Summary
Hier wird eine einfache Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Flüssigkeiten wie Bronchoalveolar-Lavage oder Serum vorgestellt.
Abstract
Chitinasen sind die Enzyme, die Chitin spalten. Auch in Ermangelung von Chitin, Säugetiere haben erhebliche Mengen an Chitinasen im Körper vorhanden, auch an der Basis. Die genaue Rolle der Chitinase ist nicht bekannt, aber es wurde geglaubt, um eine wichtige Rolle bei der Verdauung und Host-Verteidigung gegen Chitin-haltige Lebensmittel und Krankheitserreger zu spielen. Jüngste Arbeiten, einschließlich unserer, haben eine wichtige Rolle von Chitinase und Chitinase-ähnlichen Proteinen bei der Wirtsimmunität und allergischen Erkrankungen gezeigt. Wichtig ist, dass Chitinase-Aktivitäten als wichtige Biomarker der Krankheitsschwere bei einer Vielzahl von Krankheiten dienen, einschließlich typ-2-entzündlichen Erkrankungen wie Asthma und Lungenfibrose. In ähnlicher Weise haben Patienten mit genetischen Störungen wie der Gaucher-Krankheit deutlich erhöhte Chitinase-Spiegel, die nicht nur mit der Schwere der Erkrankung korrelieren, sondern auch als zuverlässiger Biomarker für die therapeutische Wirksamkeit dienen. Das hier skizzierte Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und unkomplizierte Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in BAL- oder Serumproben von Mäusen und kann aufgrund der stark konservierten Natur der Enzyme weitgehend an menschliche Probanden und andere Modellorganismen angepasst werden.
Introduction
Chitin ist das zweithäufigste Polysaccharid auf der Erde nach Zellulose und dient als wichtiger struktureller Bestandteil einer Vielzahl von Organismen, einschließlich des Exoskeletts von Insekten, Pilzen, Hefen und Algen; einige Wirbeltiere haben auch Chitin1. Chitinasen sind eine Familie von Enzymen, die in der Lage sind, Chitin zu brechen und sind hoch konserviert während der Evolution in Arten von Bakterien bis Säugetiere2,3. Neben Chitinasen haben Säugetiere auch chitinaseähnliche Proteine, die Chitinasen in ihrer Fähigkeit, Chitin zu binden, ähnlich sind, sich aber dadurch unterscheiden, dass sie nicht enzymatisch in der Lage sind, das Chitin zu spalten4.
Obwohl Chitin und Chitinasen seit langem untersucht werden – mit Untersuchungen aus den frühen 1900er Jahren –, lag der Schwerpunkt auf ihrer Rolle bei Insekten und anderen wirbellosen Tieren. Tatsächlich war es erst in den 1960er Jahren, als Wirbeltiere überhaupt Chitinasen hatten. Mit Hilfe eines Chitobias-basierten Assays wurden Chitinasen im Verdauungstrakt einer Reihe von Wirbeltieren, einschließlich Eidechsen und Amseln, nachgewiesen – eine Beobachtung, die auf den Verzehr von Chitin-haltigen Organismen wie Insekten zurückzuführen ist5 .
Säugetiere haben zwei enzymatisch aktive Formen der Chitinase: saure Säugetierchitinase (AMCase; auch bekannt als CHIT2 und CHIA) und Chitotriosidase (CHIT1)4. Beide Proteine sind in der Lage, Chitin zu hydrolysieren. CHIT1 ist jedoch enzymatisch aktiver beim Menschen, wo fast die gesamte Chitinase-Aktivität von CHIT1 abgeleitet ist. 4 Bei Mäusen tragen sowohl Chit1 als auch AMCase fast zu gleichen Teilen zur Gesamtchartase-Aktivitätbei 6. Auf der anderen Seite, Chitinase-ähnliche Proteine fehlt Chitinase-Aktivität.
Chit1 wird hauptsächlich durch Makrophagen abgesondert und wird oft als Immunantwort auf Chitin-haltige Krankheitserregerangesehen 7. Das Enzym hat sich auch bei der Reifung von Monozyten in M1- und M2-Makrophagensubtypen beteiligt, auch ohne das Vorhandensein des Substrats Chitin8. Darüber hinaus kann es auch an der Reifung anderer Immunzellen einschließlich T-Helfer Typ 2 (Th2) Zellen und Eosinophile beteiligt sein – wie sich bei kryptokokkalen Lungeninfektionen gezeigt hat9. Diese Studien deuten auf eine komplexe Rolle von Chitinasen im Immunsystem hin.
In den letzten Jahren wurden Chit1-Spiegel als wichtiger Biomarker für die Progression von über 40 verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich lysosomaler Speichererkrankungen, Infektionskrankheiten, Atemwegserkrankungen, endokrinologischen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen und anderen (überprüft10). Bei vielen dieser Krankheiten sind die Konzentrationen von Chit1 ein starker Prädiktor für die Schwere der Erkrankung und die therapeutische Wirksamkeit10.
Da Chitinasen einen Ruf als Biomarker für zahlreiche Erkrankungen einschließlich Gaucher-Krankheit gewonnen haben, wurden Werkzeuge und Assays entwickelt, um Tests auf Chitinase-Präsenz zu erleichtern. Zu den älteren Methoden gehören Schales' Verfahren, ein Protokoll, das an einen Blutzuckertest angepasst wurde, und die 3,5 Dinitrosalicylsäure (DNS) Methode. Diese Methoden sind jedoch oft zeitsensibel und technisch schwierig11. Das Verfahren für beide Tests erfordert die Reduktion von anorganischen Oxidationsmitteln, Ferricyanid beispielsweise im Falle des Schales-Verfahrens, wodurch eine Farbänderung entsteht, die nur spektrophotometrisch gemessen werden kann. Darüber hinaus beinhalten beide Tests einen Heiz- oder Siedeschritt, der sowohl zeitaufwändig als auch notwendig ist, damit die Farbe12,13entwickelt werden kann.
Beschrieben hier ist ein schneller und einfacher fluorimetrischer Test zur Bestimmung des Chitinase-Spiegels in Säugetierproben14,15. Zwei der hier verwendeten Proben sind Serum- und Bronchoalveolar-Lavage-Flüssigkeiten (BAL); Chitinase-Aktivität wurde auch in Muttermilch- und Urinproben gemessen, und die Technik kann in dieser Art von Proben sowie in jeder anderen biologischen Flüssigkeit16,17durchgeführt werden.
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Protocol
Alle tierischen Eingriffe wurden im Rahmen eines von der IACUC zugelassenen Protokolls an der Yale University School of Medicine durchgeführt.
1. Maus-Sample-Sammlung
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Anästhesisierung
- Anästhesisieren Sie Mäuse mit Ketamin und Xylazin (100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin).
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Blutprobenentnahme
- Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Nicht-Reaktion auf eine Zehenklemme.
- Öffnen Sie chirurgisch die Brusthöhle, um das Herz freizulegen.
- Legen Sie eine 26,5 G Nadel in den linken Ventrikel ein und sammeln Sie Blut in eine Spritze.
HINWEIS: In der Regel können etwa 0,5-1 ml Blut von einer gesunden 20-25 g Maus geerntet werden. - Sammeln Sie das Blut in heparinisierten Röhren, für die Plasmasammlung, oder nicht-heparinisierte Röhren für die Serumsammlung.
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Sammlung von Bronchoalveolar-Lavageflüssigkeit (BAL)
- Um die BAL zu sammeln, machen Sie einen vertikalen Schnitt am Hals, um die Luftröhre freizulegen.
- Die Luftröhre mit einem 22 G Katheter anfassen und mit einer Schnur fest sichern, um ein Auslaufen aus der Nase der Maus zu verhindern.
- Proginzieren Sie langsam zwei Aliquots steriler Phosphat-gepufferter Salzin (PBS, je 0,75 ml) über die Luftröhre in die Lunge und holen Sie sie zurück.
- Pool Aliquots und halten Sie auf Eis für weitere Analysen.
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Verarbeitung der biologischen Proben.
- Blutprobe: Entweder frisch (Plasma) oder nach Zulassung der Gerinnung für 4 h (Serum), Zentrifuge bei 600 x g für 10 min. Nehmen Sie den Überstand und frieren Sie entweder für die Lagerung oder für Experimente.
- BAL: Zentrifugieren Sie die Probe bei 350 x g für 5 min. Nehmen Sie den Überstand und frieren Sie entweder für die Lagerung oder für Experimente.
2. Chitinase Assay
HINWEIS: Die Wissenschaft hinter dem Test ist relativ einfach. Ein nicht fluoreszierendes Substrat wird durch enzymatisch aktive Chitinase zu einem fluoreszierenden Produkt spaltet, das dann als indirekter Marker der Chitinaseaktivität gemessen wird. Die Chitinasen innerhalb der Proben brechen das Substrat 4-Methylumbelliferyl-D-N, N'-Diacetylchitobiose im 1x McIlvain Puffer auf. Ein fluoreszierendes Molekül 4-Methylumbelliferyl wird freigesetzt. Durch die Messung der Gesamtfluoreszenz jedes Brunnens erhalten wir eine genaue Messung der aktiven Chitinase in jeder Probe. Da der Abbau von Chitin durch Chitinase eine hydrolytische Reaktion ist, beendet der Stop-Puffer, eine Mischung aus 0,3 m Glycin und NaOH (12,0 g/l bei pH 10,6), den Abbau von Chitin, indem er eine Umgebung schafft, die zu einfach ist, um das Enzym zu funktionieren.
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Bereiten Sie die Substrate, Standards und Lösungen vor.
- Bereiten Sie den McIlvain-Puffer vor. McIlvain Buffer besteht aus 0,1 M Citrat und 0,2 M Phosphat bei einem pH-Wert von 5,2. Bei einem Verhältnis von 1:1 für 1x McIlvain Puffer verdünnen.
- Lösen Sie sowohl 4-Methylumbelliferyl-D-N, N'-Diacetylchitobiose als auch 4-Methylumbelliferyl ß-D-N, N', N"-triacetylchitotriose in 1x McIlvain Buffer bis zu einer Konzentration von je 500 m.
HINWEIS: Lagerlösung kann bei -20 °C für weitere Anwendungen gelagert werden; am besten in Aliquots gelagert. - Standard, 4-Methylumbelliferon, auf eine Konzentration von 0,1 mM im Stop-Puffer (Mischung aus 0,3 m Glycin und NaOH (12,0 g/l bei pH 10,6)) auflösen, um die Standard-Kurvenstammlösung zu erstellen.
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Erstellen und verkleben Sie die Arbeitslösung.
- Kombinieren Sie 1x McIlvain Buffer und Chitin Substrat 4-Methylumbelliferyl-D-N, N'-Diacetylchitobiose, um die Arbeitslösung zu schaffen. Für 10 Proben 100 l Substrat mit 2,17 ml 1x McIlvain-Puffer mischen. Weitere Berechnungen, die auf dem Stichprobenumfang basieren, finden Sie in Tabelle 1.
HINWEIS: Verwenden Sie 4-Methylumbelliferyl ß-D-N, N', N"-Triacetylchitotriose für menschliche Proben. Während beide Substrate entweder durch menschliche oder Mausenzyme zerkpft werden können, wurden sie entweder für menschliche oder Mausproben auf der Grundlage der Effizienz der Spaltung6zugeordnet. - Pipette 95 l Arbeitslösung in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte.
- Kombinieren Sie 1x McIlvain Buffer und Chitin Substrat 4-Methylumbelliferyl-D-N, N'-Diacetylchitobiose, um die Arbeitslösung zu schaffen. Für 10 Proben 100 l Substrat mit 2,17 ml 1x McIlvain-Puffer mischen. Weitere Berechnungen, die auf dem Stichprobenumfang basieren, finden Sie in Tabelle 1.
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Fügen Sie der Arbeitslösung Biospecimenproben hinzu.
- Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 5 l der Testprobe (Blut/BAL/Gewebelysat/andere biologische Flüssigkeit) hinzu.
- Mischen Sie die Probe in die Arbeitslösung, um die genauesten und zuverlässigsten Ergebnisse zu erzielen.
HINWEIS: Die Proben sollten in Duplikaten/Triplicaten ausgeführt werden, wobei den potenziellen Kanteneffekten besondere Aufmerksamkeit gewidmet wird. Alle Proben sollten vorgewärmt werden, um den Kanteneffekt zu minimieren. Da der Test eine Reaktion zwischen Chitinasen in der Probe und Substrat in der Arbeitslösung beinhaltet, ist es am besten, relativ schnell zu arbeiten, um den Zeitunterschied zwischen der Vergoldung der ersten Probe und der letzten Probe plattiert zu minimieren. Mehrkanalpipetten werden empfohlen.
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Bei 37 °C inkubieren.
- Die Platte bedecken und kurz schütteln (5 s).
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 15 min. Dies ermöglicht die enzymatische Reaktion.
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Bereiten Sie die Standardkurve vor.
- Während die Proben inkubieren, bereiten Sie eine serielle Verdünnung von 4-Methylumbelliferon vor, einem Standard, der häufig bei der fluorimetrischen Bestimmung der Enzymaktivität verwendet wird.
- Verdünnen Sie den Vorrat der Standardlösung im Stop-Puffer auf eine Konzentration von 5 m.
- Führen Sie eine Reihe von Verdünnungen durch, wie in Tabelle 2angegeben. Fügen Sie die Komponenten in der angegebenen Menge hinzu und mischen Sie sie gut.
HINWEIS: Die Standardkurve trägt dazu bei, dass gemessene Proben in den linearen Bereich der Standardkurve fallen.
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Stoppen Sie die Reaktion mit Stopppuffer.
- Fügen Sie jedem Bohrwert 200 L Stop-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
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Plate die Standards.
- Fügen Sie 300 l jedes Standards pro Brunnen in Duplikaten auf der gleichen Platte hinzu.
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Lesen Sie die Platte mit einem fluorometrischen Lesegerät.
- Lesen Sie die Platte bei einer Anregung von 360 nm und einer Emission von 455 nm.
3. Datenanalyse
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Subtrahieren der Leerzeichen
- Durchschnitt der Werte der doppelten Standardverdünnungen, die kein 4-Methylumbelliferon haben. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen aufgezeichneten Werten.
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Nehmen Sie den Durchschnitt der technischen Replikationen und zeichnen Sie die Standards.
- Durchschnittlich die beiden Messwerte für jede Konzentration und grafisch den durchschnittlichen Messwert nach Konzentration.
HINWEIS: Das resultierende Diagramm sollte linear aussehen und einen R2-Wert nahe 1 aufweisen. Ist dies nicht der Fall, kann es erforderlich sein, die Standards zu wiederholen und die Platte erneut zu lesen, um die Qualität der Datenanalyse zu gewährleisten.
- Durchschnittlich die beiden Messwerte für jede Konzentration und grafisch den durchschnittlichen Messwert nach Konzentration.
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Standardisieren Sie die Auslesewerte.
- Erstellen Sie eine am besten passende Linie für die dargestellten Standarddaten. Teilen Sie die Auslesungen der Proben durch die Neigung der am besten passenden Linie.
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Vergleichen Sie Werte aus Steuerelementgruppe und Variablengruppe.
- Verwenden Sie einen t-Test oder ANOVA für mehr als zwei Gruppen, um zu bestimmen, ob der Unterschied zwischen Gruppen statistisch signifikant ist. Die Werte nehmen die Einheiten nmol/mL.h.
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Representative Results
Die hier gezeigten Ergebnisse stammen aus einer Studie zur Messung der Chitinase-Aktivität in Serum- und BAL-Proben des wilden Typs (C57BL/6) und der transgenen Chit1-Mäuse (auf C57BL/6-Hintergrund), die das Chit1-Gen auf einem Doxycyclin-Promotor überexprimieren. Unsere Daten zeigen, dass sowohl Serum- als auch BAL-Proben eine nachweisbare Chitinase-Aktivität bei Derkgrundwerten von 698,2 x 189,9 nmol/ml und 485,7 x 114 nmol/ml-h aufweisen. Die Überexpression des Chit1-Gens unter Verwendung von Doxycyclin im Trinkwasser für 4 Wochen führte zu einer Erhöhung der Chitinase-Aktivität, die sowohl in DER BAL-Aktivität (4.575 x 673,8 nmol/mL-h, p = 0,003) als auch im Serum 1556 n51,2 nmol/mL-h, p = 0,0272, im Vergleich zur Basislinie, beobachtet wurde. ) Proben.
Anhand des hier beschriebenen Protokolls bestätigt der Assay, dass eine Überexpression des Chit1-Gens bei Mäusen zu einer erhöhten Chitinase-Aktivität führt. Ein t-Test wurde verwendet, um die Mittel der beiden Gruppen zu vergleichen. Jede Gruppe enthielt 5 Mäuse.
Abbildung 1: Chitinase-Aktivität. Die Chitinase-Aktivität wurde im (A) Serum und der (B) Bronchoalveolar-Lavageflüssigkeit des wilden Typs (WT) und Der Chitotriosidase (ChitTg) gemessen, die transgene Mäuse überausdrücken. Jeder Punkt stellt ein einzelnes Mausbeispiel dar. (C) Die Werte wurden mit der linearen Wertlinie der Standardkurve, wie im Protokoll beschrieben, standardisiert. Fluoreszenzwerte wurden mit einem Plattenleser bei einer Wellenlänge von 360 nm zur Anregung und 455 nm für die Emission gemessen und als AU dargestellt. AU = beliebige Einheit *p < 0,05, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Anzahl der Probenbrunnen | Substrat (L) | McIlvain Puffer (ml) |
| 20 | 100 | 2.17 |
| 50 | 250 | 5.425 |
| 100 | 500 | 10.85 |
Tabelle 1: Beispielberechnungen zum Erstellen der Arbeitslösung.
| (L) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Conc. (nM) | 0 | 125 | 250 | 375 | 500 | 625 | 750 | 875 |
| norm | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 |
| 2x McIlvian | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| Destilliert H2O | 200 | 180 | 160 | 140 | 120 | 100 | 80 | 60 |
| Stop-Puffer | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
Tabelle 2: Verdünnungen für Standardkurvenmessungen.
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Discussion
Chitinase-Aktivität hat sich als wichtiger Biomarker für die Vorhersage der Schwere der Krankheit, Krankheitsprogression, therapeutische Wirksamkeit und das Vorhandensein von spezifischen Krankheitserregern18. Obwohl viele der lang postulierten Theorien über die Rolle von Chitinasen nicht experimentell nachgewiesen wurden19, neue Studien haben wichtige Einblicke in die Rolle von Chitinasen und Chitinase wie Proteine in verschiedenenKrankheiten2 , 9,20.
Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, schnelle und effektive Möglichkeit, die Chitinase-Aktivität in biologischen Proben zu messen. Wenig bis gar keine Änderung ist erforderlich, um die Chitinase-Aktivität in einer Vielzahl von biologischen Proben und Arten aufgrund der stark konservierten Natur von Chitinasen zu messen. In diesem Protokoll sind zwei Substrate aufgeführt, von denen eines für Mausproben und eines für menschliche Proben bestimmt ist; Beide Substrate können jedoch auf beiden Arten verwendet werden, da sie als solche bezeichnet wurden, basierend auf früheren Papieren, die die Effizienz der Enzyme, mit denen die Enzyme das Substrat spalten können, demonstriert haben.
Im Vergleich zu bisher existierenden Techniken, wie dem Schales-Verfahren und der DNS-Methode, entfällt der hier skizzierte Assay den Bedarf an zeitintensiven Schritten wie Kochen oder Erhitzen, die bei älteren Methoden notwendig waren. Darüber hinaus ist der Test weniger technisch schwierig und erfordert weniger komplizierte Schritte als vorhergehende Messtechniken. Für beste Ergebnisse sollten sowohl biologische als auch technische Repliken verwendet werden.
Wenn die Chitinase-Aktivität zu hoch ist, reichen Verdünnungen der biologischen Probe aus, um die Chitinase-Aktivität für die Messung zu reduzieren, und die wahren Werte können auf der Grundlage der Verdünnung berechnet werden. Bei der Durchführung dieses Experiments an neuen biologischen Proben kann es hilfreich sein, wiederholungswerte Messungen auf derselben Platte im Laufe der Zeit bis zur Sättigung durchzuführen, um eine angemessene Inkubationszeit für beste Ergebnisse zu gewährleisten. Darüber hinaus kann das Protokoll nach oben oder unten skaliert werden, solange die Konsistenz zwischen den Gruppen erhalten bleibt. Die künftigen Anwendungen dieses Protokolls sind weitreichend, da die Forschung gerade in der Rolle der Chitinase-Aktivität bei einer Reihe von Krankheiten ankommt.
Eine der ersten Kategorien von Krankheiten, die Chitinase-Aktivität wurde gefunden, um relevant bei war lysosomale Speicherkrankheiten einschließlich Gaucher-Krankheit, Niemann-Pick A/B und C, GM-1-Gangliosidose, und viele andere21. Die Gaucher-Krankheit ist eine lysosomale Speicherkrankheit, die durch unzureichende Aktivität der Glucocerebrosidase verursacht wird und durch den Aufbau von Glucosylceramid, dem Substrat von Glucocerebrosidase, im Lysom von Makrophagen15gekennzeichnet ist. Es ist eine genetische Krankheit, mit klinischen Symptomen, die Milz und Lebervergrößerung, niedrige Thrombozytenzahl, Anämie, Müdigkeit und Knochenproblemegehören 22. Klinische Forschung hat gezeigt, dass die Mehrheit der Menschen, die an Gaucher-Krankheit leiden, eine mediane Chitinase-Aktivität haben, die mehr als 600 Mal dem Medianwert normaler Freiwilliger ist; Darüber hinaus, wenn Menschen mit Gaucher-Krankheit auf Enzym-Supplementierungstherapie gesetzt wurden – die aktuelle Behandlung für die Krankheit – ihre Chitinase-Aktivität ebenen deutlich verleihen Chitinase-Aktivität ein ausgezeichneter Marker für beide Krankheiten Progressions- und Behandlungsüberwachung15. Für Chit1 wurde jedoch noch keine Rolle bei der Krankheit gefunden. Ähnliche Forschungen haben zu Chit1 AktivitätSüberwachung für zahlreiche andere lysosomale Speicherkrankheiten10geführt.
Darüber hinaus haben weitere Forschungen eine mögliche Rolle für die Chit1-Aktivität während verschiedener Krankheitserreger-Infektionen wie Pilzinfektionen, Malaria, Tuberkulose und K. pneumoniae gezeigt, um nur einige2,3,10 zu nennen. . Eine Studie aus dem Jahr 2012 ergab, dass die Chitinase-Aktivität bei Patienten mit aktiver Tuberkulose-Infektion (TB) erhöht war, selbst wenn der Sputumabstrich negativ war, was darauf hindeutet, dass die Chitinase-Aktivität als wirksamer Biomarker in der TB-Diagnose verwendet werden könnte, lange Wartezeit, die oft notwendig ist, um die Krankheit genau zu diaguntocieren23. Ähnliche Befunde wurden während der Plasmodium falciparum Infektion gesehen, mit Chitotriosidase Serumspiegel deutlich erhöht bei denen mit akuter Infektion24. Während viele dieser Krankheiten Tage dauern, um zu diagnostizieren, schnelle Messungen der Chitinase-Aktivität im Blut können nützliche Einblicke in die Diagnose liefern. Darüber hinaus kann die Messung der Chitinase-Aktivität im Serum bei der Überwachung der Behandlung in Echtzeit helfen, da Malariaparasiten und Tuberkulosebakterien zunehmend resistent gegen Behandlungen werden.
Immer mehr Forschung hat begonnen, sich auf die Rolle von Chitinase und Chitinase-ähnlichen Proteinen in der Immunantwort zu konzentrieren, insbesondere ihre Rolle in entzündungshemmenden Bahnen. Während diese Forschung weitergeht, wird dieses Protokoll eine schnelle und genaue Messung dieser Chitinase-Aktivität ermöglichen, um die Forschung weiter zu erforschen. Das Protokoll ist leicht für eine beliebige Anzahl von Artenproben einschließlich Maus und Mensch angepasst, so dass es weit verbreitet.
Neben dem Forschungsnutzen werden bessere Methoden zum Nachweis und zur Messung der Chitinase-Aktivität in Proben im klinischen Bereich von Vorteil sein. Jüngste Forschungen haben die Rolle der Chitinase als Biomarker in der Pathologie zahlreicher chronischer Krankheiten wie Gaucher-Krankheit, Diabetes mellitus, Sarkoidose, Arteriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen undKrebserkrankungen 3 , 21,25,26.
Aufgrund dieser Rolle als Biomarker ist eine schnelle und genaue Messung der Chitinase-Aktivität, wie hier gezeigt, für den Bereich der Medizin unglaublich relevant, so dass Gesundheitsdienstleister mehr Informationen für einen richtigen Diagnose- und Behandlungsplan haben können.
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Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der American Lung Association und der American Thoracic Society Awards an LS unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Jack Elias und Dr. Chun Geun Lee aufrichtig für die Bereitstellung transgener Mausstämme danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
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