Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode voor het meten van Chitinase activiteit in biologische vloeistoffen zoals bronchoalveolaire spoeling of serum.

Abstract

Chitinasen zijn de enzymen die het aankleven van chitin. Zelfs bij afwezigheid van chitine hebben zoogdieren aanzienlijke hoeveelheden chitinases aanwezig in het lichaam, waaronder bij Baseline. De precieze rol van Chitinase is niet bekend, maar het werd verondersteld om een belangrijke rol te spelen in de spijsvertering en gastheer verdediging tegen chitin-bevattende voedsel en pathogenen, respectievelijk. Recent werk, met inbegrip van de onze, heeft een belangrijke rol getoond van Chitinase en Chitinase-achtige eiwitten in gastheer immuniteit en allergische ziekten. Belangrijk, Chitinase activiteiten dienen als belangrijke biomarkers van de ernst van de ziekte in een breed scala van ziekten, met inbegrip van type 2 ontstekingsziekten zoals astma en pulmonale fibrose. Evenzo hebben patiënten met genetische aandoeningen zoals de ziekte van Gaucher de Chitinase-niveaus significant verhoogd, die niet alleen correleren met de ernst van de ziekte, maar ook dienen als een betrouwbare biomarker voor therapeutische effectiviteit. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een eenvoudige, snelle en eenvoudige manier om Chitinase-activiteit in BAL-of serummonsters van muizen te meten en kan op grote schaal worden aangepast aan menselijke proefpersonen en andere model organismen als gevolg van de sterk geconmaelde aard van de enzymen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chitine is de op een na meest overvloedige polysaccharide op aarde na cellulose en fungeert als een belangrijke structurele component van een verscheidenheid aan organismen, waaronder het exoskelet van insecten, schimmels, gist en algen; Sommige gewervelde dieren hebben ook chitine1. Chitinases zijn een familie van enzymen die in staat zijn chitine af te breken en worden sterk geconconserd door de evolutie in soorten variërend van bacteriën tot zoogdieren2,3. Naast chitinases hebben zoogdieren ook Chitinase-achtige eiwitten die vergelijkbaar zijn met chitinases in hun vermogen om chitine te binden, maar verschillen in die zin dat ze het enzymatische vermogen missen om de chitine4te klieven.

Hoewel chitine en chitinases al lang bestudeerd zijn — met onderzoeken die dateren uit de vroege jaren 1900 — lag de nadruk op hun rol in insecten en andere ongewervelde dieren. In feite was het pas in de jaren zestig, toen gewervelde dieren in het geheel chitinases bleken te hebben. Met behulp van een op chitobiase gebaseerde assay bleken chitinases te worden gevonden in het spijsverteringskanaal van een aantal gewervelde dieren, waaronder hagedissen en Merel — een observatie veronderstelde te wijten aan het gebruik van chitine bevattende organismen zoals insecten5 .

Zoogdieren hebben twee enzymatisch actieve vormen van Chitinase: zure zoogdier Chitinase (AMCase; ook bekend als CHIT2 en CHIA) en chitotriosidase (CHIT1)4. Beide eiwitten zijn geschikt voor het hydrolyseren van chitine. Echter, CHIT1 is meer enzymatisch actief bij de mens, waar bijna alle Chitinase activiteit is afgeleid van CHIT1. 4 bij muizen dragen zowel Chit1 als amcase bijna evenveel bij aan de algehele activiteit van Chitinase6. Aan de andere kant, Chitinase-achtige eiwitten missen Chitinase activiteit.

Chit1 wordt voornamelijk uitgescheiden door macrofagen en wordt vaak beschouwd als een immuunrespons op chitine bevattende pathogenen7. Het enzym is ook betrokken bij de rijping van monocyten in zowel M1 en m2 macrofaag subtypen, zelfs zonder de aanwezigheid van het substraat chitine8. Bovendien, het kan ook worden betrokken bij de rijping van andere immuuncellen, met inbegrip van T helper type 2 (Th2) cellen en eosinofielen — zoals bleek het geval te zijn in crypto Kokken longinfectie9. Deze studies wijzen op een complexe rol van chitinases in het immuunsysteem.

In de afgelopen jaren, Chit1 niveaus zijn gevonden om te dienen als een belangrijke biomarker van progressie voor meer dan 40 verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van lysosomale opslag ziekten, infectieziekten, ademhalingsziekten, endocrinologische ziekten, cardiovasculaire ziekten, neurologische aandoeningen, en anderen (beoordeeld10). In veel van deze ziekten, de niveaus van Chit1 zijn een sterke voorspeller van de ernst van de ziekte en therapeutische effectiviteit10.

Omdat chitinases een reputatie hebben opgebouwd als biomarker voor talrijke medische aandoeningen, waaronder de ziekte van Gaucher, zijn gereedschappen en assays ontwikkeld om het testen van de aanwezigheid van Chitinase te vergemakkelijken. Oudere methoden zijn onder meer de procedure van Schales, een protocol dat is aangepast aan een bloedglucose test en de methode met 3, 5 dinitrosalicyl zuur (DNS). Echter, deze methoden zijn vaak tijd gevoelig en technisch moeilijk11. De procedure voor beide tests vereist de reductie van anorganische oxidanten, ferricyanide in het geval van de Schales-procedure, bijvoorbeeld het produceren van een kleurverandering die alleen spectrofotometrisch kan worden gemeten. Daarnaast hebben beide tests betrekking op een verwarmings-of kook stap die zowel tijdrovend als noodzakelijk is om de kleur12,13te ontwikkelen.

Hier beschreven is een snelle en eenvoudige fluorimetrische assay om de Chitinase spiegels in zoogdier monsters14,15te bepalen. Twee van de hier gebruikte monsters omvatten serum en bronchoalveolaire spoeling vloeistoffen (bal); Chitinase activiteit is ook gemeten in moedermelk en urine monsters, en de techniek kan worden uitgevoerd in dit soort monsters, alsmede in elke andere biologische vloeistof16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dier procedures werden uitgevoerd onder een IACUC-goedgekeurd protocol aan de Yale University School of Medicine.

1. voorbeeld verzameling van muizen

  1. Esthetisering
    1. Anesthetiseer muizen met ketamine en xylazine (100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine).
  2. Bloedmonster collectie
    1. Bevestig de diepte van de anesthesie door niet-responsiviteit op een teen knijpen.
    2. Open de borstholte chirurgisch om het hart bloot te leggen.
    3. Steek een 26,5 G naald in de linker ventrikel en verzamel bloed in een spuit.
      Opmerking: Meestal kan ongeveer 0,5 – 1 mL bloed worden geoogst van een gezonde 20 – 25 g muis.
    4. Verzamelen van het bloed in heparine buizen, voor plasma inzameling, of niet-gehepariniseerd buizen voor serum collectie.
  3. Verzameling van bronchoalveolaire spoeling vloeistof (bal)
    1. Om de BAL te verzamelen, maak een verticale snede op de nek om de luchtpijp bloot te leggen.
    2. Cannulaat de luchtpijp met een 22 G katheter en bevestig het stevig met behulp van een string om lekkage uit de neus van de muis te voorkomen.
    3. Injecteer langzaam twee aliquots van steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,75 mL elk) in de longen via de luchtpijp en haal terug.
    4. Pool aliquots en blijf op ijs voor verdere analyse.
  4. De verwerking van de biologische monsters.
    1. Bloedmonster: ofwel vers (plasma) of na het toestaan van coagulatie voor 4 uur (serum), centrifugeer bij 600 x g gedurende 10 minuten. Neem de supernatant en ofwel bevriezen voor opslag of gebruik voor experiment.
    2. BAL: Centrifugeer het monster bij 350 x g gedurende 5 min. Neem de supernatant en ofwel bevriezen voor opslag of gebruik voor experiment.

2. Chitinase-test

Opmerking: De wetenschap achter de assay is relatief eenvoudig. Een niet-fluorescerende substraat wordt gespleten door enzymatisch actieve Chitinase om een fluorescerend product te produceren, dat vervolgens wordt gemeten als een indirecte marker van Chitinase activiteit. De chitinases in de monsters breken het substraat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose aanwezig in de 1x McIlvain buffer. Een fluorescerende molecuul 4-methylumbelliferyl wordt vrijgegeven. Door de totale fluorescentie van elk goed te meten, verkrijgen we een nauwkeurige meting van de actieve Chitinase in elk monster. Omdat de afbraak van chitine door Chitinase een Hydrolytische reactie is, beëindigt de stop buffer, een mengsel van 0,3 M glycine en NaOH (12,0 g/L bij pH 10,6), de afbraak van chitine door een omgeving te creëren die te eenvoudig is om het enzym te laten functioneren.

  1. Bereid de substraten, standaarden en oplossingen voor.
    1. De McIlvain-buffer voorbereiden. De McIlvain buffer bestaat uit 0,1 M citraat en 0,2 M fosfaat bij een pH van 5,2. Verdun met een verhouding van 1:1 voor 1x McIlvain buffer.
    2. Los zowel 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose en 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose in 1x McIlvain buffer tot een concentratie van 500 μM elk.
      Opmerking: Stock oplossing kan bij-20 °C worden opgeslagen voor verder gebruik; beste opgeslagen in aliquots.
    3. Los standaard 4-methylumbelliferone op tot een concentratie van 0,1 mM in de stop buffer (mengsel van 0,3 M glycine en NaOH (12,0 g/L bij pH 10,6)) om de standaard curve stockoplossing te creëren.
  2. Creëer en plaat de werkoplossing.
    1. Combineer 1x McIlvain buffer en chitine substraat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose om de werkoplossing te creëren. Meng voor elke 10 monsters 100 μL substraat met 2,17 mL 1x McIlvain buffer. Zie tabel 1 voor aanvullende berekeningen op basis van de steekproefgrootte.
      Opmerking: Gebruik 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose voor menselijke monsters. Hoewel beide substraten kunnen worden gecleaved door humane of muis enzymen, zijn ze toegewezen voor menselijke of muis monsters op basis van de efficiëntie van decolleté6.
    2. Pipetteer 95 μL werkoplossing in elke put van een 96-well plaat.
  3. Voeg biospecimen monsters toe aan de werkoplossing.
    1. Voeg vervolgens 5 μL van het testmonster (bloed/BAL/weefsel lysaat/andere biologische vloeistof) toe aan elk goed.
    2. Meng het monster in de werkoplossing voor de nauwkeurigste en betrouwbaarste resultaten.
      Opmerking: Monsters moeten worden uitgevoerd in duplicaten/triplicaten met speciale aandacht besteed aan potentiële randeffecten. Alle monsters moeten vooraf worden opgewarmd om het randeffect te minimaliseren. Aangezien de test een reactie inhoudt tussen chitinases in het monster en substraat in de werkoplossing, is het het beste om relatief snel te werken om het verschil in tijd te minimaliseren tussen wanneer het eerste monster wordt verguld en het laatste monster wordt verguld. Multikanaalspipet wordt aanbevolen.
  4. Incuberen bij 37 °C.
    1. Dek de plaat af en schud kort (5 s).
    2. Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 15 minuten. Hierdoor kan de enzymatische reactie plaatsvinden.
  5. Bereid de standaard curve voor.
    1. Terwijl de monsters worden geïnbroed, bereid een seriële verdunning van 4-methylumbelliferone, een standaard die vaak wordt gebruikt bij de fluorimetrische bepaling van enzymactiviteit.
    2. Verdun de kolf van de standaardoplossing in de stop buffer tot een concentratie van 5 μM.
    3. Voer een reeks verdunningen uit zoals aangegeven in tabel 2. Voeg de componenten toe in de aangegeven hoeveelheid en meng goed.
      Opmerking: De standaard curve helpt ervoor te zorgen dat de gemeten monsters in het lineaire bereik van de standaard curve vallen.
  6. Stop de reactie met stop buffer.
    1. Voeg aan elke put 200 μL stop buffer toe om de reactie te stoppen.
  7. Plaat de normen.
    1. Voeg in duplicaten op dezelfde plaat 300 μL van elke norm per put toe.
  8. Lees de plaat met een fluorometrische lezer.
    1. Lees de plaat bij een excitatie van 360 nm en een emissie van 455 nm.

3. gegevensanalyse

  1. De lege cellen aftrekken
    1. Gemiddelde van de waarden van de dubbele standaard verdunningen die geen 4-methylumbelliferone hebben. Deze waarde aftrekken van alle andere vastgelegde waarden.
  2. Neem het gemiddelde van de technische replicaten en plot de normen.
    1. Gemiddelde de twee metingen voor elke concentratie en grafiek de gemiddelde lezing door concentratie.
      Opmerking: De resulterende plot moet lineair uitzien en hebben een R2 waarde dicht bij 1. Als dat niet zo is, kan het nodig zijn om de normen opnieuw te maken en de plaat te herlezen om de kwaliteit van de gegevensanalyse te garanderen.
  3. Standaardiseer de uitleeswaarden.
    1. Maak een best passende lijn voor de uitgezette Standards-gegevens. Verdeel de Lees-outs van de samples door de helling van de best passende lijn.
  4. Waarden vergelijken van controlegroep en variabelengroep.
    1. Gebruik een t-toets of ANOVA, voor meer dan twee groepen, om te bepalen of het verschil tussen groepen statistisch significant is. De waarden zullen de eenheden nmol/mL · h nemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De getoonde resultaten zijn afkomstig uit een studie die de Chitinase activiteit in serum en BAL monsters van wild type (C57BL/6) en Chit1 transgene muizen (op C57BL/6 achtergrond) meet die het Chit1 gen op een doxycycline-promotor overdrukken. Uit onze gegevens blijkt dat zowel serum-als BAL monsters detecteerbare Chitinase-activiteit hebben bij Baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h en 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectievelijk. Overexpressie van het Chit1 gen met behulp van doxycycline in drinkwater gedurende 4 weken resulteerde in de verhoging van Chitinase activiteit die werd waargenomen in zowel BAL (4.575 ± 673,8 nmol/mL · h, p = 0,003) en serum 1556 ± 251,2 nmol/mL · h, p = 0,0272, in vergelijking met de baseline monsters.

Met behulp van het hier beschreven protocol bevestigt de test dat overexpressie van het Chit1 gen in muizen resulteert in verhoogde Chitinase activiteit. Een t-toets werd gebruikt om de middelen van de twee groepen te vergelijken. Elke groep bevatte 5 muizen.

Figure 1
Figuur 1: Chitinase-activiteit. Chitinase activiteit werd gemeten in het (A) serum en de (B) bronchoalveolaire spoeling vloeistof van wild type (WT) en chitotriosidase (chittg) over-uitdrukken van transgene muizen. Elke stip vertegenwoordigt een afzonderlijk muis voorbeeld. C) de waarden werden gestandaardiseerd aan de hand van de lineariteit van de standaard curve zoals beschreven in het protocol. De fluorescentie spiegels werden gemeten met behulp van een plaat lezer bij een golflengte van 360 nm voor excitatie en 455 nm voor emissie en gepresenteerd als AU. AU = willekeurige eenheid * p < 0,05, * * * p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aantal monster putten Substraat (μL) McIlvain buffer (mL)
20 100 2,17
50 250 5,425
100 500 10,85

Tabel 1: voorbeeld berekeningen voor het maken van de werkoplossing.

ΜL 1 2 3 4 5 6 7 8
Conc. (nM) 0 125 250 375 500 625 750 875
Standaard 0 20 40 60 80 100 120 140
2x McIlvian 200 200 200 200 200 200 200 200
Gedistilleerd H2O 200 180 160 140 120 100 80 60
Stop buffer 400 400 400 400 400 400 400 400

Tabel 2: verdunningen voor standaard curve metingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chitinase activiteit is ontstaan als een belangrijke biomarker voor het voorspellen van de ernst van de ziekte, ziekteprogressie, therapeutische effectiviteit en de aanwezigheid van specifieke pathogenen18. Hoewel veel van de lang gepostleerde theorieën over de rol van chitinases niet experimenteel zijn bewezen19, hebben nieuwe studies belangrijke inzichten gegeven in de rol van chitinasen en Chitinase zoals eiwitten in verschillende ziekten2, 9,20.

Het hier beschreven protocol is een eenvoudige, snelle en effectieve manier om de activiteit van Chitinase in biologische monsters te meten. Er is weinig tot geen wijziging nodig om de Chitinase-activiteit te meten in een breed scala aan biologische monsters en soorten als gevolg van de zeer gecongediende aard van chitinases. Vermeld in dit protocol zijn twee substraten, waarvan er één is aangewezen voor muis monsters en één voor menselijke monsters; beide substraten kunnen echter op beide soorten worden gebruikt, omdat ze als zodanig zijn aangewezen op basis van eerdere papers ' demonstratie van de efficiëntie waarmee de enzymen het substraat kunnen klieven.

Vergeleken met reeds bestaande technieken, zoals de Schales-procedure en de DNS-methode, elimineert de hier uiteengezette bepaling de noodzaak van tijdrovende stappen zoals koken of verwarmen die nodig waren in oudere methoden. Bovendien is de assay minder technisch moeilijk en zijn er minder gecompliceerde stappen nodig dan de voorafgaande meettechnieken. Voor het beste resultaat moeten zowel biologische als technische replicaten worden gebruikt.

Als de Chitinase-activiteit te hoog is, zijn verdunningen van het biologische monster voldoende om de Chitinase-activiteit voor metingen te verminderen en de werkelijke waarden kunnen worden berekend op basis van de verdunning. Bij het uitvoeren van dit experiment op nieuwe biologische monsters, kan het nuttig zijn om herhaalde metingen op dezelfde plaat na verloop van tijd uit te voeren tot verzadiging om een goede incubatietijd te garanderen voor de beste resultaten. Bovendien kan het protocol omhoog of omlaag worden geschaald, zolang de consistentie tussen de groepen blijft. De toekomstige toepassingen van dit protocol zijn veel te bereiken, omdat het onderzoek zich in een aantal ziekten alleen in de rol van Chitinase-activiteit oppikken.

Een van de eerste categorie van ziekten die Chitinase activiteit bleek te zijn relevant in was lysosomale opslag ziekten, met inbegrip van de ziekte van Gaucher, Niemann-Pick A/B en C, GM-1 gangliosidose, en vele anderen21. Gaucher ziekte is een lysosomale opslag ziekte veroorzaakt door onvoldoende activiteit van glucocerebrosidase en wordt gekenmerkt door de ophoping van glucosylceramide, het substraat van glucocerebrosidase, in de lysosoom van macrofagen15. Het is een genetische aandoening, met klinische symptomen die de uitbreiding van de milt en de lever, een laag aantal bloedplaatjes, bloedarmoede, vermoeidheid en botproblemen22. Klinisch onderzoek heeft aangetoond dat een meerderheid van de mensen die lijden aan de ziekte van Gaucher een mediane Chitinase-activiteit heeft die meer dan 600 keer de mediane waarde van normale controle vrijwilligers is; Bovendien, wanneer mensen met Gaucher ziekte werden gezet op enzym suppletie therapie — de huidige behandeling voor de ziekte — hun Chitinase activiteit niveaus gedaald aanzienlijk lenen Chitinase activiteit een uitstekende marker van beide ziekte progressie-en behandelings monitoring15. Er is echter nog geen rol gevonden voor Chit1 in de ziekte. Vergelijkbaar onderzoek heeft geleid tot Chit1 activity monitoring voor tal van andere lysosomale opslag ziekten10.

Daarnaast heeft verder onderzoek een potentiële rol voor Chit1 activiteit aangegeven tijdens verschillende pathogenen infecties, waaronder schimmelinfectie, malaria, tuberculose en K. pneumoniae om een paar2,3,10 te noemen . Een 2012 studie vond dat Chitinase activiteit werd verhoogd bij patiënten met actieve tuberculose (TB) infectie, zelfs wanneer het sputum uitstrijkje negatief was, wat aangeeft dat Chitinase-activiteit kan worden gebruikt als een effectieve biomarker in TUBERCULOSE-diagnose, vooral tijdens de lange wachttijd die vaak nodig is om de ziekte nauwkeurig te diagnosticeren23. Vergelijkbare bevindingen werden gezien tijdens Plasmodium falciparum infectie, met chitotriosidase serumspiegels significant verhoogd in die met acute infectie24. Terwijl veel van deze ziekten nemen dagen te diagnosticeren, snelle metingen van Chitinase activiteitsniveaus in het bloed kunnen bieden nuttige inzichten in de diagnose. Bovendien, als malariaparasieten en tuberculose bacterie worden steeds beter bestand tegen behandelingen, meten Chitinase activiteitsniveaus in het serum kan helpen met de behandeling monitoring voor de effectiviteit in real time.

Meer en meer onderzoek is begonnen om zich te concentreren op de rol van Chitinase en Chitinase-achtige eiwitten in de immuunrespons, met name de rol in ontstekings trajecten. Naarmate dit onderzoek voortduurt, zal dit protocol een snelle en nauwkeurige meting van deze Chitinase-activiteit mogelijk maken voor verder onderzoek. Het protocol is gemakkelijk aan te passen voor een aantal soorten monsters, waaronder zowel de muis als de mens, waardoor het breed toepasbaar is.

Naast het onderzoeksvoordeel zullen betere methoden voor het opsporen en meten van Chitinase-activiteit in monsters gunstig zijn in het klinische rijk. Recent onderzoek heeft de rol van Chitinase aangetoond als een biomarker in de pathologie van talrijke chronische ziekten, waaronder de ziekte van Gaucher, diabetes mellitus, sarcoïdose, atherosclerose, ontstekingsdarmziekte en kanker3, 21,25,26.

Vanwege deze rol als biomarker is snelle en nauwkeurige meting van de activiteit van Chitinase, zoals hier getoond, ongelooflijk relevant voor het gebied van de geneeskunde, waardoor zorgverleners meer informatie krijgen voor een juiste diagnose en behandelplan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door de American Lung Association en de American Thoracic Society Awards voor LS. Schrijvers willen oprecht Dr. Jack Elias en Dr. Chun Geun Lee bedanken voor het leveren van transgene muis stammen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5, (1), 21-29 (2013).
  2. Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201, (2), 615-626 (2018).
  3. Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/ 1-9 (2012).
  4. Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
  5. Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192, (4798), 135-136 (1961).
  6. Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276, (9), 6770-6778 (2000).
  7. Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
  8. Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36, (2), 482-492 (2013).
  9. Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11, (3), e1004701 (2015).
  10. Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
  11. Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7, (37), 1-8 (2014).
  12. Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623 78 (1945).
  13. Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42, (297), 1017-1029 (2011).
  14. Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304, (5677), 1678-1682 (2004).
  15. Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93, (3), 1288-1292 (1994).
  16. Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43, (2), 198-201 (2005).
  17. Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
  18. Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138, (4), 1183-1189 (2016).
  19. Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10, (1), 69-78 (2008).
  20. Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (22), e2891-e2899 (2015).
  21. Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88, (1), 69-78 (2016).
  22. Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30, (1), 82-87 (2019).
  23. Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
  24. Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331, (1-2), 79-85 (2003).
  25. Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183, (1), 313-325 (2013).
  26. Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).More

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter