Summary
Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.
Abstract
El uso de cultivos celulares primarios se ha convertido en una de las principales herramientas para estudiar el sistema nervioso in vitro. El objetivo final del uso de este sistema de modelos simplificado es proporcionar un microambiente controlado y mantener la alta tasa de supervivencia y las características naturales de las células neuronales y no neuronales disociadas tanto como sea posible en condiciones in vitro. En este artículo, demostramos un método de aislar las neuronas primarias del cerebelo del ratón en desarrollo, colocándolas en un entorno in vitro, estableciendo su crecimiento y monitoreando su viabilidad y diferenciación durante varias semanas. Este método es aplicable a las neuronas embrionarias disociadas del cerebelo entre los días embrionarios 12-18.
Introduction
Durante varias décadas, las líneas celulares se han utilizado ampliamente como una herramienta de alto rendimiento en estudios preclínicos e investigaciones biológicas. Coste-efectividad, crecimiento rápido, y la reducción del uso de animales vivos son algunos beneficios del uso de estas células. Sin embargo, las alteraciones genéticas y los cambios fenotípicos se acumulan después de varios pasajes in vitro1. La identificación errónea de las líneas celulares y la disparidad genética de las células primarias pueden dar lugar a experimentos irreproducibles y conclusiones falsas2,3,4,5. Por lo tanto, a pesar de algunas similitudes con las células diferenciadas como las neuronas (por ejemplo, neurotransmisores, canales iónicos, receptores y otras proteínas específicas de las neuronas), las líneas celulares neuronales no pueden replicar el fenotipo completo de las neuronas. El uso de neuronas maduras es otra opción; sin embargo, estas células son células postmitoticas no divisorias que son difíciles de propagar en el cultivo. Además, el reingreso en el ciclo celular puede precipitar la apoptosis6.
El cultivo celular tridimensional (3D), los cultivos de rebanadas organotípicas y los cultivos organoides se han desarrollado para proporcionar un entorno en el que las células pueden organizarse en una forma 3D que imita el entorno in vivo. Por lo tanto, la comunicación de célula a célula, la migración, la invasión de células tumorales en los tejidos circundantes, y la angiogénesis se pueden estudiar7. Sin embargo, los costos adicionales de usar proteínas de matriz celular adicional (ECM) o hidrogeles sintéticos como ropa de cama, dificultad en la toma de imágenes y compatibilidad con instrumentos de cribado de alto rendimiento son inconvenientes considerables del cultivo de células 3D. Una desventaja importante del cultivo de rebanadas de tejido organotípico es el uso de un gran número de animales y los efectos adversos de la axotomía, que conduce a la inaccesibilidad de las dianas y factores de crecimiento de los axones, y en consecuencia la muerte neuronal8.
Por lo tanto, un enfoque alternativo, que evita los problemas con las líneas celulares, la dificultad del crecimiento de las células maduras y la complejidad de los tejidos, es la maduración in vitro de células primarias inmaduras. Las células primarias se derivan directamente del tejido humano o animal y se disocian utilizando métodos enzimáticos y/o mecánicos9. Los principios principales de aislamiento, sembrado y mantenimiento en el medio de cultivo son similares independientemente de la fuente de tejido. Sin embargo, los factores tróficos necesarios para promover la proliferación y la maduración son altamente específicos de las células6.
Conocer la "fecha de nacimiento" de cada tipo de célula cerebelosa es un requisito previo para diseñar un experimento de cultivo primario. En general, las células purkinje (PC) y las neuronas de los núcleos cerebelosos (CN), nacen antes que las células más pequeñas, incluidas las interneuronas (por ejemplo, cesta, células estelares) y las células del gránulo. En ratones, los PC emergen entre el día embrionario (E)10–E13, mientras que las neuronas CN aproximadamente E9–E1210.
Otras neuronas cerebelosas nacen mucho más tarde. Por ejemplo, en ratones, la subpoblación Golgi de interneuronas se genera a partir de VZ a (E14-E18) y las interneuronas restantes (célulade cesta y células estelares) ubicadas en la capa molecular emergen de células progenitoras divisorias en la materia blanca entre los primeros postnatal (P)0–P711. Las células de gránulos se generan a partir de la zona germinal externa (EGZ), una zona germinal secundaria que se deriva del labio rombio rostral y pasa por la división terminal después del nacimiento. Pero antes de que sus precursores surjan del labio rombio de E13-E16, las células ya han migrado rostrally a lo largo de la superficie pia para hacer una capa delgada de células en la superficie dorsal del anlage de cerebelo. Las células macrogliales no neuronales como los astrocitos y los oligodendrocitos, que se originan en el neuroepitelio ventricular, nacen en E13.5-P0 y P0-P7 respectivamente11,12,13,14 ,15. Microglia se derivan de las células mieloides mieloides primitivas de yema-sac entre E8–E10 y después de la invasión en el sistema nervioso central se pueden detectar en el cerebro del ratón por E916.
El método presentado en este artículo se basa en el desarrollado originalmente por Furuya et al. y Tabata et al.17,18, que fue optimizado para el cultivo primario de células Purkinje derivadas de Wistar rat cerebella. Ahora hemos adaptado este método y lo hemos modificado cuidadosamente para estudiar el crecimiento de las neuronas cerebelosas de ratón19. A diferencia de nuestro nuevo protocolo, el medio de disección en frío es el principal tampón de lavado utilizado durante los pasos de disección y disociación antes de añadir el medio de sembrado en el protocolo17de Furuya. Este tampón carece de la nutrición, los factores de crecimiento y las hormonas (todo en el medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que son necesarios para apoyar el crecimiento celular y la supervivencia durante los pasos antes mencionados. Además, sobre la base de nuestra amplia experiencia con cultivos cebelosos primarios murinos, hemos utilizado 500 s de medio de cultivo en cada pozo (en lugar de 1 mL) y aumentado la concentración de tri-yodotironina a 0,5 ng/ml, lo que mejora el crecimiento de las células neuronales, en particular aquellos con un fenotipo celular Purkinje, y promueve el crecimiento de las ramas dendríticas en el cultivo. El método principal que aparece en este artículo se puede aplicar ampliamente a otros pequeños roedores (por ejemplo, ardillas y hámsters) durante el desarrollo embrionario y puede utilizarse para estudiar la neurogénesis cerebelosa y la diferenciación en las diversas etapas embrionarias, que difieren entre especies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones institucionales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales del Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales y ha sido aprobado por las autoridades locales ("el Bannatyne Campus Animal Care Comité"). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número y el sufrimiento de los animales utilizados. La profundidad adecuada de la anestesia se confirmó observando que no hubo ningún cambio en la frecuencia respiratoria asociada con la manipulación y pellizcar los dedos del dedo del dedo del dedo del tiempo o el reflejo corneal.
1. Preparación
NOTA: Programar la provisión de ratones embarazadas cronometradas, basada en el plan de investigación, para E12–E18 post-concepción. La elección de la sincronización depende de las características de celda deseadas (ver más abajo). Prepare los resbalones y las placas de la cubierta al menos 2 días antes del experimento. La poli-L-ornitina se utiliza como material de recubrimiento para mejorar la fijación celular a los resbalones de la cubierta.
- Recubrir la cubierta se desliza 2 días antes del aislamiento celular.
- Coloque los resbalones de la cubierta redonda en una placa de 24 pocillos, en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Deje un hueco entre cada resbalón de la cubierta para evitar cualquier contaminación.
- Añadir 90 l de poli-l-ornitina (PLO, 500 g/ml) al centro de cada resbalón de la cubierta. Cierre la tapa y coloque suavemente la placa en una incubadora de CO2 de 37oC/5% durante 2 días.
NOTA: Un mayor volumen puede derramarse los resbalones de la cubierta durante la incubación. El resbalón de la cubierta no necesita ser completamente cubierto con PLO después de colocar una gota. Durante la incubación durante la noche, la OLP se distribuye por igual al borde de los resbalones de la cubierta.
- Un día antes del aislamiento celular, preparar el medio de cultivo I (DMEM/F-12 que contiene putrescina 100 m, selenita sódica 30 nM, L-glutamina 3,9 mM, gentamicina 3,5 g/mL, tridotironina (T3) 0,5 ng/ml, y suplementos de N3 [progésima 4M, insulina 20g/mL, transferrina 20 mg/ml]) y medio de sembrado (medio de cultivo I [sin N3 y T3] que contenga un 10% de suero bovino fetal [FBS]) y guárdelos en 4oC. Preparar la solución de trabajo de tripsina (0,25%) en DMEM/F12 y mantenerlo a 4oC.
NOTA: Las composiciones medianas se proporcionan en el Cuadro 1. - El día del aislamiento celular, coloque el cultivo medio I y el medio de sembración en la incubadora a 37oC.
NOTA: Antes de iniciar el aislamiento del cerebelo, asegúrese de que todas las herramientas y superficies de trabajo estén estériles. - Lave los resbalones de la cubierta.
- Saque la placa de 24 pozos de la incubadora.
- Lave los resbalones de la cubierta en la placa de 24 pocillos 3x con agua destilada doble (DDW) en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles. Cada vez que la cubierta se resbale empape en DDW durante 5 minutos antes de iniciar la aspiración.
- Deje los resbalones de la cubierta en un armario de bioseguridad durante al menos 2 h para secarpor por completo.
2. Colección cerebelo
- Preparar tres platos Petri de plástico estéril de 10 cm llenos de solución salina con 1fosfato helado (PBS), 3 platos petri llenos de solución salina equilibrada de Hank 1x en frío y aproximadamente 5 platos de Petri llenos de medio de disección helada (1x HBSS) que contiene gentamicina 10 g/ml). Mantenlos en hielo.
- Anestetizar el ratón embarazada E18 CD1 con 40% de isoflurano. Realice la luxación cervical en el ratón. Esterilice el abdomen con un 70% de solución de etanol.
- Usa un par de tijeras para hacer una incisión cutánea desde la sínfisis púbica hasta el proceso de xifoidea. Luego sostenga la piel con fórceps y abra la cavidad abdominal.
- Excise los cuernos uterinos con fórceps y lávalos 3 veces en el frío helado 1x PBS sobre hielo.
NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo en hielo para minimizar la tasa metabólica y prevenir el daño de tejidos y células.
3. Disecting the cerebellum
- Después del último paso de lavado, el uso de un par de fórceps finos separa los embriones del útero en 1x HBSS y transfiéralos al medio de disección helada. En el medio de disección, decapitar los embriones con tijeras. Coloque el tejido en un medio de disección limpio.
NOTA: El uso de un estereomicroscopio para microdisección es opcional. - Sostenga el cráneo con fórceps finos y corte a través del calvario con un par de tijeras pequeñas desde el aspecto lateral del cráneo en una línea desde el foramen magnum hasta el borde acústico externo y inferior de la cavidad orbital.
NOTA: Tomar este paso expone la cavidad craneal a nivel de la base del cráneo y facilita la extirpación del cerebro. - Usando un par de fórceps finos, extrae la base del cráneo y despega el cráneo del cerebro.
- Retire cuidadosamente las meninges en el cerebelo, comenzando desde la superficie lateral del pedúnculo y pons cerebelosos medios.
- Cortar ambos pedúnculos cerebelosos y separar el cerebelo del resto del cerebro (Figura 1).
- Colocar inmediatamente la cerebelosa recogida en un tubo cónico estéril de 15 ml lleno de 14 ml de DMEM/F12 sobre hielo.
- Centrifugar el tubo a 1.000 x g,4oC durante 1 min, 3x. Cada vez retire suavemente el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en DMEM/F12 fresco y helado.
NOTA: Para evitar la pérdida de las muestras, utilice la succión del gabinete lo menos posible.
4. Disociación del cerebelo
- Añadir 2 ml de trippsina precalentada (37 oC) al pellet del paso 3.7 y pipetear suavemente para una mezcla adecuada.
- Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC durante 12 minutos.
- Después de la incubación, llevar el tubo a un gabinete de bioseguridad y añadir 10 ml de DMEM/F12 para inactivar la trippsina.
- Centrifugar la mezcla a 1.200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en DMEM/F12 fresco. Repita 3x.
- Premoje un pipeta de transferencia de plástico estéril con DMEM/F12.
- Después del lavado y la centrifugación final, añadir 3,5 ml de solución de trabajo DNase (1 ml de solución de stock DNase I [0,05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS] en 500 ml de FBS inactivado por calor y 2 ml de DMEM/F12) al pellet en el mismo tubo.
- Triturar el tejido con un pipeta de al menos 30 veces hasta que la mezcla alcance un color lechoso homogéneo.
5. Colección de células
- Añadir 10 ml de DMEM/F12 helado a la mezcla.
- Centrifugar la muestra a 1.200 x g,4 oC durante 5 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante sin molestar el pellet.
- Retire el medio de semilla de la incubadora.
- Añadir 500 l de medio de semilla precalentado al pellet y mezclarlo muy bien usando un pipeta para resuspender las células.
- Cuente las células usando un hemocaquímetro.
- Diluir la suspensión celular con el medio de sembración a una densidad de 5 x 105 células/ml.
- Debajo de un armario de bioseguridad, agregue 90 ml de la mezcla diluida a cada pocto en el centro del resbalón de la cubierta.
NOTA: No cargue las partículas que no se suspendieron en el DNase. - Colocar la placa en la incubadora a 37oC durante 3x4 h.
- Después de la incubación, añadir 500 l de medio de cultivo precalentado I a cada poca y volver a colocar la placa en la incubadora (37 oC).
6. Tratamiento de las células recuperadas
- Después de 7 días, sustituya el medio antiguo por un medio de cultivo fresco II (medio de cultivo que complementé con aleósido de citosina [Ara-C, 4 m] y albúmina sérica bovina de 100 g/ml [BSA]; véase el cuadro 1).
NOTA: Este paso es fundamental para evitar el crecimiento de células no neuronales. - Supervise el medio de cultivo una vez al día. Si el pH cambia (indicado por un marcado cambio de color, generalmente más amarillento), retire la mitad (casi 250 ol) del medio antiguo de todos los pozos y agregue 300 s de medio de cultivo precalentado I a cada uno de ellos para evitar la pérdida de nutrientes.
NOTA: El rojo fenol en el medio de cultivo es un buen indicador del pH del medio y la actividad de las células. Trate de minimizar el tiempo de exposición de las células a las condiciones de incubadora. Esto evita cualquier estrés que pueda afectar a su viabilidad.
7. Recogida y fijación de celdas
NOTA: Dependiendo del diseño experimental, las células se pueden recoger en cualquier día, en cualquier momento.
- Preparar una placa separada de 24 pocillos con la organización numérica correspondiente y añadir 100 s de 4% de paraformaldehído (PFA) a cada pocal.
- Para cosechar las células en los días deseados (dependiendo del protocolo experimental), retire suavemente los resbalones de la cubierta de los pocillos de la placa de cultivo original y colóquelas en los pocillos correspondientes de la placa llena de PFA.
- Añadir PFA a los pozos para sumergir completamente los resbalones de la cubierta.
NOTA: Para evitar el desprendimiento de la celda del resbalón de la cubierta, no agregue el PFA directamente en el resbalón de la cubierta. - Mantenga la placa PFA a 4oC durante 30 o 120 min.
- Después de la incubación, restaure la placa a temperatura ambiente.
- Lave suavemente los resbalones de la cubierta 3 veces durante 5 min con 1PBS.
- Proceda al proceso de inmunomancha.
NOTA: En este estudio, se utilizó un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara para capturar las imágenes y ensamblado en montajes utilizando una aplicación de software de edición de imágenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basados en las diferentes fechas de nacimiento de los subtipos neuronales en el cerebelo, los cultivos de embriones de ratón E12-E18 produjeron diferentes tipos de células. Las neuronas de proyección grandes, como las neuronas CN (E9-E12) y los PC (E10-E13), surgieron temprano durante el desarrollo cerebeloso. En ratones, las células de gránulos y Golgi surgieron entre el E13-E18 y se sometieron a divisiones terminales hasta la semana postnatal 4.
La sustitución del medio viejo I por el medio de cultivo fresco II en días in vitro (DIV) 7 eventualmente evitará la proliferación de células gliales. Las interneuronas de la capa molecular, como la cesta y las células estelares, se diferencian después del nacimiento. Por lo tanto, se esperaba que la mayoría de las células en el medio de cultivo en E18 fueran una combinación de PC, células de gránulo, CN y algunas células Golgi. Calbindin 1 (CALB1), un marcador específico de PC, se utilizó para rastrear los cambios morfológicos durante el curso de 21 días. En DIV 0, los cuerpos celulares de los PC eran detectables (por ejemplo, de 10 a 11 h de incubación), pero el crecimiento de la neurita aún no había comenzado(Figura 2A). Para DIV 3, la extensión axonal mostró progreso, mientras que los procesos dendríticos acababan de comenzar. Este estado se mantuvo casi sin cambios hasta la segunda semana in vitro (WIV)(Figura 2B–D). En DIV 10, algunas ramas dispersas y dendritas primarias con espinas comenzaron a crecer(Figura 2E). La brotación de las nuevas dendritas primarias ocurrió continuamente después de DIV 14. Por lo tanto, después de DIV 14, el número de dendritas secundarias y terciarias aumentó y desarrolló ramas anchas en DIV 21(Figura 2F,G).
Es importante saber que el momento de los cambios morfológicos in vitro puede no seguir el mismo patrón que in vivo. Después de estos resultados, en otro experimento se cultivaron durante 3 semanas las primordiacelosas cerebelosas disociadas de E12, E13, E14 y E15. Los PC cultivados de E12 y E13 no desarrollaron ningún crecimiento dendrítico en DIV 18 excepto las extensiones axonales(Figura 3A,B). Sin embargo, después del mismo período de tiempo, las culturas de primordio cerebelosa disociadas de E14 y E15 mostraron crecimiento dendrítico y arborización(Figura 3C,D). Esta variación del ritmo de crecimiento entre las células neuronales in vitro arroja luz sobre un gran cambio que ocurrió en su entorno natural entre la etapa temprana y tardía del desarrollo cerebeloso, que debe aplicarse in vitro para la optimización media.
Junto con los PC, hay otros tipos de células neuronales en el cerebelo que se desarrollan durante los cultivos cerebelosos primarios disociados que se pueden detectar utilizando marcadores neuronales específicos. El etiquetado de doble inmunofluorescencia para CALB1 y una proteína de albúmina de unión al calcio, parvalbumina (PVALB), mostraron que la expresión CALB1 se limitaba exclusivamente a los PC en cultivos cerebelosos primarios, mientras que PVALB se expresaba en CALB1+ neuronas ( es decir, PCs) y PVALB+/CALB1– neuronas, que son interneuronas de capa molecular (células de cesta/estelar)(Figura 4A–C). La subunidad alfa (Nav1.6) del canal de sodio cerrado por tensión (SCN) es un marcador para las células del gránulo y los PC en el cerebelo20. El etiquetado doble con anti-SCN y anti-CALB1 muestra la colocación de cuerpos de células de gránulos y PC en medio de cultivo en DIV 21 (Figura 4D–F). Para otros tipos específicos de células cerebelosas de cultivos cerebelosos primarios disociados, consulte Marzban y Hawkes19.
Figura 1: Aspecto dorsal del cerebro del ratón que delinea el cerebelo en E18. Las meninges están indicadas por cuadrados amarillos. La ubicación del cerebelo está esbozada por la línea amarilla, que es limitada rostrally por el cerebro medio y caudalmente por la médula oblongata (esbozada por líneas marrones discontinuas). El cerebellum vermis y el hemisferio se muestran con líneas marrones discontinuas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Desarrollo de células Purkinje (PC) derivadas del cerebelo del ratón en E18 en cultivo primario durante días in vitro (DIV) 0–21. (A) Los somatas de PC (cabezas de flecha) fueron etiquetados por inmunofluorescencia utilizando anti-calbindina 1 (CALB1) en DIV 0 (después de 10 h). (B) La primera extensión axonal (flecha) y el crecimiento dendrítico temprano (cabeza de flecha) aparecen en DIV 3. El crecimiento y desarrollo dendríticos de los PC continúa en DIV 5 (C) y DIV 7 (D). Las ramas dendríticas de los PC son claramente distinguibles en DIV 10 (E) y DIV 14 (F) (cabezas de flecha) y los árboles dendríticos elaborados son detectables en DIV 21 (cabeza de flecha) (G). Barras de escala: A a 100 m (se aplica a los paneles B, C, D, E y F); G a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Desarrollo de células Purkinje (PC) derivadas del primordio cerebeloso del ratón en E12, E13, E14 y E15 después de 18 días en el cultivo primario (DIV 18). Los axons son las únicas extensiones (flecha) del PC somata en el cultivo primario del cerebella primordium E12 y E13 después de 18 días in vitro (DIV 18) (A,B). El crecimiento y la extensión de la dendrita de los PC se desarrollan por DIV 18 (cabeza de flecha) sólo a partir de las culturas primarias cerebelosas E14 (C) y E15 (D). Barra de escala de 20 m (se aplica a los paneles AaD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Etiquetado de inmunofluorescencia de PC, interneuronas GABAérgicas (células cestas y estelares) y células gráulos del cultivo primario cerebeloso de ratón E18 en DIV 21. (AaC) El etiquetado doble con anti-CALB1 (verde) y anti-PVALB (rojo) muestra PCs y algunas interneuronas (flecha) en contacto con los árboles dendríticos de PC. (D-F) Los canales de sodio cerrados con voltaje (SCN) en cuerpos de PC con dendritas elaboradas y numerosos cuerpos de células de gránulos pequeños (cabeza de flecha) están etiquetados con anti-SCN (rojo) y doble etiqueta con anti-CALB1 (verde). Abreviaturas: Células de Purkinje - PC; CALB1 - calbindina 1; PVALB - parvalbumin; SCN - Canal de sodio cerrado por tensión. Barra de escala a 100 m (se aplica a AaF). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Medio básico | Putrescina | Selenita sódica | L-glutamina | Gentamicina | T3 | N3 | Bsa | Ara-C | Fbs |
| Medio cultural I | DMEM/F12 | 100 M | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 g/ml | 0,5 ng/mL | Progesterona 4 m, insulina 20 g/ml, transferrina 20 mg/ml | - | - | - |
| Medio de sembrado | DMEM/F12 | 100 M | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 g/ml | - | - | - | - | 10% con medio cultural I |
| Cultivo medio II | Medio cultural I | 100 g/ml | 4 m | - | ||||||
Tabla 1: Composiciones de medios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El uso de cultivos primarios es un método bien conocido aplicable a todos los tipos de neuronas17,18,19. En el protocolo presentado, explicamos cómo aislar las neuronas cerebelosas y mantener su viabilidad con una supervivencia óptima in vitro durante un máximo de 3 semanas. El cultivo primario de células cerebelosas, que fueron aisladas en E15-E18, confirma la recolección de tres clases de neuronas grandes: PCs, células Golgi y CNs. Los cuerpos celulares y las proyecciones de las células Golgi (algunas de las cuales emergen en E19-P5) y el soma de las células del gránulos pueden ser detectados por anticuerpos de neurogranina (NRGN) y SMI32, respectivamente, dentro de los 21 días posteriores al cultivo19,21.
Un factor crítico para la supervivencia y el mantenimiento de las neuronas cerebelosas es el tipo de medio de cultivo utilizado. El medio complementado FBS ha sido una condición estándar para las líneas celulares y el cultivo primario durante décadas. Sin embargo, las preocupaciones éticas, la variabilidad en la composición sérica y su potencial para ser una fuente de contaminación, han llevado a cierta precaución22. Recientemente, medio DMEM/F-12 enriquecido con suplemento según se encontró para reducir la brecha entre las condiciones fisiológicas y los modelos neuronales in vitro. El medio sugerido por Furuya et al. mejoró la tasa de supervivencia de los PC y mejoró su diferenciación de dendrita en comparación con el medio libre de suero basado en el águila basal (BME) ampliamente utilizado17,18,23. Este medio se ha convertido en la base de medios químicamente definidos implementados en el cultivo primario de células de cerebelo.
El cultivo celular primario de las neuronas tiene limitaciones. Como en cualquier cultivo in vitro, las células pueden sobrevivir por un período limitado de tiempo. Sin excepción, las células neuronales primarias cultivadas in vitro sólo se pueden pasar un número limitado de veces. El pasantes excesivo afectará la salud celular, la función y el fenotipo, y como tal, representar resultados experimentales variables. Por lo tanto, los experimentos basados en cultivos primarios neuronales/no neuronales suelen tener lugar dentro de las primeras 3 semanas de comenzar el cultivo24. Las condiciones in vitro aún no han sido lo suficientemente optimizadas para servir a todas las células del sistema nervioso simultáneamente, de una manera similar a su entorno natural. Por ejemplo, el uso de Ara-C para inhibir la proliferación de células no neuronales es bastante común en estudios donde lograr una mayor tasa de supervivencia de las células neuronales es una prioridad. Así, la calidad de los cultivos primarios se basa en métodos que reequilibran artificialmente la población celular in vitro en favor de los tipos de células de interés25,26. A pesar de sus limitaciones, el cultivo celular primario es un excelente enfoque para estudiar los mecanismos celulares, las vías de señalización y los cambios fenotípicos y geotípicos en condiciones donde el crecimiento celular optimizado (sujeto a los objetivos específicos de la investigación) es cuidadosamente caracterizado y comparado con la situación in vivo. Además, el cultivo cerebeloso primario como sistema de modelo simplificado proporciona un microambiente controlado para investigar la plétora de efectos morfológicos y fisiológicos mediados por las numerosas moléculas que afectan a las células neuronales27, 28. Sin embargo, ¿hasta qué punto las propiedades fisiológicas de estas células se conservan fuera del ajuste in vivo sigue siendo completamente aclarado.
El método presentado es un protocolo general rentable para el cultivo de células primarias. Proporciona opciones más amplias para manipular células y probar fármacos sin cambiar la naturaleza de las células, lo cual es crucial para los ensayos (pre)clínicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estos estudios fueron apoyados por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (HM: NSERC Discovery Grant - RGPIN-2018-06040), y Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant n.o 320035), y la ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
