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Immunology and Infection

Misurazione dell'attività della chitinasi nei campioni biologici

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/60159
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Presentato qui è un metodo semplice per misurare l'attività delle chitinasi nei fluidi biologici come la lavanda bronchoalveolare o il siero.

Abstract

Le chitinasi sono gli enzimi che fendono la chitina. Anche in assenza di chitina, i mammiferi hanno quantità significative di chitinasi presenti nel corpo anche al basale. Il ruolo preciso della chitinasi non è noto, tuttavia si credeva che svolgesse un ruolo importante nella digestione e nella difesa dell'ospite contro il cibo e gli agenti patogeni che contengono la chitina, rispettivamente. Recenti lavori, tra cui il nostro, hanno mostrato un ruolo importante della chitinasi e delle proteine simili alla chitinasi nell'immunità dell'ospite e nelle malattie allergiche. È importante sottolineare che le attività di chitinasi fungono da importanti biomarcatori della gravità della malattia in un'ampia gamma di malattie, tra cui malattie infiammatorie di tipo 2 come l'asma e la fibrosi polmonare. Allo stesso modo, i pazienti con disturbi genetici come la malattia di Gaucher hanno livelli di chitinasi significativamente elevati, che non solo correlano con la gravità della malattia, ma servono anche come un biomarcatore affidabile per l'efficacia terapeutica. Il protocollo qui descritto descrive un modo semplice, rapido e diretto per misurare l'attività delle chitinasi in campioni di BAL o siero di topi e può essere ampiamente adattato a soggetti umani e altri organismi modello a causa della natura altamente conservata degli enzimi.

Introduction

La chitina è il secondo polisaccaride più abbondante sulla terra dopo la cellulosa, servendo come componente strutturale principale di una varietà di organismi tra cui l'esoscheletro di insetti, funghi, lieviti e alghe; alcuni vertebrati hanno anche la chitina1. Le chitinasi sono una famiglia di enzimi che sono in grado di abbattere la chitina e sono altamente conservati durante tutta l'evoluzione in specie che vanno dai batteri ai mammiferi2,3. Oltre alle chitinasi, i mammiferi hanno anche proteine simili alla chitinasi che sono simili alle chitinasi nella loro capacità di legare la chitina, ma differiscono in quanto mancano di capacità enzimatica di fendere la chitina4 .

Anche se le chitine e le chitinasi sono state studiate da tempo, con indagini risalenti ai primi anni del 1900, l'attenzione principale è stata sul loro ruolo negli insetti e in altri invertebrati. Infatti, non è stato fino al 1960, quando i vertebrati sono stati trovati ad avere chitinasi a tutti. Utilizzando un saggio a base di chitobiasi, è stato dimostrato che le chitinasi si trovano nel tratto digestivo di un certo numero di vertebrati, tra cui lucertole e merli, un'osservazione ipotizzata sia dovuta al consumo di organismi contenenti chitina come gli insetti5 .

I mammiferi hanno due forme enzimaticamente attive di chitinasi: chitinasi dei mammiferi acidi (AMCase, noti anche come CHIT2 e CHIA) e chitotriosidasi (CHIT1)4. Entrambe queste proteine sono in grado di chitina idrolmente. Tuttavia, CHIT1 è più enzimaticamente attivo negli esseri umani, dove quasi tutta l'attività della chitinasi è derivata da CHIT1. 4 Nei topi, sia Chit1 che AMCase contribuiscono quasi equamente all'attività complessiva della chitinasi6. D'altra parte, le proteine simili alle chitinasi non hanno attività di chitinasi.

Chit1 è principalmente secreto dai macrofagi ed è spesso considerato una risposta immunitaria agli agenti patogeni contenenti chitina7. È stato anche dimostrato che l'enzima è coinvolto nella maturazione dei monociti in sottotipi di macrofagio M1 e M2, anche senza la presenza del substrato chitina8. Inoltre, può anche essere coinvolto nella maturazione di altre cellule immunitarie tra cui cellule T helper di tipo 2 (Th2) ed eosinofili, come è stato dimostrato di essere il caso in infezione polmonare criptococcale9. Questi studi indicano un ruolo complesso delle chitinasi nel sistema immunitario.

Negli ultimi anni, i livelli di Chit1 sono stati trovati come un importante biomarcatore della progressione per oltre 40 diverse malattie umane, tra cui malattie da accumulo lisosomiale, malattie infettive, malattie respiratorie, malattie endocrinologiche, malattie cardiovascolari malattie neurologiche e altre (riviste10). In molte di queste malattie, i livelli di Chit1 sono un forte predittore di gravità della malattia e l'efficacia terapeutica10.

Come chitinasi hanno guadagnato una reputazione come biomarcatore per numerose condizioni mediche tra cui malattia di Gaucher, strumenti e saggi sono stati sviluppati per facilitare i test per la presenza di chitinasi. I metodi più vecchi includono la procedura di Schales, un protocollo adattato da un test della glicemia e il metodo 3,5 dell'acido dinitrosalicilico (DNS). Tuttavia, questi metodi sono spesso sensibili al tempo e tecnicamente difficili11. La procedura per entrambi questi test richiede la riduzione di ossidanti inorganici, ferricianide nel caso della procedura di Schales, ad esempio, producendo un cambiamento di colore che può essere misurato solo spettrofotometricamente. Inoltre, entrambi i test comportano una fase di riscaldamento o ebollizione che richiede tempo e necessaria per lo sviluppo del colore12,13.

Descritto qui è un rapido e semplice saggio fluorimetrico per determinare i livelli di chitinasi nei campioni di mammiferi14,15. Due dei campioni qui utilizzati includono fluidi di lavaggio del siero e del bronchoalveolar (BAL); L'attività della chitinasi è stata misurata anche in campioni di latte materno e urina, e la tecnica può essere eseguita in quel tipo di campioni così come in qualsiasi altro fluido biologico16,17.

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Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite nell'ambito di un protocollo approvato dall'IACUC presso la Yale University School of Medicine.

1. Collezione di campioni di mouse

  1. Anestesizzazione
    1. Anestesizza reati con ketamina e xylazina (100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilanina).
  2. Raccolta di campioni di sangue
    1. Confermare la profondità dell'anestesia per non risposta a un pizzico di dita dei dei dei idi.
    2. Aprire chirurgicamente la cavità toracica per esporre il cuore.
    3. Inserire un ago da 26,5 G nel ventricolo sinistro e raccogliere il sangue in una siringa.
      NOT: Tipicamente, circa 0,5-1 mL di sangue può essere raccolto da un topo sano 20-25 g.
    4. Raccogliere il sangue in tubi eparanidati, per la raccolta del plasma, o tubi non eparanidati per la raccolta del siero.
  3. Raccolta di liquido di lavalanga bronchoalveolar (BAL)
    1. Per raccogliere il BAL, fare un taglio verticale sul collo per esporre la trachea.
    2. Cannula con un catetere da 22 G e fissala saldamente con una corda per evitare perdite dal naso del mouse.
    3. Iniettare lentamente due aliquote di salina sterile con buffer di fosfato (PBS, 0,75 mL ciascuna) nei polmoni attraverso la trachea e recuperare indietro.
    4. Piscina aliquote e tenere sul ghiaccio per ulteriori analisi.
  4. Lavorazione dei campioni biologici.
    1. Campione di sangue: fresco (plasma) o dopo aver permesso la coagulazione per 4 h (siero), centrifugare a 600 x g per 10 min. Prendere il super-ataldiante e sia congelare per lo stoccaggio o utilizzare per l'esperimento.
    2. BAL: Centrifugare il campione a 350 x g per 5 min. Prendere il super-ataldiante e sia congelare per lo stoccaggio o utilizzare per l'esperimento.

2. Chitinasi Assay

NOT: La scienza dietro l'analisi è relativamente semplice. Un substrato non fluorescente viene scisso dalla chitinasi enzimaticamente attiva per produrre un prodotto fluorescente, che viene poi misurato come marcatore indiretto dell'attività della chitinasi. Le chitinasi all'interno dei campioni scompongono il substrato 4-metillumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose presente nel tampone 1x McIlvain. Viene rilasciata una molecola fluorescente a 4 metillumbelliferyl. Misurando la fluorescenza totale di ogni pozzo, otteniamo una misurazione accurata della chitinasi attiva in ogni campione. Poiché la ripartizione della chitinasi da chitinasi è una reazione idrolitica, il buffer di stop, una miscela di 0,3 M glicina e NaOH (12,0 g/L a pH 10,6), termina la ripartizione della chitina creando un ambiente troppo semplice per il funzionamento dell'enzima.

  1. Preparare i substrati, gli standard e le soluzioni.
    1. Preparare il buffer McIlvain. McIlvain Buffer è composto da 0,1 M citrato e 0,2 M fosfato a un pH di 5,2. Diluire a un rapporto di 1:1 per 1x buffer McIlvain.
    2. Sciogliere sia 4-metilbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose e 4-metilbelliferyl-D-N, N', N"-triacetylchitotriose in 1x McIlvain Buffer a una concentrazione di 500 m ciascuno.
      NOT: La soluzione di riserva può essere immagazzinata a -20 gradi centigradi per ulteriori usi; meglio conservato in aliquote.
    3. Sciogliere lo standard, 4-metilbelliferone, ad una concentrazione di 0,1 mM in stop buffer (miscela di 0,3 M glicina e NaOH (12,0 g/L a pH 10.6)) per creare la soluzione standard di stock di curve.
  2. Creare e piastrare la soluzione di lavoro.
    1. Unire 1x McIlvain Buffer e substrato di chitina 4-metilbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose per creare la soluzione di lavoro. Per ogni 10 campioni, mescolare 100 l di substrato con 2,17 mL di 1x buffer McIlvain. Vedere la tabella 1 per ulteriori calcoli in base alle dimensioni del campione.
      NOT: Utilizzare 4-metilbelliferyl -D-N, N', N"-triacetylchitotriose per campioni umani. Mentre entrambi i substrati possono essere sciolti da enzimi umani o murini, sono stati assegnati per campioni umani o murini in base all'efficienza della scissione6.
    2. Pipette 95 -L di soluzione di lavoro in ogni pozzo di una piastra 96-po.
  3. Aggiungere campioni di biocampioni alla soluzione di lavoro.
    1. Aggiungete quindi 5 volte il campione di prova (liscia esmatica/BAL/tessuto/altro fluido biologico) ad ogni pozzo.
    2. Mescolare il campione nella soluzione di lavoro per ottenere risultati più accurati e affidabili.
      NOT: I campioni devono essere eseguiti in duplicati/triplicati con particolare attenzione ai potenziali effetti del bordo. Tutti i campioni devono essere preriscaldati per ridurre al minimo l'effetto bordo. Poiché il test comporta una reazione tra le chitinasi nel campione e il substrato nella soluzione di lavoro, è meglio lavorare relativamente rapidamente per ridurre al minimo la differenza di tempo tra quando il primo campione viene placcato e l'ultimo campione viene placcato. Si consiglia la pipetta multicanale.
  4. Incubare a 37 gradi centigradi.
    1. Coprire la piastra e agitare brevemente (5 s).
    2. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 15 min. Questo permette la reazione ezimatica a prendere posto.
  5. Preparare la curva standard.
    1. Mentre i campioni sono in cuba, preparare una diluizione seriale di 4-metilumbelliferone, uno standard spesso utilizzato nella determinazione fluorimetrica dell'attività enzimatica.
    2. Diluire lo stock della soluzione standard in stop buffer ad una concentrazione di 5 M.
    3. Eseguire una serie di diluizioni come indicato nella tabella 2. Aggiungere i componenti nella quantità indicata e mescolare bene.
      NOT: La curva standard aiuta a garantire che i campioni misurati rientrino nell'intervallo lineare della curva standard.
  6. Interrompere la reazione con stop buffer.
    1. Aggiungere 200 l di stop buffer a ogni pozzo per fermare la reazione.
  7. Piastrare gli standard.
    1. Aggiungere 300 l of ogni standard per pozzo in duplicati sulla stessa piastra.
  8. Leggere la piastra utilizzando un lettore fluorometrico.
    1. Leggere la piastra con un'eccitazione di 360 nm e un'emissione di 455 nm.

3. Analisi dei dati

  1. Sottrarre gli spazi vuoti
    1. Calcolare la media dei valori delle diluizioni standard duplicate che non hanno 4-metilbellione. Sottrarre questo valore da tutti gli altri valori registrati.
  2. Prendere la media di repliche tecniche e tracciare gli standard.
    1. Calcolare la media delle due letture per ogni concentrazione e rappresentare graficamente la lettura media per concentrazione.
      NOT: Il grafico risultante dovrebbe avere un valore R2 vicino a 1. In caso contrario, potrebbe essere necessario rifare gli standard e rileggere la piastra per garantire la qualità dell'analisi dei dati.
  3. Standardizzare i valori di lettura.
    1. Creare una linea di adattamento per i dati degli standard tracciati. Dividere le letture dei campioni per la pendenza della linea di adattamento.
  4. Confrontare i valori del gruppo di controllo e del gruppo di variabili.
    1. Utilizzare un test t o ANOVA, per più di due gruppi, per determinare se la differenza tra i gruppi è statisticamente significativa. I valori accettano le unità nmol/mL'h.

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Representative Results

I risultati mostrati di seguito provengono da uno studio che misura l'attività della chitinasi nei campioni di siero e BAL di tipo selvatico (C57BL/6) e topi transgenici Chit1 (su sfondo C57BL/6) che sovraesprimono il gene Chit1 su un promotore di doxyciclina. I nostri dati mostrano che sia i campioni di siero che di BAL hanno attività di chitinasi rilevabili in base alla linea di base 698,2 x 189,9 nmol/mL-h e 485,7 x 114 nmol/ml-h, rispettivamente. La sovraespressione del gene Chit1 che utilizza la doxycycline nell'acqua potabile per 4 settimane ha portato all'elevazione dell'attività della chitinasi osservata sia in BAL (4.575 - 673,8 nmol/mL,h, p - 0,003) che nel siero 1556 - 251,2 nmol/mL ) campioni.

Utilizzando il protocollo qui descritto, il test conferma che la sovraespressione del gene Chit1 nei topi determina un aumento dell'attività delle chitinasi. È stato utilizzato un test t per confrontare i mezzi dei due gruppi. Ogni gruppo conteneva 5 topi.

Figure 1
Figura 1: Attività della chitinasi. L'attività dei chitinasi è stata misurata nel siero (A) e nel liquido di lavaggio bronchoalveolar (B) di tipo selvatico (WT) e chitotriosidase (ChitTg) di mouse transgenico sovraespresso. Ogni punto rappresenta un singolo campione di mouse. (C) I valori sono stati standardizzati utilizzando la linearità della curva standard come descritto nel protocollo. I livelli di fluorescenza sono stati misurati utilizzando un lettore di lastre a lunghezza d'onda di 360 nm per l'eccitazione e di 455 nm per l'emissione e presentato come AU. AU: unità arbitraria :p < 0,05, p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Numero di pozze di campionamento Substrato (L) Buffer McIlvain (mL)
20 100 2.17
50 250 5.425
100 500 10.85

Tabella 1: calcoli di esempio per la creazione della soluzione di lavoro.

(L) (L) 1 2 3 4 5 6 7 8
Conc. (nM) 0 125 250 375 500 625 750 875
scala di valori 0 20 40 60 80 100 120 140
2x McIlvian 200 200 200 200 200 200 200 200
Distillato H2O 200 180 160 140 120 100 80 60
Arresta buffer 400 400 400 400 400 400 400 400

Tabella 2: diluizioni per le misurazioni standard delle curve.

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Discussion

L'attività della chitinasi è emersa come un importante biomarcatore per prevedere la gravità della malattia, la progressione della malattia, l'efficacia terapeutica e la presenza di specifici patogeni18. Anche se molte delle teorie a lungo postulate sul ruolo delle chitinasi non sono state provate sperimentalmente19, nuovi studi hanno fornito importanti informazioni sul ruolo delle chitinasi e della chitinasi come proteine in varie malattie2, 9,20.

Il protocollo qui descritto è un modo semplice, rapido ed efficace per misurare l'attività delle citinasi nei campioni biologici. Non è necessaria alcuna modifica per misurare l'attività delle chitinasi in un'ampia varietà di campioni e specie biologiche a causa della natura altamente conservata delle chitinasi. In questo protocollo sono elencati due substrati, uno dei quali come è stato designato per i campioni di topo e uno per i campioni umani; tuttavia, entrambi i substrati possono essere utilizzati su entrambe le specie, in quanto sono stati designati come tali sulla base della dimostrazione di documenti precedenti dell'efficienza con cui gli enzimi possono fendere il substrato.

Rispetto alle tecniche precedentemente esistenti, come la procedura di Schales e il metodo DNS, il test qui descritto elimina la necessità di passaggi che richiedono molto tempo, come l'ebollizione o il riscaldamento, che erano necessari nei metodi più vecchi. Inoltre, il test è meno difficile dal punto di vista tecnico e richiede meno passaggi complicati rispetto alle tecniche di misurazione precedenti. Per ottenere i migliori risultati, è necessario utilizzare repliche biologiche e tecniche.

Se l'attività della chitinasi è troppo elevata, le diluizioni del campione biologico sono sufficienti a ridurre l'attività della chitinasi per la misurazione e i valori reali possono essere calcolati in base alla diluizione. Quando si esegue questo esperimento su nuovi campioni biologici, può essere utile eseguire misurazioni ripetute sulla stessa piastra nel tempo fino alla saturazione per garantire un adeguato tempo di incubazione per ottenere i migliori risultati. Inoltre, il protocollo può essere scalato verso l'alto o verso il basso fino a quando rimane la coerenza tra i gruppi. Le future applicazioni di questo protocollo sono di vasta portata, poiché la ricerca sta solo riprendendo il ruolo dell'attività delle citinasi in una serie di malattie.

Una delle prime categorie di malattie in cui si è trovata che l'attività della chitinasi era rilevante in era malattie di stoccaggio lisosomiale tra cui la malattia di Gaucher, Niemann-Pick A/B e C, gangliosidosi GM-1, e molti altri21. La malattia di Gaucher è una malattia di stoccaggio lisosomiale causata da insufficiente attività di glucocerebrosidase ed è caratterizzata dall'accumulo di glucosilceramide, il substrato di glucocerebrosidase, nel lisosoma dei macrofagi15. È una malattia genetica, con sintomi clinici che includono milza e allargamento del fegato, basso numero di piastrine, anemia, affaticamento e problemi ossei22. La ricerca clinica ha dimostrato che la maggior parte delle persone affette dalla malattia di Gaucher ha un'attività di chitinasi mediana che è oltre 600 volte il valore mediano dei normali volontari di controllo; inoltre, quando le persone con malattia di Gaucher sono state sottoposte a terapia di completamento degli enzimi, l'attuale trattamento per la malattia, i livelli di attività della chitinasi sono diminuiti significativamente dell'attività di chitinasi per essere un eccellente marcatore di entrambe le malattie progressione e monitoraggio del trattamento15. Tuttavia, non è stato ancora riscontrato alcun ruolo per Chit1 nella malattia. Ricerche simili hanno portato al monitoraggio dell'attività di Chit1 per numerose altre malattie di stoccaggio lisosomiale10.

Inoltre, ulteriori ricerche hanno indicato un potenziale ruolo per l'attività di Chit1 durante varie infezioni patogene tra cui infezione fungina, malaria, tubercolosi e K. pneumoniae per citarne alcuni2,3,10 . Uno studio del 2012 ha scoperto che l'attività della chitinasi è stata elevata in pazienti con infezione da tubercolosi attiva (TB) anche quando lo striscio di espettorato era negativo, indicando che l'attività delle citinasi poteva essere utilizzata come biomarcatore efficace nella diagnosi della TB, lungo tempo di attesa che spesso è necessario per diagnosticare con precisione la malattia23. Risultati simili sono stati osservati durante l'infezione da Plasmodium falciparum, con i livelli di siero chitotriosidase significativamente aumentati in quelli con infezione acuta24. Mentre molte di queste malattie richiedono giorni per diagnosticare, misurazioni rapide dei livelli di attività della chitinasi nel sangue possono fornire informazioni utili nella diagnosi. Inoltre, man mano che i parassiti della malaria e il batterio della tubercolosi diventano sempre più resistenti ai trattamenti, misurare i livelli di attività della chitinasi nel siero può aiutare con il monitoraggio del trattamento per la sua efficacia in tempo reale.

Sempre più ricerca ha iniziato a concentrarsi sul ruolo della chitinasi e delle proteine simili alla chitinasi nella risposta immunitaria, in particolare il suo ruolo nelle vie infiammatorie. Mentre questa ricerca continua, questo protocollo consentirà una misurazione rapida e accurata di questa attività di chitinasi per ulteriori ricerche. Il protocollo è facilmente regolabile per qualsiasi numero di campioni di specie, compresi topi e umani, rendendolo ampiamente applicabile.

Oltre al beneficio della ricerca, metodi migliori per rilevare e misurare l'attività della chitinasi nei campioni saranno utili nel campo clinico. Recenti ricerche hanno dimostrato il ruolo della chitinasi come biomarcatore nella patologia di numerose malattie croniche tra cui la malattia di Gaucher, diabete mellito, sarcoidosi, aterosclerosi, malattia infiammatoria intestinale e tumori3, 21,25,26.

A causa di questo ruolo di biomarcatore, la misurazione rapida e accurata dell'attività della chitinasi, come mostrato qui, è incredibilmente rilevante per il campo della medicina, consentendo agli operatori sanitari di avere maggiori informazioni per una diagnosi corretta e un piano di trattamento.

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Disclosures

nessuno.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata supportata dall'American Lung Association e dai premi dell'American Thoracic Society alla LS. Gli autori vogliono sinceramente ringraziare il Dr. Jack Elias e il Dr. Chun Geun Lee per aver fornito ceppi di topi transgenici.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

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