Summary
我々は、2つの胸上皮線HC11およびEpH4の分化誘導のための技術を記述する。どちらも乳タンパク質を産生するために胎児の子牛血清、インスリン、プロラクチンを必要としますが、EpH4細胞は3次元培養でマンモスフィアに完全に分化することができます。これらの相補モデルは、分化および新生物のシグナル伝達研究に有用である。
Abstract
カドヘリンは、細胞分化および腫瘍の調節において重要な役割を果たす。ここでは、2つのマウス胸上皮細胞株HC11とEpH4の分化誘導の起源と方法、および乳腺の発達と腫瘍性形質転換の相補的段階を研究するためのその使用について説明する。
HC11マウスの乳房上皮細胞系は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺に由来する。これは、胎児の子牛血清およびHイドロコルチゾン、InsulinおよびPロラクチン(HIP培地)を含む培地中のプラスチックペトリ皿表面に結合するように成長した場合に分化する。これらの条件下で、HC11細胞は乳タンパク質βカゼインおよび乳清酸性タンパク質(WAP)を産生し、乳腺上皮細胞の授乳と同様に、初歩的な乳腺様構造を形成し、「ドーム」と呼ばれます。
EpH4細胞株は、妊娠中のバルブ/cマウスから単離された自発的に不死化したマウス乳腺上皮細胞に由来した。HC11とは異なり、EPH4細胞はHIP培地で3次元(3D)増殖条件下で培養すると、スフェロイド(マンモスフィアとも呼ばれる)に完全に分化することができます。細胞はトリプシン化され、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫細胞によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる20%マトリックスで懸濁し、プラスチックペトリ皿またはマルチウェルプレートをコーティングする濃縮マトリックスの層の上にメッキし、10%マトリックス含有HIP培地の層で覆われる。これらの条件下で、EpH4細胞は、尖面基底極性、中空ルーメンを示し、βカゼインおよびWAPを産生する中空回転楕円体を形成する。
これらの技術を用いて、我々の結果は、カドヘリン/Racシグナルの強度がHC11細胞の分化に重要であることを実証した。Rac1は分化に必要であり、活性化されたRacV12の低レベルは分化を増加させるが、高いRacV12レベルは新生物を誘導しながら分化をブロックする。対照的に、EpH4細胞は乳腺上皮分化における初期段階を表し、これは低レベルのRacV12によっても阻害される。
Introduction
正常な組織や腫瘍では、細胞は3次元組織で隣人との接着の広範な機会を有し、これは高密度細胞増殖によって培養中に模倣される。細胞間接着は、主にカドヘリン受容体を介して媒介され、細胞および組織の構造を定義する。興味深いことに、カドヘリンは、特に生存シグナル伝達1において、シグナル伝達においても強力な役割を果たしていることを最近実証した。逆説的に、カドヘリンから発せられるこれらの細胞間接着シグナルの一部は、最近、分化と新生物2の両方によって共有されることがわかった。ここでは、マウス胸上皮細胞株の2つの代表的なタイプHC11およびEpH4における分化誘導および評価の方法を記載する。
HC11マウスの胸上皮細胞株は、上皮細胞分化の研究に有用なモデルを提供することができる。HC11細胞は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺由来のCOMMA-1D由来細胞株である3。他のCOMMA−1D誘導体クローンとは対照的に、HC11クローンは、発泡性ホルモン3による内因性β-カゼイン遺伝子のインビトロ誘導のために他の細胞型と外因性付加された細胞外マトリックスまたは共培養のための要件を有さない。この細胞株は、正常乳上皮の重要な特徴を保持しているため分化試験で広く使用されている:HC11細胞は、乳腺脂肪パッド4をクリアして、そのダクト上皮を部分的に再構成することができる。また、Hイドロコルチゾンやデキサメタゾンなどのステロイドの存在下でプラスチックペトリ皿表面に結合して成長した場合に2次元(2D)培養で分化することができ、さらに、表皮成長因子(EGF)を欠く上皮成長因子(EGF)に加えて、5、6、7の異化阻害薬である。これらの条件下では、HC11細胞はβカゼインやWAPなどの乳タンパク質を産生し、これは誘導後4日以内にウェスタンブロッティングによって検出可能である。同時に、HC11細胞の一部は、ストカスティックな方法で「ドーム」と呼ばれている初歩的な乳腺様構造を形成する。ドームは、誘導後4〜5日目に見え、徐々に10日目までサイズが増加し、βカゼイン産生の増加に伴って8.興味深いことに、HC11細胞は変異型p539を有し、したがって前生性状態を表す。このため、HC11モデルは、同じ細胞系の新生物と組み合わせて分化のシグナリングネットワークを研究するのに理想的です。
EPH4細胞は、IM−2細胞の誘導体であり、元来、妊娠中のバルブ/cマウス10から単離された自発的に不死化マウス乳腺上皮細胞に由来する非腫瘍性細胞株である。EpH4細胞は2D培養で連続上皮単層を形成するが、腺様構造10,11に分化しない。しかし、EHSマウス肉腫細胞12によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる材料での3D増殖に続いて(EHSマトリックス、マトリックス、またはマトリゲル、材料の表を参照)、HIPによる刺激に加えて、EpH4細胞は乳腺分化の初期段階を再現することができる。これらの条件下では、EpH4細胞は、吸盤基底極性および中空腔を示す回転楕円体(マンモスフィアとも呼ばれる)を形成し、乳タンパク質β-カゼインおよびWAPを産生し得る。未分化化しているHC11細胞とは対照的に、幾つかは間葉マーカー13を発現するが、EpH4細胞は純粋に発光形態14を示す。EpH4細胞はまた、デキサメタゾン、インスリン、およびプロラクチン15による刺激を通じて2D培養で乳タンパク質を産生することが報告されている。しかし、このアプローチは、3D培養における乳腺微小環境を模倣する調節効果の研究を妨げる。
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Protocol
1. HC11細胞のめっき
- 無菌技術を用いた層流フードでは、HC11細胞培地の50mLのボトルを準備します:10%のウシ胎児血清(FBS)、5 μg/mLインスリン、および10 ng/mL EGFを備えたRPMI-1640(材料表参照)。
- プレート 3 cm ペトリ皿あたり約 400,000 セル: HC11 培地で 20 3 cm の皿に 2 つの 10 cm、50% コンフルエントペトリ皿を渡します。細胞はよく広がらなければならないが、乾燥は避けなければならない。
- 真空ポンプを使用してフラスコに培地を吸引します。
- 10 cmプレートあたり250μLのトリプシン(材料表を参照)を加えます。トリプシンを広げ、取り付けられた細胞を取り除くために水平に保ちながら、プレートを横から回転させ、打つ
- 位相コントラスト顕微鏡下で4倍の目的を観察し、ピペット処理の前に細胞がエッジから切り離し始めたことを確認します。
- 滅菌、9インチパスツールピペットにHC11培地の約1.5 mLを吸引し、細胞に対して垂直に噴出します。すべての細胞を取り除くために潮吹きしながらペトリ皿を回転させます。細胞の乾燥を避けるために、速く働かなければなりません。
- HC11培地と渦巻きでボトルにすべての細胞を移します。
- ピペット2 mLの細胞懸濁液を各3cmペトリ皿に入れます。ペトリ料理を横に揺らし、均等に広げます。細胞を37°C、5%CO2インキュベーターに入れる。
- 翌日、または細胞が〜90〜100%コンフルエントである場合、培地を吸引し、培地をFBSおよびインスリンと培地に置換するが、EGFを欠いている。
2. HC11細胞の分化誘導・モニタリング・定量
- 24時間のEGFを欠いている培地で細胞を成長させた後、分化培地(HIP培地)を10個の3cmプレートに加えます:10%FBSを添加したRPMI-1640、1μg/mL Hイドロコルチゾン(材料表を参照)、5 μg/mL P rolactin(材料の表を参照)。
- 他の10個の3cmプレートをコントロールとして保管する:10%FBSと5 μg/mLインスリンがEGFおよびHIPを欠いている媒体に変更します。
- HIP 処理セルとコントロールの両方に 2 ~ 3 日ごとにメディアを変更します。細胞が剥離しないように慎重に培地をピペット。
- 分化(すなわち、「ドーム」の形成)を監視するために、位相コントラスト顕微鏡下の細胞を観察する(図1A、左パネル)。細胞が緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現している場合、蛍光顕微鏡(励起= 485/20;放出= 530/25;倍率240倍;20倍の目的)で観察する(図1A、右パネル)。
- 分化の程度を定量するには、HIP処理細胞およびコントロールの各々のペトリ皿からタンパク質を抽出し、1日1回、βカゼイン用のプローブウェスタンブロット(材料表を参照)(図1B)。
- 1.8 mlのプラスチック遠心分離管に1.5 mL氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を削ります。
- 350 x g、1分、4 °C で細胞をペレットします。
- 氷冷PBSでペレット2xを素早く洗います。残留物を排水します。
- リシスバッファーを作る:50 mM HEPES (pH = 7.4)、150 mM NaCl、 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF), 10 μg/mL アプロチニン, 10 μg/mL レプテプチン16.3cmペトリ皿あたり100μLを加えます。
- 寒さの中で10分の10,000×gで遠心分離によってライセートを明確にします。
- タンパク質濃度を決定し(材料表を参照)、各サンプルから10%ポリアクリルアミド-SDSゲルに10~20μgのタンパク質をロードします。
- 45 Vで15時間、~2~2.5hの場合は100 Vの電気phorese。
- 電気ブロッティング転写装置を用いてニトロセルロースまたはPVDF膜に転写する(材料表参照)。
- トリス緩衝生理液中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%Tween-20(TBST)でブロックします。
- 一次抗体を加えて、ヤギの抗βカゼイン希釈1:2,000またはマウス抗βアクチン希釈1:1,000(材料表参照)。
- TBSTで3倍、毎回5分洗います。
- 二次抗体を加えて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ロバ抗ヤギ1:2,500、またはHRPリンク馬抗マウス抗体を1:10,000希釈した。
- TBSTで3倍、毎回5分洗います。
- メーカーの指示に従って膜にECL試薬を追加します(材料表を参照)。
3. EHSマトリックスにおけるEpH4細胞のめっきと3D成長
注: マトリックスは温度 <10 °C で液体で、上記の温度では固体です。80 °Cで保管してください。使用前の夜に4°Cで解凍します。取り扱い前に-20°Cで組織培養プレートとピペットチップを前冷させ、マトリックス、プレート、ピペットチップを氷の上に置いて固化を防ぎます。
- 10% FBS および 5 μg/mL インスリンを用いて、RPMI-1640 培地で EpH4 細胞を 2D で成長させます (EGF は必要ありません)。
- 10%(v/v,3,500 μL)または20%(v/v 2,000 μL)のマトリックスを2つの50 mL円錐形チューブに添加したEpH4成長培地を調製します。使用する準備ができるまで氷の上に保管してください。
- 150 μLの未希釈マトリックスを備えた24ウェルプレートの10ウェル(各1cm2)をコートします。ピペットチップを使用してマトリックスを広げます。泡を作成しないでください。プレートを水平に保持したまま、プレートの側面を軽くタップして、マトリックスがウェルの底面に均等に分布していることを確認します。
- 24ウェルプレートを37°Cで1時間インキュベートし、マトリックスが固化できるようにします。
- HC11細胞について上記のようにEpH4細胞をトリプシン化し、それらをヘモサイトメーターでカウントする。ウェルあたり5 x 104細胞を1.5 mLの無菌円錐形遠心チューブに移し、250 x gで5分間スピンします。
- 慎重に媒体を吸引し、氷の上にチューブを置きます。
- 氷上の円錐管を維持しながら、1 mLピペットチップを使用して20%マトリックスを添加したEpH4成長培地の350μLで細胞を再懸濁します。泡を避けてください。単一細胞懸濁液を確保することが重要である。
- 底層マトリックスが固まったら(マトリックスはウェルの初期コーティングと比較して半透明で明るい色に見える)、各コーティングされた井戸に350μLの細胞懸濁液を加え、20%マトリックス層が固化できるように37°CのCO2インキュベーターに〜1時間置きます。
- 4xの目的と位相コントラストの下で細胞を微小観察する。単一のセルが表示されている必要があります。
- 20%マトリックスに懸濁した350μLの細胞の上に10%マトリックスを含む200μLのEpH4培地を加える。37 °Cでインキュベート。
4. 3Dで増殖したEpH4細胞の分化誘導 (図2)
注:分化に加えて、EpH4細胞は、3D培養でHGF(肝細胞増殖因子)で刺激された場合、尿細管形成を受けることもできます。管外増殖はHIPおよびHGF刺激の10日後に見ることができる。
- マトリックス内でめっき後1日目にEpH4細胞の分化誘導を開始する。プラスチックピペットチップを使用して、10%マトリックスを含む150μLの上部培地をウェルから慎重に取り除きます。HIPと10%マトリックスを含むEpH4培地を200μL追加します。
- 最大 10 日間、2 日ごとに 10% マトリックス HIP 培地を交換してください。HIPを使用せずに、同じ10%マトリックス培地でコントロールセルを成長させます。
- 位相コントラストの下でマモスフィアの形成を監視します(図3A、下部パネル)。
5. 3Dで増殖したEpH4細胞の卵管形成誘導 (図3Aおよび3C)
- ステップ 3.1 ~3.9 で詳しく説明されているように、24 個のウェルプレートと EpH4 細胞をマトリックスで成長させる準備をします。マトリックス内の細胞をめっきした翌日、プラスチックピペットチップを用いて10%マトリックスを含むEpH4培地の150μLをウェルから除去する。10% マトリックス、HIP、および 20 ng/mL HGF を含む EpH4 培地を 200 μL 追加します (材料表を参照)。
- 10% マトリックス/HIP/HGF 培地を 2 日ごとに 12 ~14 日まで交換します。
- 20x または 40x の目的を使用して細管の形成を顕微鏡的に監視します (図 3A、 右パネル)。
6. 分化の定量:β-カゼイン用ウェスタンブロッティング
- 井戸から10%マトリックスHIP培地を慎重にピペットオフ。20%マトリックス層2xを350μLの氷冷PBSでリンスします。回転楕円体は、マトリックス層に存在している必要があります。
- 1 mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を備えた700~1,000μLの氷冷PBSを直接ウェルに加えます。ピペットチップでウェルから100%マトリックスの底層を静かに取り外し、その層に存在する回転楕円体を回収します。4°Cで30分間やさしく振ります。
- 回転楕円管の懸濁液を円錐形の管に注意深く移します。500 μLのPBS-EDTAでウェルをリンスし、ウェル内の残りの回転楕円体を回収し、円錐形のチューブに加えます。
- さらに30分間氷上でロックします。マトリックスが完全に溶解していることを確認してください。可視マトリックスの束が見られる場合は、PBS-EDTA を追加するか、長く振ります。
- 350 x gで 5 分間回転楕円体をペレットにする溶液を遠心分離します。
- 上清を吸引し、氷冷リシス緩衝液中のスフェロイドをリスピー化し、および16以上のステップ2.5のようにウェスタンブロッティングによりβカゼイン、サイクリンD1、およびp120RasGAP用プローブを用いる。一次抗体として、ヤギの抗β-カゼイン希釈1:2,000、ウサギ抗サイクリンD1希釈1:2,000、マウス抗p120希釈1:2,000を使用してください。二次抗体の場合は、HRPリンクロバ抗ヤギ希釈1:2,500、HRPリンクロバ抗ウサギ希釈1:2,500、HRPリンク馬抗マウス希釈1:10,000を使用してください。
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Representative Results
上皮細胞とアディポサイトの分化にはカドヘリン2の合流と関与が必要とすることが長い間知られている。我々および他の人々は、E-またはN-カドヘリンおよびカドヘリン-11の細胞間接着および関与を実証した。 培養細胞の合流と同様に、小さなGTPases Racおよび細胞分裂制御タンパク質42(Cdc42)の活性の劇的な増加を引き起こし、このプロセスはインターロイキン6(IL6)ファミリーサイトカインとStat3(転写-316、17)1の活性化をもたらす。カドヘリン/Rac/IL6/Stat3経路の多くの成分は、分化と腫瘍性の両方の形質転換に関与する可能性があるため、これら2つの正反対プロセスの相互関係の研究のための分子ハンドルを提供する。
上記の技術を用いて、HC11細胞におけるRacシグナルの強さに対する分化の顕著な依存性を実証した:分化には内因性cRac1が必要であり、変異活性型RacV12は分化能力の明確な増加を引き起こし、高いRacV12レベルは新形成を誘発しながら劇的な分化ブロックを引き起こす。これに対して、RacV12発現の低レベルでさえ、EpH4細胞2で分化をブロックした。さらに、RacV12は、HC1116を含む多くの細胞系においてStat3を活性化するが、変異活性化Stat3Cは、腫瘍性形質転換20を誘導しながら分化を遮断した。
さらに、3Dマトリクス培養におけるEpH4細胞の分化特性について検討した。βカゼインの生産は8~10日でピークに達したのに対し、CYclin D-1発現はHIP刺激後4~6日目に最大であった(図3B)。これらの知見は、EpH4モデルにおける増殖と分化の間の逆の関係を支持する。DAPI(核)染色法と共焦点顕微鏡法を用いて個々の上皮細胞の位置を決定し、マンモスフィアにおける内部細胞死と中空ルーメンの形成を観察した(図3A、C)。我々はさらに、HIP培地にHGF(20ng/mL)を48時間添加すると、管状構造(図3A、C)の形成をもたらしたことを示した。21.これらのアプローチは、EpH4モデルを用いて、乳腺上皮分化の特定の特徴の特徴と、明確なシグナル伝達経路との関連を可能にする。
図1:HC11セルの分化の評価と定量(A) 分化誘導後10日目に低レベルのGFP-RacV12を発現するHC11細胞に形成されたドーム。左: 位相コントラスト;右:同じフィールドの蛍光(以前は公開されていない写真)。スケールバー = 100 μm;倍率 = 240x;20倍の目標。(B)HC11分化に対する Rac V12 の影響: 低 (レーン 19-24)、中間 (レーン 13 ~ 18)、または RacV12-GFP融合構造の高 (レーン 7 ~ 12) レベルが HC11 細胞で発現されました。24時間のEGFの不在での増殖後、示されるように、細胞はHIP添加で分化するように誘導された、または示されていない。洗浄剤抽出物は、日後に指示された日数で調製し、ローディングコントロールとしてβ-カゼインまたはβアクチンをプローブした。低いRacV12-GFP発現細胞(レーン21-24対3-6)におけるβ-カゼインの劇的な増加と、高いRacV12-GFP(レーン9-12)の発現時の劇的な減少に注意してください。NE=コントロール培養物は、EGFの不在下で成長したが、区別するように誘導されていない(Niit et al.2は、許可を得て再生する)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3Dマトリクス培養におけるEpH4細胞の増殖のためのオーバーレイ法の概略図(A)6ウェルプレートのウェルは、当初、厚さ約2〜5mmの下膜のゲル化されたベッドを形成して37°Cで固化させた100%EHSマトリックスでコーティングした。EpH4細胞をHIP培地中にシングルセル懸濁液としてこのベッドに播種し、20%マトリックスを有した。HIP培地で10%マトリックスを重ねた。10%マトリックス媒体を1日おきに交換した。細胞は増殖し、培養で4〜5日後にマモスフィアを形成し始めました(プロトコルセクションを参照)。(B)2D(単層)および3D(マンモスフィア)培養におけるEpH4細胞の位相コントラスト画像を、デジタルカメラ(300倍の倍率)を搭載した顕微鏡を用いて撮影した。各段階の代表的な画像が表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3D培養におけるEpH4の3Dアシナル形態形成における事象(A) EpH4細胞をマトリックスコート6ウェルプレートで増殖させ、図2のように完全な3D培地で維持した。形態形成の初期段階では、細胞が増殖し、クラスターを形成し、(1)偏極細胞の外層と(2)細胞死を受けた組織化されていない細胞の内層と、前に示したようにアポトーシスに対応する2つのグループに分類された。後者は、位相対照顕微鏡で見られるマンモスフィアの中心の暗黒化を特徴とする中空腔の形成につながった。培地にHGF(20ng/mL)を添加すると、管状構造が形成された。HGF誘導凝集体の60%以上は、未処理の対照凝集体と比較して、チューブ形成を示したが、これはなかった。各段階での細胞の代表的な位相コントラスト写真を、デジタルカメラを搭載した顕微鏡(300倍の倍率;スケールバー = 100 μm)。結果は少なくとも3つの実験を代表する。概略はスタロワら22から適応した。(B)EpH4細胞を3Dで増殖させたが、示された日に収穫した。タンパク質濃度を正規化し、等しいタンパク量(20 μg)をSDS-PAGEに行い、次いで、示された抗体を使用してウェスタンブロッティングおよびプローブを行った。授乳中のマウス(MGT)から均質化された乳腺をインビボ比較として用いた。p120RasGAPは独立したローディングコントロールとして使用された。Cyclin D1発現は、最初の3〜4日間に増殖細胞と一時的に一致して増加した。これに対し、βカゼイン発現は8~10日でピークに達し、成熟したマモスフィアの形成に対応した。結果は2つの実験を代表するものである。(C) マモスフィアのルーメン形成および管状生成は、マトリックスコーティングガラスのカバースリップ上で成長した集合体における核DNA(蛍光青色)のDAPI染色を用いて確認した。細胞を3%パラホルムアルデヒドで固定し、25 μg/mLディジトニンで透過し、非特異的結合を3%BSAでブロックした。その後、DAPI(青色)で核DNAの細胞を染色した。カバースリップは、取り付け媒体を使用してガラススライドに取り付けられました。多光子共焦点顕微鏡(スケールバー=100μm)を用いて中心XY軸面を顕微鏡写真を撮影した。パネルBとCの画像はスタロバら22から適応される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HC11細胞は、新生物の形質転換と共に分化の研究に理想的に適しています。さらに、HC11細胞はMo-MLVベースのレトロウイルスベクターに容易に感染し、様々な遺伝子を発現できることが利点です。私たちの手では、EpH4細胞はHC112よりも同じレトロウイルスベクターに感染することがより困難であった。
細胞間接触および増殖停止は、HC11細胞分化のための重要な前提条件である。したがって、細胞層全体で均一な分化を達成するためには、播種時のペトリ皿における細胞の均一な分布を達成することが重要である。これは、差別化の定量が望ましい場合に特に重要です。トリプシン処理は、単一細胞の懸濁液が達成され、細胞が操作のために生存率を失わないように最適化されなければならない。
トリプシン化される細胞は、高密度に成長した細胞が互いに強く付着する傾向があり、それらを分離することは困難であるため、サブコンフルエント(50〜70%)でなければならない。細胞の乾燥を避けるために、層流フードの床に平らなペトリ皿で吸引し、その後、すぐに排水するために傾けます。蓋でペトリ皿を覆います。必要に応じて、ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに入れることでトリプシンの作用を加速させることができます。
細胞は誘導後10日間に非常にコンフルエントであるため、枯渇している栄養素を置き換える必要があります。培地が変化した場合、細胞密度が高いためプラスチックにうまく接着しない可能性のある細胞の剥離を避けるためにも注意が必要です。それでも、私たちの経験では、3T3L123またはBalb / c3T3誘導体などの分化性水腫細胞とは異なり、フィブロネクチン、コラーゲン、またはCellTakでコーティングされたペトリ皿を使用して良好な分化結果を得る必要はありません。
ブロッティング実験のための正確なタンパク質決定は重要です。血清タンパク質は組織培養グレードのプラスチックに付着する傾向があるため、タンパク質を引き付けしない1.5mLのプラスチックチューブで細胞を削り、洗浄し、細胞をペトリ皿24に直接流すのではなく細胞ペレットにリシス緩衝液を加えるのが重要である。
タンパク質の抽出に関しては、すべての洗浄とリシス溶液を氷冷、ペトリ皿またはEpH4マンモスフィアを氷の上に保つことが非常に重要です。これは、PBS洗浄中のカルシウムが存在しない場合にはカドヘリンが関与しておらず、その結果Stat3-ptyr705が急速に脱リン酸化される25のためである。
HC11細胞用のペトリ皿のサイズは3~4個のウェスタンブロットに対して十分です(すなわち、ペトリ皿あたりのタンパク質回収量は3cmの皿あたり約50μgです)。タンパク質抽出を容易にするために、分化実験には3cmのペトリ皿を使用することを好みます。6ウェルトレイを代わりに使用する場合、残りのウェルを無菌状態にしたまま、寒さの中で1つの井戸からタンパク質を抽出することは困難です。また、CO2濃度は分化に重要であり、ベンチの1つの井戸からタンパク質が抽出されるため、井戸の残りの部分のためにそれを維持することは困難です。
私たちの経験では、前読細胞23の分化とは異なり、数ロットの胎児の子牛血清がHC11またはEpH4細胞の分化と同様に成長をサポートすることができます。テストされた新生児の子牛血清の1つの多くは、正常な成長をサポートすることができたが、分化をサポートしなかった:細胞は最初に分化するように見えたが、新生児の子牛血清中の3回の通路の後に分化する能力を失った。
HC11細胞とは対照的に、EpH4細胞の分化は、周囲の3Dマトリックスアーキテクチャに密接に関連しています。前の研究26、27、28およびβカゼイン産生の分析のためのその後のタンパク質抽出から修飾された3D培養におけるEpH4分化に必要なステップを説明する。EHS マトリックスは低温 (<10 °C) で液体で、より高い温度で固化します。通常は-80°Cで保存しますが、作業アリコートは-20°Cで保存できます。使用前の晩に4°Cでマトリックスを解凍し、取り扱い前に-20°Cでプレチルティッシュ培養プレートとピペットチップを解凍してください。タンパク質濃度を正確に評価するには、マトリックスがタンパク質に富むため、冷たいPBS洗浄で抽出する前にマトリックスを完全に排除することが重要であり、タンパク質決定結果を混乱させる可能性があります。
分化のためのマトリックスに対するEpH4依存性は複数の実験モデルで実証されている:ライヒマンら10は、ラミニン沈着およびシトケラチン発現の増強領域内でβカゼインを産生する乳新性ホルモンによって誘発されたEpH4細胞を示した。ソマシリら11は、結合依存性のスフェロイド形成および分化乳タンパク質遺伝子発現に対してPI3キナーゼが必要であることを実証した。さらに、ブリンクマンら21は、EpH4細胞におけるトランスフェクト型HGF cDNAの発現が3D培養モデルにおけるスフェロイドの分岐チューブ形成を誘導することを実証し、ここで見られるHGF誘導チューブル形成に類似している(図3A、C)。これらの知見は、乳腺分化を調節するシグナル伝達事象を研究するためのEpH4細胞系モデルの利点を示す。
EpH4細胞は、記載されている10%よりも低い胎児子牛血清の濃度でメッキするとマンモスフィアを形成することもできる。興味深いことに、それらは、より低い濃度で、または20%または10%マトリックスの存在しない場合でも、100%マトリックス22、27の層の上にメッキするとマモスフィアを形成することができる。細胞懸濁液中にマトリックスがない場合、細胞を冷却することは避ける。さらに、すべてのセルが単一の平面に含まれるため、写真を撮りやすくなります。
重要性:培養細胞におけるカドヘリンの関与は、生体内の細胞の生理的状態に近似し、Rac/IL6/Stat3経路を活性化することができる。これは、上皮細胞分化において特に重要であり得る。記載された技術を用いて、我々の結果は、細胞増殖と分化のバランスの中心決定要因としてこの経路から発せられるシグナルの強度を露呈し、2つの根本的に対立するプロセス2である。E-カドヘリン/Rac/Stat3軸の詳細な調査は、癌治療の標的として利用される可能性のある発現のレベルに応じて、経路の新しい両立成分を発見する可能性がある。このような標的の場合、新生物の表現型を逆転させるために完全な阻害は必要ない。残存量が実際に変換をブロックし、分化を促進する可能性があるため、部分的な阻害は有益です。これは、HC11対EpH4細胞2、20におけるRacV12対Stat3Cの異なる挙動から示されるように、対象および問題の腫瘍の種類によって異なる場合がある。
今後のアプリケーション:カドヘリン/Rac/IL6/Stat3経路は、ヒト乳房MCF10Aやイヌ腎臓MDCK29細胞株などの他の上皮細胞の分化、ならびに前読み細胞および筋芽細胞の異なるタイプのような細胞の合流に依存する他のタイプの分化において同様の役割を果たす可能性がある。最後に、この技術は、Stat531および分化経路の他の成分の役割の検査に利用することができる。
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Disclosures
著者らは開示する競合はありません。
Acknowledgments
HC11細胞株はD.メディナ博士(テキサス州ヒューストン)によって親切に提供された。著者らは、多くの試薬と貴重な提案のためにクイーンズ大学のアンドリュー・クレイグ博士に感謝しています。EpH4細胞は、C.ロスケリー博士(バンクーバーのUBC)からの贈り物でした。コリーン・シックは、3D文化研究のための優れた技術支援を提供しました。
カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、カナダ健康研究所(CIHR)、カナダ乳癌財団(CBCF、オンタリオ支部)、カナダ乳癌研究同盟の資金援助オンタリオ・センター・オブ・エクセレンス、乳がんアクションキングストン(BCAK)、クレア・ネルソンのLRへの助成金による遺贈基金は、感謝の念をうっていいます。CIHR、CBCF、BCAK、がん研究協会から助成金を受けたPTGは、カナダイノベーション財団、CIHR、NSERC、カナダ癌学会のカナダ研究委員長が支援しています。MNは、NCICの学際的がん研究におけるテリー・フォックス・トレーニング・プログラムの学生シップ、大学院賞(QGA)、クイーンズ大学の学部長賞によって支援されました。MGは、アメリカ陸軍乳がんプログラム、オンタリオ州の研究イノベーション省、クイーンズ大学の諮問研究委員会の博士研究員によって支援されました。VHは、CIHRと提携して、学際癌研究におけるテリー・フォックス財団研修プログラムのCBCF博士フェローシップと博士研究員によって支援されました。ハナド・アダンはNSERCの夏の学生シップの受給者でした。BSはクイーンズ大学の大学院賞に支えられていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
