Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

قياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

المعروضة هنا هي طريقة بسيطة لقياس نشاط الكيتيناز في السوائل البيولوجية مثل غسل القصبات الهوائية أو المصل.

Abstract

الكيتيناسيس هي الإنزيمات التي تلتشق الكيتين. حتى في غياب الكيتين، الثدييات لديها كميات كبيرة من الكيتيناالموجودة في الجسم بما في ذلك في خط الأساس. لا يعرف الدور الدقيق للكيتيناز، ولكن كان يعتقد أن تلعب دورا هاما في الهضم والدفاع المضيف ضد المواد الغذائية التي تحتوي على الكيتين ومسببات الأمراض، على التوالي. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة، بما في ذلك عملنا، دورا هاما من البروتينات مثل الكيتيناز والكيتينا في الحصانة المضيفة وأمراض الحساسية. الأهم من ذلك، أنشطة الكيتيناز بمثابة علامات حيوية هامة لشدة المرض في مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك الأمراض الالتهابية من النوع 2 مثل الربو والتليف الرئوي. وبالمثل، فإن المرضى الذين يعانون من اضطرابات وراثية مثل مرض Gaucher قد ارتفعت بشكل ملحوظ مستويات الكيتيناز، والتي لا ترتبط فقط مع شدة المرض ولكن أيضا بمثابة علامة حيوية موثوق بها للفعالية العلاجية. يصف البروتوكول الموضح هنا طريقة بسيطة وسريعة ومباشرة لقياس نشاط الكيتيناز في BAL أو عينات المصل من الفئران ويمكن تكييفها على نطاق واسع مع البشر والكائنات الحية النموذجية الأخرى بسبب الطبيعة المحفوظة للغاية للإنزيمات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الكيتين هو ثاني أكثر السكاريد وفرة على الأرض بعد السليلوز، وهو بمثابة مكون هيكلي رئيسي لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية بما في ذلك الهيكل الخارجي للحشرات والفطريات والخميرة والطحالب. بعض الفقاريات لديها أيضا الكيتين1. الكيتيناسيس هي عائلة من الإنزيمات التي هي قادرة على كسر الكيتين ويتم حفظها بشكل كبير في جميع أنحاء التطور في الأنواع التي تتراوح بين البكتيريا والثدييات2،3. بالإضافة إلى الكيتيناسيس ، الثدييات لديها أيضا البروتينات الشبيهة الكيتينازي التي تشبه الكيتيناسيس في قدرتها على ربط الكيتين ولكنها تختلف من حيث أنها تفتقر إلى القدرة الأنزيمية على شق الكيتين4.

على الرغم من أن الكيتين والكيتيناقد قد تمت دراستهما منذ فترة طويلة - مع التحقيقات التي يعود تاريخها إلى أوائل عام 1900 - كان التركيز الرئيسي على دورها في الحشرات واللافقاريات الأخرى. في الواقع، لم يكن حتى 1960s عندما تم العثور على الفقاريات أن يكون الكيتينا على الإطلاق. باستخدام إجراء بفحص قائم على الشيتوية، تبين أن الكيتيناس موجود في الجهاز الهضمي لعدد من الفقاريات بما في ذلك السحالي والطيور السوداء - وهي ملاحظة يفترض أنها ترجع إلى استهلاك الكائنات التي تحتوي على الكيتين مثل الحشرات5 .

الثدييات لها شكلان نشطان من الكيتيناز الأنزيمية: الكيتيناز الثدييات الحمضية (AMCase؛ المعروف أيضا باسم CHIT2 وCHIA) وchitotriosidase (CHIT1)4. كل من هذه البروتينات قادرة على تحلل الكيتين. ومع ذلك، CHIT1 هو أكثر نشاطا الأنزيمية في البشر، حيث تقريبا كل من نشاط الكيتيناز مشتق من CHIT1. 4 في الفئران، كل من Chit1 وAMCase تسهم على قدم المساواة تقريبا في النشاط الكيتينازي العام6. من ناحية أخرى، البروتينات الشبيهة الكيتيناز تفتقر إلى نشاط الكيتيناز.

تفرز Chit1 أساسا من قبل الضامة وغالبا ما تعتبر استجابة مناعية لمسببات الأمراض التي تحتوي على الكيتين7. وقد ثبت أيضا أن الإنزيم تشارك في نضج الخلايا الأحادية في كل من M1 و M2 الأنواع الفرعية الضامة، حتى من دون وجود الكيتين الركيزة8. وعلاوة على ذلك، فإنه قد تشارك أيضا في نضج الخلايا المناعية الأخرى بما في ذلك T مساعد نوع 2 (Th2) الخلايا والحمضات - كما تبين أن يكون الحال في عدوى الرئة cryptococcal9. وتشير هذه الدراسات إلى دور معقد من الكيتيناسيس في الجهاز المناعي.

في السنوات الأخيرة، تم العثور على مستويات Chit1 لتكون بمثابة علامة حيوية هامة للتقدم لأكثر من 40 أمراض بشرية مختلفة بما في ذلك أمراض التخزين الليسوسومية، والأمراض المعدية، وأمراض الجهاز التنفسي، وأمراض الغدد الصماء، والقلب والأوعية الدموية الأمراض، والأمراض العصبية، وغيرها (استعرض10). في العديد من هذه الأمراض، ومستويات Chit1 هي توقع قوي لشدة المرض والفعالية العلاجية10.

كما اكتسبت الكيتينا سمعة كعلامة حيوية للعديد من الحالات الطبية بما في ذلك مرض Gaucher، وقد وضعت أدوات واختبارات لتسهيل اختبار وجود الكيتيناز. وتشمل الأساليب القديمة إجراء Schales، بروتوكول تكييفها من اختبار الجلوكوز في الدم، وطريقة حمض الدينتيروساليك 3،5 (DNS). ومع ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون حساسة للوقت وصعبة من الناحية التقنية11. يتطلب الإجراء لكلا الاختبارين الحد من المواد المؤكسدة غير العضوية، الفيريسيد في حالة إجراء Schales على سبيل المثال، مما يؤدي إلى تغيير اللون الذي لا يمكن قياسه إلا من حيث الطيف. بالإضافة إلى ذلك، كلا الاختبارين ينطوي على التدفئة أو خطوة الغليان التي تستغرق وقتا طويلا وضرورية للون لتطوير12،13.

وصف هنا هو اختبار الفلورة سريعة وبسيطة لتحديد مستويات الكيتينازي في عينات الثدييات14،15. اثنين من العينات المستخدمة هنا تشمل المصل وسوائل غسل القصبات الهوائية (BAL)؛ كما تم قياس نشاط الكيتيناز في عينات حليب الثدي والبول، ويمكن إجراء هذه التقنية في هذا النوع من العينات وكذلك في أي سائل بيولوجي آخر16،17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد أجريت جميع الإجراءات الحيوانية بموجب بروتوكول وافق عليه المركز في كلية الطب بجامعة ييل.

1. مجموعة عينة الماوس

  1. التخدير
    1. تخدير الفئران باستخدام الكيتامين والإكسلازين (100 ملغ/كغ من الكيتامين و10 ملغ/كغ من إكسلازين).
  2. جمع عينات الدم
    1. تأكد من عمق التخدير بعدم الاستجابة لقرصة اصبع القدم.
    2. فتح تجويف الصدر جراحيا لفضح القلب.
    3. أدخل إبرة 26.5 غرام في البطين الأيسر وجمع الدم في حقنة.
      ملاحظة: عادة، يمكن حصاد حوالي 0.5-1 مل من الدم من فأر صحي 20-25 غرام.
    4. جمع الدم في أنابيب الهيبارية، لجمع البلازما، أو أنابيب غير الهيبارية لجمع المصل.
  3. مجموعة من سائل غسل القصبات الهوائية (BAL)
    1. لجمع BAL، وجعل قطع عمودي على الرقبة لفضح القصبة الهوائية.
    2. قم باستئصال القصبة الهوائية بقسطرة 22 G وتأمينها بقوة باستخدام سلسلة من أجل منع التسرب من أنف الماوس.
    3. حقن ببطء اثنين من aliquots من محلول الفوسفات المعقمة المخزنة بالوقود (PBS، 0.75 مل لكل منهما) في الرئتين عن طريق القصبة الهوائية واسترداد مرة أخرى.
    4. تجمع aliquots والحفاظ على الجليد لمزيد من التحليل.
  4. معالجة العينات البيولوجية.
    1. عينة الدم: إما طازجة (البلازما) أو بعد السماح التخثر لمدة 4 ح (المصل)، الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقائق. خذ supernatant وإما تجميد للتخزين أو استخدامها للتجربة.
    2. BAL: الطرد المركزي العينة في 350 × ز لمدة 5 دقائق. خذ supernatant وإما تجميد للتخزين أو استخدامها للتجربة.

2. تشيتيناسي أسي

ملاحظة: العلم وراء اختبار بسيط نسبيا. يتم شق الركيزة غير الفلورية بواسطة الكيتيناز النشط الأنزيمية لإنتاج منتج فلورسنت، والذي يقاس بعد ذلك كعلامة غير مباشرة لنشاط الكيتيناز. الكيتيناسيس داخل العينات كسر الركيزة 4-ميثيلومبيالريل-د-N، N'-diacetylchitobiose موجودة في المخزن المؤقت McIlvain 1X. يتم إطلاق جزيء الفلورسنت 4-ميثيلومبيالميريل. من خلال قياس الفلورة الكلي لكل بئر، نحصل على قياس دقيق للكيتيناز النشط في كل عينة. لأن انهيار الكيتين عن طريق الكيتينا هو رد فعل مائي، وقف العازلة، خليط من 0.3 M الجلايسين وهيدروكسين (12.0 غرام / لتر في درجة الحموضة 10.6)، ينتهي انهيار الكيتين عن طريق خلق بيئة أساسية جدا للإنزيم للعمل.

  1. إعداد الركائز والمعايير والحلول.
    1. جهزوا مخزن (ماكيلفين) المؤقت يتكون المخزن المؤقت McIlvain من 0.1 M سيترات و 0.2 M الفوسفات عند درجة الحموضة من 5.2. تمييع بنسبة 1:1 ل1x McIlvain العازلة.
    2. حل كل من 4-ميثيلومبيالميريل-د-N، ن-diacetylchitobiose و 4-ميثيلومبيالريلريل ß-D-N، N'، N"-triacetylchitotriose في 1X McIlvain العازلة إلى تركيز 500 درجة مئوية لكل منهما.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدامات؛ أفضل المخزنة في aliquots.
    3. حل القياسية، 4-methylumbelliferone، إلى تركيز 0.1 mM في وقف العازلة (خليط من 0.3 M الجلايسين وهيدروكسيد الصوديوم (12.0 غرام / لتر في درجة الحموضة 10.6)) لإنشاء الحل القياسية منحنى الأسهم.
  2. إنشاء لوحة الحل العمل.
    1. الجمع بين 1X McIlvain العازلة والشيتين الركيزة 4-ميثيلومبيالميريل-D-N، N'-diacetylchitobiose لخلق حل العمل. لكل 10 عينات، مزيج 100 درجة مئوية من الركيزة مع 2.17 مل من 1X McIlvain العازلة. انظر الجدول 1 للاطلاع على حسابات إضافية استناداً إلى حجم العينة.
      ملاحظة: استخدام 4-ميثيلومبيلميريل ß-D-N، N'، N"-triacetylchitotriose للعينات البشرية. في حين أن كلا الركائز يمكن أن تكون مشعبة إما من قبل إنزيمات الإنسان أو الماوس، وقد تم تعيينها إما لعينات الإنسان أو الماوس على أساس كفاءة الانقسام6.
    2. ماصة 95 درجة مئوية من حل العمل في كل بئر من لوحة 96 جيدا.
  3. إضافة عينات من العينات الحيوية إلى حل العمل.
    1. بعد ذلك، أضف 5 ميكرولتر من عينة الاختبار (الدم/BAL/lysate الأنسجة/السوائل البيولوجية الأخرى) إلى كل بئر.
    2. امزج العينة في حل العمل للحصول على نتائج أكثر دقة وموثوقية.
      ملاحظة: وينبغي تشغيل العينات في التكرارات/الثلاثية مع إيلاء اهتمام خاص للآثار المحتملة على الحافة. يجب أن تكون جميع العينات قبل تسخينها لتقليل تأثير الحافة. كما ينطوي على فحص رد فعل بين الكيتينافية في العينة والركيزة في حل العمل، فمن الأفضل للعمل بسرعة نسبيا لتقليل الفرق في الوقت بين عندما يتم مطلي العينة الأولى ومطلي العينة الأخيرة. ينصح ماصة متعددة القنوات.
  4. الحضانة عند 37 درجة مئوية
    1. يُغطّى الطبق ويُرجّ لفترة وجيزة (5 ق).
    2. حضانة لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وهذا يسمح لرد الفعل الأنزيمي أن يحدث.
  5. إعداد المنحنى القياسي.
    1. في حين أن العينات هي الحضانة، وإعداد تخفيف تسلسلي من 4-methylumbelliferone، وهو معيار غالبا ما تستخدم في تحديد الفلورمتري من نشاط الإنزيم.
    2. تخفيف مخزون الحل القياسي في وقف العازلة إلى تركيز 5 μM.
    3. إجراء سلسلة من التخفيفات على النحو المبين في الجدول 2. إضافة المكونات في المبلغ المشار إليه ومزيج جيدا.
      ملاحظة: يساعد المنحنى القياسي على ضمان سقوط العينات المقاسة في النطاق الخطي للمنحنى القياسي.
  6. إيقاف رد الفعل مع وقف العازلة.
    1. إضافة 200 درجة مئوية من وقف العازلة إلى كل بئر لوقف رد الفعل.
  7. لوحة المعايير.
    1. إضافة 300 درجة مئوية من كل معيار لكل بئر في التكرارات على نفس اللوحة.
  8. قراءة لوحة باستخدام قارئ الفلورومتري.
    1. قراءة لوحة في الإثارة من 360 نانومتر, وانبعاث 455 نانومتر.

3- تحليل البيانات

  1. طرح الفراغات
    1. متوسط قيم التخفيفات القياسية المكررة التي ليس لها 4-ميثيلبيليفييرون. طرح هذه القيمة من كافة القيم المسجلة الأخرى.
  2. تأخذ متوسط من التكرارات التقنية ورسم المعايير.
    1. متوسط القراءتين لكل تركيز ورسم بياني متوسط القراءة حسب التركيز.
      ملاحظة: يجب أن تبدو المؤامرة الناتجة خطية ولها قيمة R2 قريبة من 1. إذا لم يكن كذلك، قد يكون من الضروري إعادة المعايير وإعادة قراءة لوحة لضمان جودة تحليل البيانات.
  3. توحيد قيم القراءة.
    1. إنشاء خط مناسب لبيانات المعايير المرسومة. تقسيم قراءة العينات حسب ميل الخط الأنسب.
  4. مقارنة القيم من مجموعة التحكم ومجموعة المتغيرات.
    1. استخدم اختبار t أو ANOVA لأكثر من مجموعتين لتحديد ما إذا كان الفرق بين المجموعات مهم إحصائيًا. القيم سوف تأخذ وحدات nmol / مل · ح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

النتائج المبينة هنا هي من دراسة قياس نشاط الكيتينازي في المصل وعينات BAL من النوع البري (C57BL/6) وChit1 الفئران المعدلة وراثيا (على خلفية C57BL/6) أن overexpress الجين Chit1 على المروج الدوكسيسيكلين. وتظهر بياناتنا أن كلا من عينات المصل وBAL لها نشاط الكيتيناز القابل للكشف عند خط الأساس 698.2 ± 189.9 نمول/مل·ح و 485.7 ± 114 نمول/مل·ح، على التوالي. أدى الإفراط في التعبير عن جين Chit1 باستخدام الدوكسيسيكلين في مياه الشرب لمدة 4 أسابيع إلى ارتفاع نشاط الكيتيناز الذي لوحظ في كل من BAL (4,575 ± 673.8 نمول/مل·ح، ع = 0.003) والمصل 1556 ± 251.2 نمول/مل·ح، ع = 0.0272، عند مقارنته اينوال دمع ) عينات.

باستخدام البروتوكول الموضح هنا، يؤكد القول بأن الإفراط في التعبير عن جين Chit1 في الفئران يؤدي إلى زيادة نشاط الكيتيناز. تم استخدام اختبار t لمقارنة وسائل المجموعتين. كل مجموعة تحتوي على 5 فئران.

Figure 1
الشكل 1: نشاط التشيتيناز. تم قياس نشاط التشيتيناز في المصل (أ) و (ب) سائل غسل القصبات الهوائية من النوع البري (WT) وchitotriosidase (ChitTg) الإفراط في التعبير عن الفئران المعدلة وراثيا. تمثل كل نقطة عينة ماوس فردية. (C) تم توحيد القيم باستخدام خطية المنحنى القياسي كما هو موضح في البروتوكول. تم قياس مستويات الفلورة باستخدام قارئ لوحة في الطول الموجي من 360 نانومتر للإثارة و 455 نانومتر للانبعاثات وقدمت على أنها الاتحاد الأفريقي. AU = وحدة تعسفية * p < 0.05, ***p < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عدد من الآبار عينة الركيزة (μL) McIlvain العازلة (مل)
20 100 2.17
50 250 5.425
100 500 10.85

الجدول 1: حسابات العينات لإنشاء حل العمل.

(ميكرولتر) 1 2 3 4 5 6 7 8
(ن م) 0 125 250 375 500 625 750 875
القياسيه 0 20 40 60 80 100 120 140
2x ماكيلفيان 200 200 200 200 200 200 200 200
المقطر H2O 200 180 160 140 120 100 80 60
إيقاف المخزن المؤقت 400 400 400 400 400 400 400 400

الجدول 2: التخفيفات لقياسات المنحنيات القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد برز نشاط الكيتينازي كعلامة حيوية هامة للتنبؤ بخطورة المرض، وتطور المرض، والفعالية العلاجية ووجود مسببات أمراض محددة18. على الرغم من أن العديد من النظريات المفترضة منذ فترة طويلة حول دور الكيتينالم لم يتم إثباتها تجريبيا19، قدمت دراسات جديدة رؤى هامة في دور الكيتينا والكيتينا مثل البروتينات في مختلف الأمراض2، 20.

البروتوكول الموصوف هنا هو وسيلة بسيطة وسريعة وفعالة لقياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية. ولا يلزم إدخال أي تعديل يذكر لقياس نشاط الكيتيناز في مجموعة واسعة من العينات والأنواع البيولوجية بسبب الطبيعة المحفوظة للغاية للكيتيناسيس. ويوجد في هذا البروتوكول نوعان من الركائز، أحدهما مخصص لعينات الماوس وواحد للعينات البشرية؛ ومع ذلك، يمكن استخدام كلا الركيزتين على أي من النوعين، كما تم تحديدها على هذا النحو استناداً إلى بيان الأوراق السابقة للكفاءة التي يمكن أن تُشق بها الإنزيمات الركيزة.

بالمقارنة مع التقنيات الموجودة سابقا، مثل إجراء Schales وطريقة DNS، فإن الدراسة المبينة هنا تزيل الحاجة إلى خطوات مكثفة من حيث الوقت مثل الغليان أو التدفئة التي كانت ضرورية في الأساليب القديمة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الاختبار أقل صعوبة من الناحية التقنية ويتطلب خطوات أقل تعقيداً من تقنيات القياس السابقة. للحصول على أفضل النتائج يجب استخدام كل من النسخ المتماثل البيولوجية والتقنية.

إذا كان نشاط الكيتيناز مرتفعًا جدًا، فإن تخفيف العينة البيولوجية يكفي لتقليل نشاط الكيتيناز للقياس، ويمكن حساب القيم الحقيقية على أساس التخفيف. عند إجراء هذه التجربة على عينات بيولوجية جديدة، قد يكون من المفيد إجراء قياسات متكررة على نفس اللوحة مع مرور الوقت حتى التشبع لضمان وقت الحضانة المناسبة للحصول على أفضل النتائج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع البروتوكول أو خفضه طالما ظل التناسق بين المجموعات قائماً. التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول بعيدة المدى حيث أن البحوث هي مجرد التقاط في دور نشاط الكيتيناز في عدد من الأمراض.

واحدة من الفئة الأولى من الأمراض التي تم العثور على نشاط الكيتيناس لتكون ذات صلة في أمراض التخزين الليسوسومال بما في ذلك مرض Gaucher، نيمان بيك A / B و C، GM-1 gangliosidosis، وغيرها الكثير21. مرض Gaucher هو مرض تخزين الليسوسومال الناجم عن عدم كفاية نشاط غلوكوسيريبروسيداز ويتميز بتراكم غلوكوزيلسيراميد، الركيزة من غلوكوسيبريبروكسيذا، في lysosome من الضامة15. وهو مرض وراثي، مع الأعراض السريرية التي تشمل الطحال وتوسيع الكبد، وانخفاض عدد الصفائح الدموية، وفقر الدم، والتعب، ومشاكل العظام22. وقد أظهرت البحوث السريرية أن غالبية الأشخاص الذين يعانون من مرض Gaucher لديهم متوسط نشاط الكيتيناز الذي يزيد على 600 ضعف القيمة المتوسطة للمتطوعين السيطرة العادية; بالإضافة إلى ذلك، عندما تم وضع الأشخاص الذين يعانون من مرض Gaucher على العلاج مكملات الإنزيم - العلاج الحالي للمرض - انخفضت مستويات نشاط الكيتيناز بشكل كبير الإقراض نشاط الكيتناز لتكون علامة ممتازة لكلا المرضين رصد التقدم والعلاج15. لم يتم العثور على أي دور حتى الآن لChit1 في هذا المرض ومع ذلك. وقد أدت أبحاث مماثلة إلى مراقبة نشاط Chit1 للعديد من أمراض التخزين الليسوسومية الأخرى10.

بالإضافة إلى ذلك، أشارت أبحاث أخرى إلى دور محتمل لنشاط Chit1 خلال مختلف العدوى المسببة للأمراض بما في ذلك العدوى الفطرية والملاريا والسل وK. pneumoniae على سبيل المثال لا الحصر2و3و10 . وجدت دراسة أجريت في عام 2012 أن نشاط الكيتيناز قد ارتفع في المرضى الذين يعانون من عدوى السل النشطة حتى عندما كانت مسحة البلغم سلبية، مما يشير إلى أن نشاط الكيتيناز يمكن استخدامه كعلامة حيوية فعالة في تشخيص السل، وخاصة خلال وقت الانتظار الطويل الذي غالبا ما يكون ضروريا لتشخيص المرض بدقة23. وشوهدت نتائج مماثلة خلال عدوى البلازموديوم المنجلي، مع زيادة كبيرة في مستويات مصل الشيتوتريوسيداسي في تلك التي يعانون من العدوى الحادة24. في حين أن العديد من هذه الأمراض يستغرق أياملتشخيص، يمكن أن توفر القياسات السريعة لمستويات نشاط الكيتيناز في الدم رؤى مفيدة في التشخيص. بالإضافة إلى ذلك، مع تزايد مقاومة طفيليات الملاريا وبكتيريا السل للعلاجات، فإن قياس مستويات نشاط الكيتيناز في المصل قد يساعد في مراقبة العلاج لفعاليته في الوقت الحقيقي.

وقد بدأ المزيد والمزيد من البحوث للتركيز على دور الكيتيناز والبروتينات الشبيهة بالكيتيناسي في الاستجابة المناعية، ولا سيما دورها في المسارات الالتهابية. ومع استمرار هذا البحث، سيسمح هذا البروتوكول بقياس سريع ودقيق لهذا النشاط الكيتيناز لمزيد من البحوث. يتم تعديل البروتوكول بسهولة لأي عدد من عينات الأنواع بما في ذلك الماوس والإنسان على حد سواء، مما يجعلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع.

بالإضافة إلى فائدة البحث، فإن أفضل الطرق للكشف عن وقياس نشاط الكيتيناز في العينات ستكون مفيدة في المجال السريري. وقد أظهرت الأبحاث الحديثة دور الكيتيناز كعلامة حيوية في علم أمراض العديد من الأمراض المزمنة بما في ذلك مرض Gaucher ، مرض السكري ، ساركويد ، تصلب الشرايين ، وأمراض الأمعاء الالتهابية والسرطانات3، 21،25،26.

وبسبب هذا الدور كعلامة بيولوجية، فإن القياس السريع والدقيق لنشاط الكيتيناز كما هو موضح هنا له صلة لا تصدق بمجال الطب، مما يسمح لمقدمي الرعاية الصحية بالحصول على مزيد من المعلومات للتشخيص السليم وخطة العلاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا البحث من قبل جمعية الرئة الأمريكية والجمعية الأمريكية للصدر جوائز LS. الكتاب يريدون بصدق أن أشكر الدكتور جاك إلياس والدكتور تشون جون لي لتوفير سلالات الماوس المعدلة وراثيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5, (1), 21-29 (2013).
  2. Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201, (2), 615-626 (2018).
  3. Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/ 1-9 (2012).
  4. Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
  5. Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192, (4798), 135-136 (1961).
  6. Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276, (9), 6770-6778 (2000).
  7. Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
  8. Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36, (2), 482-492 (2013).
  9. Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11, (3), e1004701 (2015).
  10. Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
  11. Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7, (37), 1-8 (2014).
  12. Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623 78 (1945).
  13. Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42, (297), 1017-1029 (2011).
  14. Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304, (5677), 1678-1682 (2004).
  15. Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93, (3), 1288-1292 (1994).
  16. Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43, (2), 198-201 (2005).
  17. Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
  18. Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138, (4), 1183-1189 (2016).
  19. Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10, (1), 69-78 (2008).
  20. Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (22), e2891-e2899 (2015).
  21. Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88, (1), 69-78 (2016).
  22. Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30, (1), 82-87 (2019).
  23. Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
  24. Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331, (1-2), 79-85 (2003).
  25. Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183, (1), 313-325 (2013).
  26. Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
قياس نشاط الكيتيناز في العينات البيولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).More

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter