जैविक नमूनों में चिटिनास गतिविधि का मापन
Summary
यहाँ प्रस्तुत इस तरह के ब्रोंकोएल्वेलर lavage या सीरम के रूप में जैविक तरल पदार्थ में chitinase गतिविधि को मापने के लिए एक सरल तरीका है।
Abstract
Chitinases एंजाइमों कि chitin छोड़ रहे हैं. यहां तक कि काटिन की अनुपस्थिति में, स्तनधारी लोगों के शरीर में महत्वपूर्ण मात्रा में चीटिनेस मौजूद होते हैं, जिनमें आधार रेखा भी शामिल है। chitinase की सटीक भूमिका ज्ञात नहीं है, हालांकि यह क्रमशः chitin युक्त भोजन और रोगजनकों के खिलाफ पाचन और मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए माना जाता था। हमारे सहित हाल के काम, मेजबान प्रतिरक्षा और एलर्जी रोगों में chitinase और chitinase की तरह प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण भूमिका दिखाई है. महत्वपूर्ण बात, chitinase गतिविधियों प्रकार 2 अस्थमा और फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस के रूप में भड़काऊ रोगों सहित रोगों की एक विस्तृत रेंज में रोग गंभीरता के महत्वपूर्ण biomarkers के रूप में सेवा करते हैं. इसी तरह, गौचर रोग जैसे आनुवंशिक विकारों वाले रोगियों ने काफी ही चिटिनास स्तर को ऊंचा किया है, जो न केवल रोग की गंभीरता के साथ सहसंबंधित होता है बल्कि चिकित्सीय प्रभावशीलता के लिए एक विश्वसनीय बायोमार्कर के रूप में भी काम करता है। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल चूहों के बाल या सीरम नमूनों में chitinase गतिविधि को मापने के लिए एक सरल, त्वरित, और सीधा तरीका का वर्णन करता है और व्यापक रूप से एंजाइमों की अत्यधिक संरक्षित प्रकृति के कारण मानव विषयों और अन्य मॉडल जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
Chitin सेलूलोज़ के बाद पृथ्वी पर दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में polysaccharide है, कीड़े, कवक, खमीर, और शैवाल के एक्सोस्केलेटन सहित जीवों की एक किस्म के एक प्रमुख संरचनात्मक घटक के रूप में सेवा; कुछ कशेरुकियों में काटिन1भी होता है . चिटिनेस एंजाइमों का एक परिवार है जो चिटिन को तोड़ने में सक्षम है और बैक्टीरिया से लेकर स्तनधारियों2,3तक की प्रजातियों में विकास के दौरान अत्यधिक संरक्षित है . चिटिनेस के अलावा, स्तनधारियों में भी चिटिनास जैसे प्रोटीन होते हैं जो कि चिटिन को बांधने की क्षमता में चिटिनास के समान होते हैं लेकिन इसमें भिन्न होते हैं कि उनमेंकिटिनको छोड़ने की एंजाइमी क्षमता की कमी होती है।
हालाँकि काटिन और काटिनेस का लंबे समय से अध्ययन किया जा रहा है। 1900 के शुरू में हुई जाँच-रिपोर्ट का मुख्य फोकस कीड़ों और दूसरे अकशेरुकियों में उनकी भूमिका पर रहा है। वास्तव में, यह 1960 के दशक तक नहीं था जब कशेरुकी को चिटिनास पाया गया था। एक chitobiase आधारित परख का उपयोग करते हुए, chitinases छिपकली और blackbirds सहित कशेरुकियों की एक संख्या के पाचन तंत्र में पाया जा करने के लिए दिखाया गया था-एक अवलोकन ऐसे कीड़े के रूप में chitin युक्त जीवों की खपत के कारण होने के लिए hypothesized .
मैमल्स में दो एंजाइमी रूप से सक्रिय रूप होते हैं: अम्लीय स्तनधारी चिटिनासे (AMCase; जिसे CHIT2 और च्याया के नाम से भी जाना जाता है) और चीटोट्राइसिडेस (CHIT1)4. ये दोनों प्रोटीन किटिन को हाइड्रोलाजिंग करने में सक्षम हैं। हालांकि, CHIT1 मनुष्यों में अधिक एंजाइमी रूप से सक्रिय है, जहां लगभग सभी chitinase गतिविधि CHIT1 से ली गई है। 4 चूहों में, दोनों Chit1 और AMCase लगभग समान रूप से समग्र chitinase गतिविधि6में योगदान करते हैं. दूसरी ओर, काइटिनास जैसे प्रोटीन में काइटिनाज गतिविधि की कमी होती है।
Chit1 मुख्य रूप से मैक्रोफेज द्वारा स्रावित होता है और अक्सर चिटिन युक्त रोगजनकों7के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माना जाता है। एंजाइम को भी एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज उपप्रकारों में मोनोसाइट्स की परिपक्वता में शामिल दिखाया गया है, यहां तक कि सबस्ट्रेट चिटिन8की उपस्थिति के बिना भी। इसके अलावा, यह भी टी सहायक प्रकार 2 (Th2) कोशिकाओं और eosinophils सहित अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परिपक्वता में शामिल किया जा सकता है के रूप में क्रिप्टोकोकल फेफड़ों केसंक्रमण9 में मामला होना दिखाया गया था. ये अध्ययन प्रतिरक्षा प्रणाली में chitinases की एक जटिल भूमिका को इंगित करते हैं.
हाल के वर्षों में, Chit1 स्तर lysomal भंडारण रोगों, संक्रामक रोगों, श्वसन रोगों, एंडोक्रिनोलॉजिकल रोगों, हृदय सहित 40 से अधिक विभिन्न मानव रोगों के लिए प्रगति का एक महत्वपूर्ण biomarker के रूप में सेवा करने के लिए पाया गया है रोग, तंत्रिका संबंधी रोग, और दूसरों (समीक्षा10). इन रोगों में से कई में, Chit1 के स्तर रोग गंभीरता और चिकित्सीय प्रभावशीलता10के एक मजबूत भविष्यवक्ता हैं.
के रूप में chitinases गौचर रोग, उपकरण और परख सहित कई चिकित्सा शर्तों के लिए एक biomarker के रूप में एक प्रतिष्ठा प्राप्त की है chitinase उपस्थिति के लिए परीक्षण की सुविधा के लिए विकसित किया गया है. पुराने तरीकों में Schales की प्रक्रिया, एक रक्त ग्लूकोज परीक्षण से अनुकूलित प्रोटोकॉल, और 3,5 डाइनिट्रोसैलिसिलिक एसिड (DNS) विधि शामिल हैं। हालांकि, इन तरीकों अक्सर समय संवेदनशील और तकनीकी रूप से मुश्किल11कर रहे हैं. इन परीक्षणों के दोनों के लिए प्रक्रिया अकार्बनिक oxidants की कमी की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए Schales प्रक्रिया के मामले में फेरिसायनाइड, एक रंग परिवर्तन है कि केवल स्पेक्ट्रोफोटोमीट्रिक रूप से मापा जा सकता उत्पादन. इसके अतिरिक्त, दोनों परीक्षणों में एक हीटिंग या उबलते चरण शामिल होते हैं जो 12,13को विकसित करने के लिए रंग के लिए समय लेने वाला और आवश्यक दोनों होता है।
यहाँ वर्णित एक त्वरित और सरल फ्लोरीमितीय परख है स्तनधारी नमूनों में chitinase स्तर निर्धारित करने के लिए14,15. यहाँ इस्तेमाल नमूनों में से दो सीरम और ब्रोंकोएलवेलर lavage तरल पदार्थ (BAL) शामिल हैं; चिटिनेस गतिविधि को स्तन के दूध और मूत्र के नमूनों में भी मापा गया है और इस तकनीक को उन प्रकार के नमूनों के साथ-साथ किसी अन्य जैविक तरल पदार्थ16,17में भी किया जा सकता है .
Protocol
Representative Results
Discussion
Chitinase गतिविधि रोग गंभीरता, रोग प्रगति, चिकित्सीय प्रभावशीलता और विशिष्ट रोगजनकों की उपस्थिति की भविष्यवाणी के लिए एक महत्वपूर्ण biomarker के रूप में उभराहै 18. हालांकि chitinases की भूमिका के बारे में लंबे स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध अमेरिकी फेफड़े एसोसिएशन और अमेरिकी Thoracic सोसायटी पुरस्कार एलएस के लिए द्वारा समर्थित किया गया था. लेखक ईमानदारी से ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों प्रदान करने के लिए डॉ जैक Elias और डॉ चुन Geun ली शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
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