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Immunology and Infection

生物样品中赤子酶活性的测定

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

这里介绍的是一种测量脑油中齐辛酶活性的简单方法,如支气管活原或血清。

Abstract

奇他酶是裂解奇他素的酶。即使在没有皮他当,哺乳动物体内(包括基线)中也有大量的皮塔那色。钱他酶的确切作用尚不清楚,但据信它在消化和宿主防御含奇他成的食物和病原体方面分别起着重要作用。最近的工作,包括我们的,已经表明了齐辛酶和齐齐酸酶样蛋白在宿主免疫和过敏性疾病中的重要作用。重要的是,Chitinase活动是疾病严重性的重要生物标志物,包括哮喘和肺纤维化等2型炎症性疾病。同样,像高彻病这样的遗传性疾病患者的齐齐纳酶水平显著升高,这不仅与疾病严重程度相关,而且作为治疗效果的可靠生物标志物。此处概述的协议描述了一种简单、快速和直接的方法,用于测量小鼠 BAL 或血清样本中的齐辛酶活性,并且由于酶的高度保守性,可以广泛地适应人类受试者和其他模型生物体。

Introduction

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奇青素是地球上仅次于纤维素的第二大多糖,是各种生物的主要结构成分,包括昆虫、真菌、酵母和藻类的外骨骼;一些脊椎动物也有奇丁1。奇西纳酶是一个酶家族,能够分解奇丁,并在从细菌到哺乳动物2、3等物种的进化过程中高度保存。除了奇他酶,哺乳动物也有丘蒂酸酶样的蛋白质,这些蛋白质在结合奇他素的能力上与奇它酶相似,但不同的是,它们缺乏酶能力来切切奇他4。

尽管奇他和奇它原体早已被研究——调查可追溯到20世纪初——但主要焦点一直是它们在昆虫和其他无脊椎动物中的作用。事实上,直到20世纪60年代,脊椎动物才被发现有丘台动物。使用基于甲苯的测定法,在包括蜥蜴和黑鸟在内的许多脊椎动物的消化道中发现了甲子酶,据推测,这种观察是由于食用了含甲氧基的有机体,如昆虫5.

哺乳动物有两种酶活性形式的甲酸酶:酸性哺乳动物甲壳酶(AMCase;也称为CHIT2和CHIA)和甲基锡酶(CHIT1)4。这两种蛋白质都能够水解奇他蛋白。然而,CHIT1在人类中更具有酶活性,几乎所有齐齐辛酶活性都来自CHIT1。4在小鼠中,Chit1和AMCase几乎同样地对整个齐齐辛酶活性6作出贡献。另一方面,齐齐那酶样蛋白质缺乏齐齐那酶活性。

Chit1主要通过巨噬细胞分泌,通常被认为是对含甲苯的病原体7的免疫反应。该酶也已被证明参与单核细胞成熟到M1和M2巨噬细胞亚型,即使没有基质甲肽8的存在。此外,它也可能涉及其他免疫细胞的成熟,包括T帮助器2型(Th2)细胞和嗜酸性粒细胞-如在隐球菌肺感染9中证明的情况。这些研究指出,奇塔因斯系统在免疫系统中有着复杂的作用。

近年来,Chit1水平被发现是40多种人类疾病的重要生物标志物,包括体球储存疾病、传染病、呼吸系统疾病、内分泌疾病、心血管疾病、神经系统疾病和其他疾病(第10页)。在许多这些疾病中,Chit1水平是疾病严重程度和治疗效果的有力预测。

由于奇质酶已经获得了作为包括高彻病等多种疾病的生物标志物的声誉,因此开发了工具和检测方法,以方便对奇他打酶的存在进行检测。较旧的方法包括沙勒斯的程序、根据血糖测试改编的方案以及 3,5 二硝基水杨酸 (DNS) 方法。然而,这些方法往往是时间敏感和技术上困难11。这两种测试的程序要求减少无机氧化剂,例如,在沙勒程序的情况下,铁氧体化物,产生一种颜色变化,只能分光光度测量。此外,这两个测试都涉及加热或沸腾步骤,既耗时又需要颜色开发12,13。

这里描述的是一种快速而简单的荧光测定,以确定哺乳动物样本14、15中的齐辛酶水平。此处使用的两个样本包括血清和支气管输液洗浴液 (BAL);在母乳和尿液样本中也测量了齐辛酶活性,该技术可以在这些类型的样品以及任何其他生物液体16、17中进行。

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Protocol

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所有动物程序都是根据耶鲁大学医学院的IACUC批准的规程进行的。

1. 鼠标样本收集

  1. 麻醉
    1. 使用氯胺酮和木兰素(100毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克木兰辛)对小鼠进行麻醉。
  2. 血液样本采集
    1. 通过对脚趾捏没有反应来确认麻醉的深度。
    2. 手术打开胸腔以暴露心脏。
    3. 将26.5G针头插入左心室,将血液收集到注射器中。
      注:通常,从健康的20-25克小鼠中采集约0.5~1 mL的血液。
    4. 在肝素管中采集血液,用于血浆采集,或用于血清收集的非肝化管。
  3. 支气管静脉洗浴液(BAL)的收集
    1. 要收集 BAL,在颈部进行垂直切割以暴露气管。
    2. 用22G导管将气管固定,并用绳子牢固地固定气管,以防止从老鼠的鼻子中渗出。
    3. 通过气管缓慢地将两种无量磷酸缓冲盐水(PBS,每支0.75 mL)注入肺部,然后取回。
    4. 池等分,并保持在冰上进一步分析。
  4. 处理生物样品。
    1. 血液样本:新鲜(血浆)或允许凝固4小时(血清)后,在600 x g下离心10分钟。取上清液,冻结储存或用于实验。
    2. BAL:将样品在350 x g下离心5分钟。取上清液,冻结储存或用于实验。

2. 赤二酶测定

注:测定背后的科学相对简单。非荧光基质通过酶活性齐质色酶进行分离,以产生荧光产物,然后作为齐辛酶活性的间接标记进行测量。样品中的甲酰胺酶分解了存在于1xMcIlvain缓冲液中的基质4-甲基乙酰乙酰基生物基质4-甲基乙酰基多生物。荧光分子4-甲基乙酰乙烯释放。通过测量每口井的总荧光,我们得到每个样品中活性齐辛酶的精确测量。由于齐青酸酶的裂解是一种水解反应,停止缓冲液,0.3M甘氨酸和NaOH的混合物(pH 10.6时为12.0克/升),通过创造一个过于基本使酶无法发挥作用的环境来结束其分明。

  1. 准备基材、标准和解决方案。
    1. 准备麦基尔万缓冲器。麦基尔万缓冲液由0.1M磷酸盐和0.2M磷酸盐组成,pH为5.2。以 1:1 的比例稀释 1x McIlvain 缓冲液。
    2. 将4-甲基乙酰乙酰基质-D-N、N'-二乙酰基多生物酶和4-甲基乙酰乙酰乙酰基质醇溶解在1x麦基尔万缓冲液中,每次浓度为500μM。
      注:库存溶液可储存在-20°C下,以供进一步使用;最好存储在等分中。
    3. 将标准,4-甲基五甲苯酮溶解至停止缓冲液中浓度为0.1 mM(0.3M甘氨酸和NaOH的混合物(pH 10.6时为12.0克/升),以创建标准曲线库存溶液。
  2. 创建和盘板工作解决方案。
    1. 结合1x麦基尔万缓冲液和甲酰胺基质4-甲基乙酰乙酰基多比-D-N,N'-二乙酰基生物,以创建工作溶液。对于每 10 个样品,将 100 μL 的基板与 2.17 mL 的 1x McIlvain 缓冲液混合。有关基于样本大小的其他计算,请参阅1。
      注:在人体样品中使用4-甲基乙酰乙酰基质醇β-D-N,N',N"-三乙酰基质三酯。虽然这两种基质都可以由人或小鼠酶切割,但它们已被分配给人类或小鼠样本基于裂解6的效率。
    2. 将工作溶液移液 95 μL 放入 96 孔板的每个孔中。
  3. 将生物标本样品添加到工作溶液中。
    1. 接下来,在每个井中加入5μL的测试样品(血液/BAL/组织流变/其他生物液)。
    2. 将样品混合到工作溶液中,获得最准确、最可靠的结果。
      注:样品应以重复/三元运行,并特别注意潜在的边缘效应。所有样品都应预加热,以尽量减少边缘效应。由于测定涉及样品中的奇子色和工作溶液中的基质之间的反应,因此最好工作相对较快,以尽量减少第一个样品的镀值与最后一个样品的镀层之间的时间差。建议使用多通道移液器。
  4. 在37°C孵育。
    1. 盖上盘子,然后短暂摇动(5 s)。
    2. 在37°C下孵育板15分钟。这允许酶反应发生。
  5. 准备标准曲线。
    1. 当样品孵育时,准备连续稀释4-甲基苯甲酮,这是一种通常用于酶活性的氟度测定标准。
    2. 将停止缓冲液中的标准溶液的库存稀释至5μM浓度。
    3. 执行一系列稀释,如表2所示。将组件添加在指示的数量中,并混合均匀。
      注:标准曲线有助于确保测量样本落在标准曲线的线性范围内。
  6. 使用停止缓冲器停止反应。
    1. 在每个井中加入200 μL的停止缓冲液,以停止反应。
  7. 平板标准。
    1. 在同一板上以重复数为每个孔添加 300 μL 标准。
  8. 使用荧光仪读取板。
    1. 以 360 nm 的激励和 455 nm 的发射量读取板。

3. 数据分析

  1. 减去空白
    1. 平均没有4甲基酰胺的重复标准稀释剂的值。从所有其他记录的值中减去此值。
  2. 采用平均技术复制并绘制标准图。
    1. 对每个浓度的两个读数进行平均,并绘制平均读数的集中图。
      注:生成的绘图应看起来是线性的,R2值应接近 1。如果没有,可能需要重做标准并重新读取板材,以确保数据分析的质量。
  3. 标准化读出值。
    1. 为绘制的标准数据创建最适合的线。将样本的读出除以最佳拟合线的斜率。
  4. 比较来自控件组和变量组的值。
    1. 对于两个以上组,使用 t 检验或方差来确定组之间的差异是否具有统计显著性。值将采用单位 nmol/mL+h。

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Representative Results

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此处显示的结果来自一项研究,该研究测量了野生型(C57BL/6)的血清和BAL样本中的奇汀酶活性,以及Chit1转基因小鼠(在C57BL/6背景上),该研究在多氧环素启动子上过度表达Chit1基因。我们的数据表明,血清和BAL样本在基线698.2~189.9 nmol/mL+h和485.7 = 114 nmol/mlμh时均具有可检测到的齐辛酶活性。在饮用水中使用多氧环素的Chit1基因过度表达4周,导致在BAL(4,575 ± 673.8 nmol/mL+h,p = 0.003)和血清1556 × 251.2 nmol/mL_h,p = 0.0272中观察到的齐汀酶活性升高) 示例。

使用此处描述的协议,测定证实小鼠中Chit1基因的过度表达会导致齐质他酶活性增加。使用 t 检验来比较两组的方法。每组包含5只小鼠。

Figure 1
图1:赤脚酶活性。在 (A) 血清和 (B) 野生型 (WT) 和甲基辛沙酶 (ChiitTg) 过度表达转基因小鼠中测量了奇丁酶活性.每个点表示单独的鼠标样本。(C) 值是使用协议中描述的标准曲线的线性度进行标准化的.荧光水平使用波长为360nm的板读取器进行激发,455nm用于发射,并呈现为AU。AU = 任意单位 \p < 0.05,#p < 0.001。请点击此处查看此图的较大版本。

样品井数 基板 (μL) 麦基尔万缓冲液 (mL)
20 100 2.17
50 250 5.425
100 500 10.85

表 1:用于创建工作解决方案的示例计算。

(μL) 1 2 3 4 5 6 7 8
(nM) 0 125 250 375 500 625 750 875
标准 0 20 40 60 80 100 120 140
2x 麦基尔维安 200 200 200 200 200 200 200 200
蒸馏 H2O 200 180 160 140 120 100 80 60
停止缓冲区 400 400 400 400 400 400 400 400

表2:标准曲线测量的稀释。

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Discussion

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赤子酶活性已成为预测疾病严重性、疾病进展、治疗效果和特定病原体存在的重要生物标志物18。虽然许多关于齐替酶作用的长期假设理论尚未经过实验证实,但新的研究为奇它酶和齐齐那酶等蛋白质在各种疾病中的作用提供了重要的见解2, 920.

此处描述的方案是测量生物样品中齐辛酶活性的一种简单、快速和有效的方法。由于奇他酶的高度保守性,测量各种生物样品和物种中的齐齐纳酶活性几乎无需修改。该协议所列有两个基质,一种是为小鼠样品指定的,另一种是用于人体样品的基质;然而,这两种基质都可以用于任何一个物种,因为它们已经被指定为这样的根据以前的文件证明酶可以分裂基质的效率。

与以前的现有技术(如 Schales 的程序和 DNS 方法)相比,此处概述的测定消除了在旧方法中所需的时间密集型步骤(如沸腾或加热)的需要。此外,与前面的测量技术相比,测定在技术上难度较低,需要的复杂步骤更少。为了获得最佳结果,应使用生物和技术复制。

如果甲酰辛烷活性过高,生物样品的稀释足以降低甲酰辛烷的活性进行测量,并且根据稀释法计算真实值。在新的生物样品上执行此实验时,对同一板进行重复测量,直到饱和,以确保适当的孵育时间以获得最佳结果可能会有所帮助。此外,只要组之间的一致性保持,协议就可以向上或向下扩展。该协议的未来应用是深远的,因为研究刚刚开始在一些疾病中奇齐辛酶活动的作用。

奇蒂酸酶活性在第一类疾病中被发现与结膜酶储存疾病有关,包括高彻病、尼曼-皮克A/B和C、GM-1神经侧虫病等21种其他疾病。高氏菌病是一种由糖凝酶活性不足引起的溶解体储存性疾病,其特征是在巨噬细胞溶解体15的溶解体中积累糖脂酰胺,这是糖凝酶的基质。它是一种遗传性疾病,临床症状包括脾脏和肝肿大、血小板计数低、贫血、疲劳和骨质问题22。临床研究表明,大多数患有高彻病的人具有中位齐齐纳酶活性,是正常控制志愿者中值的600倍以上;此外,当高彻病患者接受酶补充疗法(目前治疗该病的方法)时,其齐齐辛酶活性水平明显下降,使奇他酶活性成为这两种疾病的极佳标志物进展和治疗监测15。然而,尚未发现Chit1在疾病中的作用。类似的研究也导致Chit1活动监测许多其他的体体存储疾病10。

此外,进一步的研究表明,Chit1活动在各种病原体感染(包括真菌感染、疟疾、结核病和肺炎)中的潜在作用,仅举二、三、.2012年的一项研究发现,即使痰涂片呈阴性,活性结核病(TB)感染患者的齐辛酶活性也升高,这表明齐辛酶活性可作为结核病诊断的有效生物标志物,特别是在长时间的等待时间,往往是必要的,以准确诊断疾病23。类似的发现在恶性疟原虫感染期间也出现,急性感染者血清水平明显升高。虽然许多这些疾病需要数天来诊断,但快速测量血液中的齐辛酶活性水平可以为诊断提供有益的见解。此外,随着疟原虫和结核病对治疗越来越有抵抗力,测量血清中的甲酸酶活性水平可能有助于实时监测其有效性。

越来越多的研究开始关注齐齐那酶和齐齐那酶样蛋白在免疫反应中的作用,特别是在炎症途径中的作用。随着这项研究的继续,该协议将允许快速准确地测量这种齐辛酶活性,以进一步研究。该协议可轻松针对包括小鼠和人类在内的任意数量的物种样本进行调整,使其广泛适用。

除了研究效果外,更好的检测和测量样品中齐辛酶活性的方法对临床领域也是有益的。最近的研究表明,奇蒂激酶作为生物标志物在多种慢性疾病的病理学中的作用,包括高彻病、糖尿病、结节病、动脉粥样硬化、炎症性肠病和癌症3 21,25,26.

由于这种作为生物标志物的作用,此处所示的快速、准确地测量齐齐妥酶活性与医学领域有着令人难以置信的相关性,使医疗保健提供者能够获得更多信息,从而制定正确的诊断和治疗计划。

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Disclosures

没有。

Acknowledgments

这项研究得到了美国肺脏协会和美国胸腔学会对LS的奖项的支持。作者衷心感谢杰克·埃利亚斯博士和李春根博士提供转基因小鼠菌株。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

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