Mätning av Chitinas aktivitet i biologiska prover
Summary
Presenteras här är en enkel metod för att mäta Chitinase aktivitet i biologiska vätskor såsom bronalveolärt pumpning eller serum.
Abstract
Chitinases är de enzymer som klyva kitin. Även i avsaknad av Chitin, mammalianer har betydande mängder chitinases närvarande i kroppen, inklusive vid baseline. Den exakta roll Chitinase är inte känt, men det ansågs att spela viktig roll i matsmältningen och värd försvar mot Chitin-innehållande mat och patogener, respektive. Nyligen arbete, inklusive vår, har visat en viktig roll för Chitinase och Chitinase-liknande proteiner i Host immunitet och allergiska sjukdomar. Viktigare, Chitinase verksamhet fungera som viktiga biomarkörer för sjukdomens svårighetsgrad i ett brett spektrum av sjukdomar inklusive typ 2 inflammatoriska sjukdomar såsom astma och lungfibros. På samma sätt, patienter med genetiska sjukdomar som Gauchers sjukdom har signifikant förhöjda Chitinase nivåer, som inte bara korrelerar med sjukdoms svårighetsgrad utan också fungera som en pålitlig biomarkör för terapeutisk effektivitet. Det protokoll som beskrivs här beskriver ett enkelt, snabbt och enkelt sätt att mäta Chitinase aktivitet i BAL eller serum prover av möss och kan vara allmänt anpassade till människor och andra modellorganismer på grund av den mycket bevarade karaktären av enzymerna.
Introduction
Chitin är den näst vanligast förekommande polysackarid på jorden efter cellulosa, som fungerar som en viktig strukturell komponent i en mängd olika organismer, inklusive exoskelett av insekter, svampar, jäst, och alger; vissa ryggradsdjur har också Chitinen1. Chitinases är en familj av enzymer som kan bryta ner Chitinen och är mycket bevaras under hela evolutionen i arter som sträcker sig från bakterier till däggdjur2,3. Förutom chitinases, däggdjur har också Chitinase-liknande proteiner som liknar chitinases i sin förmåga att binda Chitinen men skiljer sig i att de saknar enzymatisk förmåga att klyva den Chitinen4.
Även om Chitinen och chitinases har länge studerats-med utredningar som går tillbaka till början av 1900-talet-har huvudfokus legat på deras roll i insekter och andra ryggradslösa djur. I själva verket var det inte förrän på 1960-talet när ryggradsdjur konstaterades ha chitinases alls. Med hjälp av en chitobiase-baserad analys, chitinases visades finnas i mag-tarmkanalen hos ett antal ryggradsdjur inklusive ödlor och koltrastar-en observation hypotes att bero på konsumtion av Chitin-innehållande organismer såsom insekter5 .
Däggdjur har två enzymatiskt aktiv bildar av Chitinase: surt däggdjur Chitinase (AMCase; också bekant som CHIT2 och CHIA) och chitotriosidas (CHIT1)4. Båda dessa proteiner kan hydrolysera kitin. Emellertid, CHIT1 är mer enzymatiskt aktiv hos människor, där nästan alla Chitinase aktivitet härleds från CHIT1. 4 i möss, både Chit1 och amcase nästan lika bidra till den totala Chitinase aktivitet6. Å andra sidan, Chitinase-liknande proteiner saknar Chitinase aktivitet.
Chit1 utsöndras huvudsakligen av makrofager och anses ofta vara ett immunsvar mot Chitin-innehållande patogener7. Enzymet har också visat sig vara inblandade i mogningen av monocyter i både M1 och m2 makrofage subtyper, även utan närvaro av substratet Chitinen8. Dessutom, det kan också vara inblandade i mogningen av andra immunceller inklusive T Helper typ 2 (TH2) celler och eosinofiler — som visades vara fallet i kryptokockmeningit lunginfektion9. Dessa studier pekar på en komplex roll av chitinases i immunförsvaret.
Under de senaste åren har Chit1 nivåer visat sig fungera som en viktig biomarkör för progression för över 40 olika mänskliga sjukdomar inklusive lysosomala lagrings sjukdomar, infektionssjukdomar, luftvägssjukdomar, endokrinologiska sjukdomar, kardiovaskulära sjukdomar, neurologiska sjukdomar och andra (Recenserad10). I många av dessa sjukdomar, nivåerna av Chit1 är en stark prediktor för sjukdomens svårighetsgrad och terapeutisk effektivitet10.
Som chitinases har fått ett rykte som en biomarkör för många sjukdomstillstånd inklusive Gauchers sjukdom, verktyg och analyser har utvecklats för att underlätta testning för Chitinase närvaro. Äldre metoder inkluderar Schales förfarande, ett protokoll som anpassats från ett blodglukos test, och den 3, 5 dinitrosalicylsyra (DNS) metod. Dessa metoder är dock ofta tidskänsliga och tekniskt svåra11. Förfarandet för båda dessa tester kräver reduktion av oorganiska oxidanter, ferricyanid i fallet med Schales ‘ förfarande till exempel, som producerar en färgförändring som endast kan mätas spektrofotometriskt. Dessutom, båda testerna innebär ett värme-eller Kok steg som är både tidskrävande och nödvändigt för att färgen ska utveckla12,13.
Beskrivs här är en snabb och enkel fluorimetrisk analys för att bestämma Chitinase nivåer i däggdjurs prov14,15. Två av de prover som används här inkluderar serum och bronalveolär sköljning vätskor (BAL); chitinas aktivitet har också mätts i bröstmjölk och urinprov, och tekniken kan utföras i dessa typer av prover samt i någon annan biologisk vätska16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chitinase aktivitet har vuxit fram som en viktig biomarkör för att förutsäga sjukdomens svårighetsgrad, sjukdomsprogression, terapeutisk effektivitet och förekomst av specifika patogener18. Även om många av de långpostulerade teorier om rollen som chitinases inte har experimentellt bevisat19, nya studier har gett viktiga insikter i rollen som chitinases och Chitinase som proteiner i olika sjukdomar2, 9<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av American lung Association och American Thoracic Society Awards till LS. Författarna vill uppriktigt tacka Dr Jack Elias och Dr Chun Geun Lee för att ge transgena mus stammar.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
