux. Immerger l'échantillon de foie dans 7 ml de HB glacé dans un tube conique de 15 ml correctement étiqueté. Garder l'échantillon sur la glace tout au long du traitement.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés sur la glace ou à 4 oC pendant la nuit avant de procéder. Si les marqueurs standard de la macroautophagie et de l'activité protéasomal sont les seuls résiliations prévus, les échantillons de foie peuvent être congelés flash dans de l'azote liquide et stockés à -80 oC pour un traitement ultérieur. Pour examiner d'autres cibles de dégradation (p. ex., par protéomique), traiter les échantillons sans congélation. - Procéder à l'euthanasie et disséquer la souris suivante jusqu'à ce que tous les échantillons sont acquis. Traiter les souris dans le même ordre de groupe qu'elles ont été injectées et enregistrer la durée de cette étape (voir Fichier supplémentaire "Données d'échantillon"). Chaque souris doit être traitée en moins de 5 min pour limiter la différence dans les temps d'exposition pour les inhibiteurs injectés.
5. Fractionnement biochimique des échantillons de foie
REMARQUE: La figure 1B montre le schéma de fractionnement.
- Transférer chaque échantillon de foie et 7 ml de HB dans un homogénéisateur Dounce de 15 ml. Homogénéiser l'échantillon avec 10 coups de piston lâche et 15 coups de piston serré. Retournez l'homogénéat brut résultant au tube conique de 15 ml dont il provient. Répétez l'opération jusqu'à ce que tous les échantillons de foie aient été homogénéisés.
- Faire tourner les échantillons d'homogénéisme brut à 700 x g pendant 10 min à 4 oC pour granuler les noyaux et les débris. Transférer le top 4 ml de supernatant post-nucléaire (S1) dans un tube conique frais de 15 ml.
- Déterminer la concentration en protéines de la fraction S1 à l'aide de Bradford ou d'acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant. Ensuite, égalisez les concentrations de tous les échantillons à 2,1 mg/mL ou à la concentration désirée en ajoutant du HB frais à S1 si nécessaire. Les échantillons normalisés sont la fraction « Protéines totales » (Tot). Pour des raisons d'analyse en aval et d'amélioration de la qualité, aliquot 500 'L de la fraction Tot et stocker à -80 oC.
- Transférer 1,5 ml de la fraction tot restante dans un tube de microcentrifuge et tourner à 3 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer 1 ml du supernatant résultant (S2) dans un tube de microcentrifuge frais et mis sur la glace.
- Aspirez le reste du supernatant et lavez le 3 000 x g de granule (3KP) deux fois avec 1,5 ml de HB froid. Le granule 3KP peut être stocké à sec à -80 oC si l'on s'attend à une protéomique en aval. Si l'on ne prévoit que des ballonnements occidentaux, suspendez la pastille 3KP dans 200 L de polyacrylamidede sulfate de sodium polyacrylamide gel électrophoresis (SDS-PAGE) et faites bouillir à 95 oC pendant 5 min.
- Faire tourner la fraction S2 à 20 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Transférer le supernatant résultant (S3) dans un tube microcentrifuge frais. S3 est la fraction cytoplasmique (Cyto). Pour sDS-PAGE, combiner 150 oL de fraction cyto avec 50 oL de tampon d'échantillon SDS-PAGE 4x et faire bouillir à 95 oC pendant 5 min.
- Aspirez le reste du supernatant de la 20 000 x g de granule (20KP) et lavez deux fois avec 1,5 ml de HB froid. Le granule de 20KP peut être stocké à sec à -80 oC si l'on s'attend à une protéomique en aval. Si l'on ne prévoit que des ballonnements occidentaux, suspendez la pastille de 20 KP dans 100 l de tampon d'échantillon SDS-PAGE et faites bouillir à 95 oC pendant 5 min.
6. Western Blotting Readout
- Afin de quantifier le flux macroautophagique et protéasomal par le biais du ballonnement occidental, composez une solution de stock de gst-LC3b purifié (2 g/mL), p62-His6 (2 g/mL), et Lys48 polyubiquitin lié (K48-Ub, 50 g/mL) dans 1 x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Après ébullition à 95 oC pendant 5 min, aliquot et conserver à -80 oC pour une utilisation future.
- Au moment de SDS-PAGE, générer une courbe standard de 6 points du mélange de protéines standard en diluant en série 1:3 dans 1x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Chargez 10 L de chaque échantillon de courbe standard sur un puits de 26 puits 4 à 12 % SDS-PAGE midi-gel, suivi de normes de protéines présagées (Tableau des matériaux), une norme de poids moléculaire commercial.
- Pour mesurer le flux autophagique, chargez 12 'L d'échantillon 3KP dans chaque puits.
REMARQUE: En supposant que des traitements fictifs, de bortezomib et de leupeptin ont été faits et en supposant que 3 souris par traitement, chaque point de temps devrait se composer de 9 échantillons. Par conséquent, chaque midi-gel peut accueillir 2 points de temps plus la courbe standard et une expérience de série de temps typique nécessitera 3 midi-gels pour la lecture. - Pour mesurer le flux protéasomal, chargez 12 'L de fraction cyto dans chaque puits.
- Séparer les échantillons de protéines par SDS-PAGE et le transférer aux membranes de fluorure de polyvinylide (PVDF) en utilisant des protocoles standard. Si l'on s'attend à des ballonnements occidentaux pour le LC3b, transférez les gels à l'aide d'un tampon de transfert contenant 20 % de méthanol. Dans le cas contraire, utilisez un tampon de transfert contenant 10 % de méthanol, car cela permettra un transfert plus efficace des espèces protéiques de poids moléculaire élevé.
- Effectuer des ballonnements occidentaux à l'aide de protocoles standard. Pour l'analyse du flux macroautophégique, les membranes de tache contenant des échantillons 3KP avec des anticorps anti-p62 ou anti-LC3b (1:1,000) pendant la nuit à 4 oC. Pour l'analyse du flux protéasomal, les membranes de tache contenant des échantillons de Cyto avec la polyubiquitine spécifique d'anti-Lys48 (1:1,000) pendant la nuit à 4 oC.
- Image western blots à l'aide d'anticorps secondaires standard et des dispositifs d'imagerie. Imagetoutes de toutes les membranes qui constituent une expérience de série chronologique donnée ensemble.
7. Analyse des données
REMARQUE: Voir Fichier supplémentaire "Données d'échantillon".
- Pour effectuer la densitométrie sur des échantillons de taches occidentales, utilisez un logiciel graphiquestandard, Image Studio, ou bien ImageJ.
- Effectuer des mesures densitométriques sur des bandes d'intérêt pour la courbe standard et les échantillons expérimentaux. Dans Image Studio, en utilisant p62 comme exemple, dessinez un long rectangle englobant le monomère de protéines au fond et s'étendant jusqu'au sommet de la membrane. Copier, coller et déplacer le rectangle vers les échantillons restants. Il est important de garder le rectangle utilisé pour la quantification compatible entre les échantillons.
- Enregistrez la quantification dans une feuille de calcul en appuyant sur la feuille de calcul et de lancement en bas à droite de la fenêtre d'analyse.
- Générer une courbe standard densitométrique avec feuille de calcul à l'aide de l'échantillon standard dilué en série et utiliser une régression linéaire ou polynomiale pour obtenir une équation de courbe standard la plus adaptée. À l'aide de cette équation, extrapolez la quantité de p62, LC3b-II ou Lys48-poly Ub dans les échantillons expérimentaux.
- Pour obtenir des mesures de flux, soustrayez la quantité de protéines extrapolées de chaque échantillon traité par inhibiteur de la valeur moyenne des échantillons de PBS à partir du même point de temps (voir Fichier supplémentaire « Données d'échantillons »).
- Évaluer la signification statistique de la variation temporelle du renouvellement des protéines à l'aide d'ANOVA à sens unique. Cela peut être fait à l'aide d'un logiciel de tableur standard.
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Representative Results
Les données représentatives sont présentées à la figure 2A,B, et la quantification de ces données est fournie à la figure 2C,D (voir aussi Le fichier supplémentaire « Données d'échantillon »). Par souci de simplicité, nous n'avons pas représenté les commandes de chargement à la figure 2, mais celles-ci doivent être obtenues en parallèle. Typiquement, les taches occidentales contre l'actine sont utilisées à cette fin, mais une tache totale de protéine (telle que Ponceau S) suffira. La lecture primaire pour le flux autophagique à un point de temps donné est la différence dans la quantité de marqueurs spécifiques à la macroautophagie (p62 ou LC3b-II) entre les échantillons de leupeptin-traitement contre faux dans la fraction 3KP enrichie lysosome divisé par 2 (le nombre de heures entre l'injection d'inhibiteur de la protéase et la récolte des tissus). Des données similaires peuvent être obtenues à partir d'échantillons 20KP, qui sont également lysosome enrichi, mais notre expérience dans le foie de souris est que la plupart des ségrégations de signal dans la fraction 3KP. En règle générale, les résultats sont normalisés à la moyenne qui simplifie la comparaison entre les expériences indépendantes (Figure 2C,D). La lecture primaire pour le chiffre d'affaires protéasomal est la différence dans la quantité de Lys48-polyubiquitinated protéine entre le bortezomib-traité contre des échantillons faux dans la fraction cytosolique («Cyto») divisée par 2. Parce que p62 peut être une cible à la fois de la macroautophagie et le protéasome3, un marqueur alternatif pour le flux protéasomal est le changement de contenu p62 - / bortezomib dans la fraction 3KP (voir Données d'échantillon). Cependant, nous constatons que ce marqueur est moins robuste par rapport à Lys48-protéine polyubiquitinated et est mieux utilisé comme données de soutien.
Figure 1 : Étapes d'expérience et traitement de l'échantillon. (A) Schématique d'une expérience typique de série de temps pour mesurer des rythmes quotidiens dans l'activité autophagique et proérasomale (flux) dans le foie de souris. (B) Schéma de fractionnement pour l'obtention de fractions de protéines hépatiques enrichies de lysosome et cytosoliques pour l'analyse de la tache occidentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exempledez les résultats expérimentaux du flux. Taches occidentales d'une expérience représentative de série de temps pour mesurer des rythmes quotidiens dans le flux autophagique (A), et le flux protéasomal (B) dans le foie de souris. Notez que dans des conditions traitées à la leupeptine, p62 fonctionne comme échelle allant de la forme monomérique à environ 50 kDa aux complexes Stables SDS à environ 250 kDa. Les heures de la journée sont représentées dans des unités de zeitgeber time (ZT), où ZT0 représente les lumières allumées et ZT12 représente les lumières éteintes. Les temps d'observation qui tombent pendant les lumières éteintes sont ombragés en noir. (C,D) Quantification de ces données. Chaque point de données représente la moyenne de SE (n '3). L'importance statistique par l'intermédiaire d'ANOVA à sens unique est représentée. Veuillez consulter le fichier supplémentaire «Données d'échantillon» pour une représentation tabulaire de ces données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichier supplémentaire : Exemples de données. Analyse en laboratoire des données densitométriques et analyse statistique ultérieure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Notre protocole décrit un moyen techniquement simple de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines chez les souris à l'aide d'équipements de biologie moléculaire couramment disponibles. En raison de la durée des expériences de la série chronologique et du nombre d'échantillons biologiques impliqués, il est important d'être cohérent dans l'ensemble de l'expérience en ce qui concerne la façon dont les souris sont injectées, le moment de l'acquisition des tissus et le traitement biochimique de Échantillons. Les étapes d'injection, d'euthanasie et de dislocation cervicale peuvent nécessiter une pratique de l'opérateur avant de lancer une expérience à grande échelle. Il est préférable pour un seul opérateur d'effectuer toutes les dissections tissulaires puisque différents individus disséquent à des vitesses différentes, mais si cela est infaisable, il peut être utile d'augmenter le temps entre l'injection d'inhibiteur de la protéase et la récolte de tissus de 2 h à 3 ou 4 h ( à condition que cela se fasse uniformément à travers les points de temps).
Les raisons courantes du dépannage comprennent la variabilité du flux entre les échantillons de reproduits biologiques et la mauvaise qualité de la tache occidentale. En ce qui concerne la variabilité de l'échantillon, cela peut être dû à l'utilisation de plusieurs opérateurs avec des vitesses de dissection différentes ou des niveaux d'expérience. Cela peut être atténué par l'exécution d'expériences de pratique jusqu'à ce que les temps moyens de dissection soient inférieurs à 5 min par souris. Alternativement, un seul opérateur peut être utilisé pour effectuer des dissections. Le fond élevé sur les taches occidentales peut résulter du transfert inégal, du blocage inadéquat, de l'anticorps primaire de qualité basse, ou des étapes inadéquates de lavage. Les meilleurs résultats sont obtenus par le transfert de protéines séparées SDS-PAGE pendant la nuit à PVDF dans un méthanol contenant 10 à 20 % contenant un tampon de transfert, en utilisant 10 % de lait sec non gras pour bloquer, et un lavage intensif entre les étapes (3x 10 min minimum sur une bascule mécanique).
Cette technique a plusieurs limites. Premièrement, le protocole décrit exige un nombre important d'animaux et est donc à forte intensité de ressources. Alors qu'une expérience de série chronologique minimale s'étend sur 24 h, les expériences d'au moins 2 cycles sont idéales pour confirmer que les variations quotidiennes observées dans le renouvellement des protéines sont reproductibles, et pour estimer les caractéristiques du rythme comme la périodicité et la phase12 . Étant donné que le temps doit s'écouler entre le moment où les inhibiteurs de la protéase sont administrés aux souris et le temps de récolte des échantillons (pour permettre aux cibles de protéolyse de s'accumuler), les mesures de chiffre d'affaires obtenues représentent une activité moyenne sur un intervalle de 2 h. plutôt qu'une estimation ponctuelle. En conséquence, il ya une limite à la résolution de cet analyse peut fournir pour détecter les changements dynamiques dans le catabolisme des protéines. Enfin, ce protocole est optimisé pour le foie de souris et la procédure de fractionnement biochimique présentée ici aurait probablement besoin d'être modifiée pour obtenir efficacement des lysosomes d'autres types de tissus.
C'est la première méthode pour mesurer directement les rythmes quotidiens dans le flux autophagique qui permet également des observations protéome-large de ce phénomène. Les applications futures de cette technique incluent l'analyse des rythmes protéolytiques dans divers modèles de maladie, y compris la maladie autoimmune, le cancer, et l'infection aigue. En principe, cette méthode peut être adaptée à d'autres organes de souris et à des échantillons humains explantés, ce qui représente une application future passionnante avec un potentiel de traduction élevé.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par RO1HL135846 et une subvention de l'Institut de développement de l'enfance (PD-II-2016-529).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
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