Summary
Gennemførelse in vitro forsøg til at afspejle in vivo betingelser så tilfredsstillende som muligt er ikke en let opgave. Brugen af primær cellekulturer er et vigtigt skridt i retning af at forstå cellebiologi i en hel organisme. Den medfølgende protokol skitserer, hvordan man med held vokse og kultur embryonale mus cerebellar neuroner.
Abstract
Brugen af primære cellekulturer er blevet et af de vigtigste værktøjer til at studere nervesystemet in vitro. Det ultimative mål med dette forenklede model system er at give et kontrolleret mikromiljø og opretholde den høje overlevelsesrate og de naturlige træk ved dissocierede neuronal og nonneuronal celler så meget som muligt under in vitro-betingelser. I denne artikel, vi demonstrere en metode til at isolere primære neuroner fra at udvikle musen cerebellum, placere dem i et in vitro-miljø, etablering af deres vækst, og overvågning af deres levedygtighed og differentiering i flere uger. Denne metode gælder for embryonale neuroner dissocieret fra cerebellum mellem embryonale dage 12 – 18.
Introduction
I flere årtier, cellelinjer har været meget anvendt som en høj gennemløb værktøj i prækliniske undersøgelser og biologisk forskning. Omkostningseffektivitet, hurtig vækst, og reduktion af levende dyr brug er nogle fordele ved at bruge disse celler. Imidlertid akkumuleres genetiske forandringer og fænotypiske ændringer efter flere passager in vitro1. Fejlidentifikation af cellelinjer og genetisk dissimilaritet fra primære celler kan føre til irreproducerbare eksperimenter og falske konklusioner2,3,4,5. Derfor, på trods af nogle ligheder med differentierede celler såsom neuroner (f. eks neurotransmittere, Ion kanaler, receptorer, og andre neuron-specifikke proteiner), neuronal cellelinjer kan ikke replikere den fulde fænotype af neuroner. Ved hjælp af modne neuroner er en anden mulighed; men disse celler er ikke-dividere postmitotiske celler, der er vanskelige at udbrede i kulturen. Desuden kan genindførsel i cellecyklussen udløse apoptose6.
Tredimensionelle (3D) cellekultur, organotypiske skive kulturer, og organoid kulturer er blevet udviklet til at give et miljø, hvor cellerne kan arrangere i en 3D-form, der efterligner in vivo-indstillingen. Således celle-til-celle kommunikation, migration, invasion af tumorceller i omgivende væv, og angiogenese kan undersøgt7. Men, ekstra omkostninger ved at bruge ekstracellulære matrix (ECM) proteiner eller syntetiske silicagelrogeler som en strøelse, problemer med billeddannelse, og kompatibilitet med High-gennemløb screening instrumenter er betydelige ulemper ved 3D-celledyrkning. En væsentlig ulempe ved organotypic vævs skive kultur er brugen af et stort antal dyr og de negative virkninger af axotomi, hvilket fører til manglende adgang til mål og vækstfaktorer for axons, og dermed neuronal død8.
Derfor er en alternativ tilgang, som undgår problemer med cellelinjer, vanskeligheden ved at dyrke modne celler, og kompleksiteten af væv, er in vitro modning af umodne primære celler. Primær cellerne udledes direkte fra humane eller animalske væv og adskilles ved hjælp af enzymatiske og/eller mekaniske metoder9. De vigtigste principper for isolation, såning, og vedligeholdelse i kulturmedium er ens uanset vævs kilden. Men de trofiske faktorer, der er nødvendige for at fremme spredning og modning er meget celle specifikke6.
At kende "fødselsdato" for hver cerebellare celletype er en forudsætning for at designe et primært kultur eksperiment. I almindelighed, Purkinje celler (PCs) og neuroner i cerebellare kerner (CN), er født før de mindre celler, herunder interneuroner (f. eks, kurv, stellate celler) og granulet celler. Hos mus dukker der pc'er op mellem embryon dag (E) 10 – E13, mens CN neuroner ved ca. E9 – E1210.
Andre cerebellar neuroner er født meget senere. For eksempel, i mus, den Golgi delpopulation af interneuroner er genereret fra VZ ved (~ E14 − E18) og den resterende interneuroner (kurve celle og stellate celler) placeret i det molekylære lag opstår fra at dividere stamceller i den hvide substans mellem tidligt postnatale (P) 0 – P711. Granule celler genereres fra den eksterne avlsmateriale zone (egz), en sekundær germinale zone, der er afledt af rostral Columns rhombisk LIP og går gennem Terminal division efter fødslen. Men før deres prækursorer opstår fra rhombisk LIP fra E13-E16, har cellerne allerede migreret rostrally langs Pia overfladen for at lave et tyndt lag af celler på rygoverfladen af cerebellum Anlage. Nonneuronal makrogliale celler såsom astrocytter og oligodendrocytter, som stammer fra ventrikulær neuroepitel, er født på e 13.5 − p0 og p0 − P7 henholdsvis11,12,13,14 ,15. Microglia er afledt af blomme-SAC primitive myeloide stamceller mellem E8-E10 og efter invasion i centralnervesystemet kan påvises i muse hjernen af E916.
Metoden i denne artikel er baseret på den, der oprindeligt blev udviklet af Furuya et al. og Tabata et al.17,18, som blev optimeret til primær dyrkning af Purkinje celler afledt af Wistar rotte cerebella. Vi har nu tilpasset denne metode og omhyggeligt modificeret den til at studere væksten af mus cerebellar neuroner19. I modsætning til i vores nye protokol, kold dissektion medium er den vigtigste vaskebuffer anvendes under dissektion og dissociation trin før tilsætning af såning medium i Furuya protokol17. Denne buffer mangler ernæring, vækstfaktorer og hormoner (alle i Dulbecco's modificerede Eagle medium: næringsstof blanding F-12 [DMEM/F12]), der er nødvendige for at understøtte cellevækst og overlevelse under de førnævnte trin. Ud fra vores omfattende erfaring med murine primære cerebellare kulturer har vi desuden brugt 500 μL kulturmedium i hver brønd (i stedet for 1 mL) og øget Tri-iodothyroninkoncentrationen til 0,5 ng/mL, hvilket forbedrer væksten af neuronal celler, i især dem med en Purkinje celle fænotype, og fremmer den udvækst af dendritiske grene i kulturen. Den vigtigste metode i denne artikel kan anvendes bredt på andre små gnavere (f. eks. egern og hamstere) under fosterudviklingen og kan anvendes til at studere cerebellare neurogenese og differentiering i de forskellige embryonale stadier, som forskellige arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle regler og vejledning i pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra det canadiske råd for dyrepleje og er blevet godkendt af lokale myndigheder ("The Bannatyne campus Animal Care Udvalg "). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere antallet og lidelser af dyr, der anvendes. Tilstrækkelig dybde af anæstesi blev bekræftet ved at observere, at der ikke var nogen ændring i respiratorisk hastighed forbundet med manipulation og tå knivspids eller hornhinden refleks.
1. forberedelse
Bemærk: Planlæg levering af tidsindstillede gravide mus, baseret på forsknings planen, for post-Conception E12 – E18. Valg af timing afhænger af de ønskede celle karakteristika (se nedenfor). Klargør dæksedlerne og-pladerne mindst 2 dage før forsøget. Poly-L-ornithine bruges som en belægning materiale til at forbedre celle fastgørelse til dækning glider.
- Frakke dækslet glider 2 dage før celle isolation.
- Anbring det runde Cover i en 24-brønd plade under sterile forhold i et biosikkerheds kabinet. Efterlad et mellemrum mellem hver følgeseddel for at undgå kontaminering.
- Tilsæt 90 μL poly-L-ornithin (PLO, 500 μg/mL) til midten af hver følgeseddel. Luk hætten og Anbring forsigtigt pladen i en 37 °C/5% CO2 -inkubator i 2 dage.
Bemærk: en større mængde kan spilde dæksedlen under inkubationen. Følgesedlen behøver ikke at være helt dækket med PLO efter at have placeret en dråbe. I løbet af natten inkubation, fordeler PLO lige til kanten af dæksedlen.
- En dag før celle isolation, Forbered kulturmediet I (DMEM/F-12 indeholdende putrescine 100 μM, natriumselenit 30 nm, L-glutamin 3,9 mm, gentamicin 3,5 μg/ml, Tri-iodothyronin (T3) 0,5 ng/ml, og N3 kosttilskud [progesteron 4 μM, insulin 20 μg/ml, transferrin 20 mg/mL]) og sånings medium (dyrkningsmedium i [uden N3 og T3] indeholdende 10% føtal bovint serum [FBS]) og opbevar dem i 4 °C. Forbered trypsin-arbejdsopløsningen (0,25%) i DMEM/F12 og opbevares ved 4 °C.
Bemærk: de mellemstore kompositioner er angivet i tabel 1. - På dagen for celle isolation, Placer kulturmedium i og såning medium i inkubator ved 37 °C.
Bemærk: før du starter cerebellum isolation, skal du sørge for, at alle de værktøjer og arbejdsflader er sterile. - Vask dæksedler.
- Tag 24-brønd pladen ud af inkubator.
- Vask dæksedlerne i 24-brønd pladen 3x med dobbeltdestilleret vand (DDW) i et biosikkerheds kabinet under sterile forhold. Hver gang Lad dækslet glide i DDW i 5 min før start aspiration.
- Lad dækslet glide i et biosikkerheds kabinet i mindst 2 timer for at tørre helt.
2. cerebellum samling
- Forbered 3 10 cm sterile plastik Petri skåle fyldt med iskold 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS), 3 Petri skåle fyldt med iskold 1x hank's afbalancerede saltopløsning (hbss) og ca. 5 petriskåle fyldt med iskold dissektion medium (1x hbss indeholdende gentamicin 10 μg/mL). Hold dem på is.
- Anesthetize E18 CD1 gravid mus med 40% isoflurane. Udfør livmoderhals dislokation på musen. Steriliser maven med 70% ethanol opløsning.
- Brug et par saks til at gøre en hud indsnit fra den kønsbehåring låsen til xiphoid proces. Hold derefter huden med pincet og Åbn bughulen.
- Punktafgiftsområdet livmoder horn med tang og vaske dem 3x i iskold 1x PBS på is.
Bemærk: de følgende trin bør alle udføres på is for at minimere stofskiftet og forhindre vævs-og celleskader.
3. dissecting cerebellum
- Efter det sidste vaske trin, ved hjælp af et par fine pincet adskille embryoner fra livmoderen i 1x HBSS og overføre dem til iskold dissektion medium. I dissektion medium, halshug embryoner med saks. Placer vævet i et rent dissektions medium.
Bemærk: brug af et stereomicroskop til microdissection er valgfrit. - Hold kraniet med fine tang og skær gennem calvariumet med et par små sakse fra det laterale aspekt af kraniet i en linje fra foramen magnum til den udvendige akustiske maetus og den nedre kant af orbital hulrummet.
Bemærk: at tage dette trin udsætter kraniehulen på niveauet af kraniet base og gør det lettere at fjerne hjernen. - Ved hjælp af et par fine pincet, fjerne kraniet base og skræl kraniet væk fra hjernen.
- Fjern forsigtigt meninges på cerebellum, begyndende fra den laterale overflade af den midterste cerebellare pedonkel og Pons.
- Skær både cerebellare pedonler og adskille cerebellum fra resten af hjernen (figur 1).
- Placer straks den indsamlede cerebella i et sterilt 15 mL konisk rør fyldt med 14 mL DMEM/F12 på is.
- Centrifuger røret ved 1.000 x g, 4 °c i 1 min, 3x. Hver gang forsigtigt fjerne supernatanten med en pipette og resuspendere pellet i frisk, iskold DMEM/F12.
Bemærk: for at undgå at tabe prøverne, skal du bruge kabinettet suge så lidt som muligt.
4. dissociation af cerebellum
- Tilsæt 2 ml forvarmede (37 °c) trypsin til pellet fra trin 3,7 og forsigtigt pipet for tilstrækkelig blanding.
- Anbring røret i et 37 °C-vandbad i 12 minutter.
- Efter inkubation skal røret bringes til et biosikkerheds kabinet og tilsættes 10 mL DMEM/F12 for at inaktivere trypsin.
- Blandingen centrifugeres ved 1.200 x g i 5 min. kassér supernatanten, og genopstop pellet i frisk DMEM/F12. Gentag 3x.
- Forvåd et sterilt plastik overførings pipet med DMEM/F12.
- Efter vask og den endelige centrifugering tilsættes 3,5 mL DNase-arbejdsopløsning (1 mL DNase I-stamopløsning [0,05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1X hbss] i 500 μl varme INAKTIVEREDE fb'er og 2 ml DMEM/F12) til pellet i samme rør.
- Triturate vævet med et pipet mindst 30x, indtil blandingen opnår en homogen mælkeagtig farve.
5. celle samling
- Tilsæt 10 mL iskold DMEM/F12 til blandingen.
- Prøven centrifugeres ved 1.200 x g, 4 °c i 5 min.
- Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet.
- Fjern sånings mediet fra inkubator.
- Tilsæt 500 μL forvarmet såning medium til pellet og bland det meget godt ved hjælp af et pipet til at resuspendere cellerne.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer.
- Fortynd cellesuspensionen med sånings mediet til en densitet på 5 x 105 celler/ml.
- Under et biosikkerheds kabinet tilsættes 90 μL af den fortyndede blanding til hver brønd i midten af dæksedlen.
Bemærk: de partikler, der ikke blev suspenderet i DNase, må ikke indlæses. - Pladen placeres i inkubator ved 37 °C i 3 − 4 timer.
- Efter inkubation tilsættes 500 μL forvarmet kulturmedium I til hver brønd, og pladen placeres tilbage i inkubeatoren (37 °C).
6. behandling af de gendannede celler
- Efter 7 dage skal det gamle medium udskiftes med frisk kulturmedium II (dyrkningsmedium I suppleret med cytosin arabinosid [ara-C, 4 μM] og 100 μg/mL bovint serumalbumin [BSA]; Se tabel 1).
Bemærk: dette trin er afgørende for at undgå vækst af nonneuronal celler. - Overvåg kulturmediet en gang om dagen. Hvis pH ændres (indikeret med en markant farveændring, sædvanligvis gullavere), fjernes halvdelen (næsten 250 μL) af det gamle medium fra alle brønde, og der tilsættes 300 μL forvarmet kulturmedium I til hver af dem for at undgå tab af næringsstoffer.
Bemærk: phenol rød i kulturmedium er en god indikator for pH af mediet og aktiviteten af cellerne. Prøv at minimere eksponeringstid af cellerne til ud af inkubator betingelser. Dette forhindrer enhver stress, der kan påvirke deres levedygtighed.
7. celle opsamling og-fiksering
Bemærk: afhængigt af det eksperimentelle design, kan cellerne indsamles på enhver dag, på ethvert tidspunkt.
- Forbered en separat 24 brønd plade med den tilsvarende numeriske organisation og tilsæt 100 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) til hver brønd.
- Hvis du vil høste celler på de ønskede dage (afhængigt af forsøgsprotokollen), skal du forsigtigt fjerne dæksedlerne fra brøndene på den oprindelige kultur plade og anbringe dem i de tilsvarende brønde på den PFA-fyldte plade.
- Tilsæt PFA til brøndene for helt at nedsænke dæksedlerne.
Bemærk: for at undgå, at cellen løsrives fra følgesedlen, må du ikke tilføje PFA direkte på følgesedlen. - PFA-pladen opbevares ved 4 °C i 30 − 120 minutter.
- Efter inkubation skal pladen gendannes til stuetemperatur.
- Vask forsigtigt dæksedlen 3x i 5 min med 1x PBS.
- Fortsæt til immunofarvnings processen.
Bemærk: i dette studie blev et fluorescens mikroskop udstyret med et kamera brugt til at fange billederne og samles i montager ved hjælp af en billedredigeringssoftware applikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseret på de forskellige fødselsdatoer af neuronal undertyper i cerebellum, kulturer fra E12-E18 muse embryoner gav forskellige celletyper. Store projektion neuroner, såsom CN neuroner (E9 − E12) og pc'er (E10 − E13), opstod tidligt under cerebellare udvikling. I mus opstod granulet og Golgi celler mellem ~ E13 – E18 og gennemgik Terminal divisioner op til postnatal uge 4.
Udskiftning af gamle medium i med frisk kulturmedium II på dage in vitro (DIV) 7 vil I sidste ende forhindre gliaceller celle proliferation. Det molekylære lags interneuroner, såsom kurve-og stellatceller, differentieres efter fødslen. Derfor forventes de fleste af cellerne i dyrkningsmediet ved E18 at være en kombination af pc'er, granulet celler, CN og nogle Golgi-celler. Calbindin 1 (CALB1), en specifik markør for pc'er, blev brugt til at spore de morfologiske ændringer i løbet af 21-dages tidsforløbet. På DIV 0 var celle ligene af pc'er detekterbare (f. eks. 10 − 11 timer inkubation), men den udvækst af neurite var endnu ikke påbegyndt (figur 2a). Af DIV 3, den axonal udvidelse viste fremskridt, mens dendritiske processer var lige begyndt. Denne status forblev næsten uændret indtil den anden uge in vitro (WIV) (figur 2b–D). På DIV 10 begyndte et par sparsomme grene og primære dendritter med spines at vokse (figur 2E). Spiring af de nye primære dendritter forekom kontinuerligt efter DIV 14. Derfor, efter DIV 14, antallet af sekundære og tertiære dendritter steg og udviklede brede filialer på DIV 21 (figur 2F,G).
Det er vigtigt at vide, at timingen af morfologiske ændringer in vitro ikke kan følge samme mønster som in vivo. Efter disse resultater blev den dissocierede cerebellar primordia fra E12, E13, E14 og E15 i et andet eksperiment dyrket i 3 uger. De dyrkede pc'er fra E12 og E13 har ikke udviklet nogen dendritisk udvækst på DIV 18 undtagen axonal extensions (figur 3a,B). Efter samme tidsperiode viste de dissocierede cerebellar primordium-kulturer fra E14 og E15 imidlertid dendritiske udvækst og arborisering (figur 3c,D). Denne vækstrytme variation blandt neurale celler in vitro kaster lys på en stor ændring, der skete i deres naturlige miljø mellem den tidlige og sene fase af cerebellare udvikling, som skal anvendes in vitro for medium optimering.
Sammen med pc'er, der er andre neuronal celletyper i cerebellum, der udvikler sig under dissocierede primære cerebellare kulturer, der kan påvises ved hjælp af specifikke neuronal markører. Dobbelt immunofluorescens mærkning for CALB1 og et calcium bindende albumin protein, parvalbumin (PVALB), viste, at CALB1 udtryk udelukkende var begrænset til pc'er i primære cerebellare kulturer, mens PVALB blev udtrykt i CALB1+ neuroner ( Pc'er) og PVALB+/Calb1– neuroner, som er molekylært interneuroner (kurve/Stellatceller) (figur 4a–C). Alpha-under enheden (nav1,6) på den spændings-gated natrium kanal (SCN) er en markør for granulet celler og pc'er i cerebellum20. Dobbelt mærkning med anti-SCN og anti-CALB1 viser samlokaliseringen af granulet celle legemer og pc'er i kulturmedium på DIV 21 (figur 4d-F). For andre specifikke cerebellare celletyper fra dissocierede primære cerebellare kulturer, se venligst Marzban og Hawkes19.
Figur 1: dorsale aspekt af muse hjernen skitserer cerebellum ved E18. Meninges er indikeret med gule firkanter. Placeringen af cerebellum er skitseret af den gule linje, som er begrænset rostrally af midthjernen og caudally af medulla oblongata (skitseret af brune stiplede linjer). Cerebellum vermis og halvkugle er vist ved brune stiplede linjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: udvikling af Purkinje celler (pc'er) afledt af mus cerebellum ved E18 i primær kultur for dage in vitro (div) 0 – 21. (A) PC somata (arrowheads) var mærket med immunofluorescens ved hjælp af anti-calbindin 1 (CALB1) ved div 0 (efter 10 h). (B) den første axonal forlængelse (pil) og tidlig dendritisk udvækst (Arrowhead) vises på div 3. Pc'erne ' dendritiske udvækst og udvikling (Arrowhead) fortsætter på DIV 5 (C) og div 7 (D). PCs ' dendritiske grene er tydeligt skelne på DIV 10 (E) og div 14 (F) (arrowheads) og udførlige dendritiske træer er detekterbare på div 21 (Arrowhead) (G). Skala stænger: A = 100 μm (gælder for paneler B, C, D, E og F); G = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: udvikling af Purkinje celler (pc'er) afledt af mus cerebellar primordium på E12, E13, E14 og E15 efter 18 dage i primær kultur (div 18). Axoner er de eneste udvidelser (Arrow) fra pc'en somata i primær kultur af E12 og E13 cerebella primordium efter 18 dage in vitro (div 18) (A,B). Pc'erne ' dendrit udvækst og Extension udvikler sig af div 18 (Arrowhead) kun fra E14 (C) og E15 (D) cerebellar primære kulturer. Scale bar = 20 μm (gælder for paneler A−D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: immunofluorescens mærkning af pc'er, GABAergic interneuroner (kurv og stellate celler), og granulet celler fra E18 mus cerebellar primær kultur på div 21. (A−C) Dobbelt mærkning med anti-CALB1 (grøn) og anti-pvalb (rød) viser pc'er og et par interneuroner (Arrow) i kontakt med PC dendritiske Arbors. (D−F) Spændings-gated natrium kanaler (SCNs) i PC-organer med uddybede dendritter og talrige små granulat celle legemer (Arrowhead) er mærket med anti-SCN (rød) og dobbelt-mærket med anti-CALB1 (grøn). Forkortelser: Purkinje celler = pc'er; CALB1 = calbindin 1; PVALB = parvalbumin; SCN = spændings-gated natrium kanal. Scale bar = 100 μm (gælder for A−F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Grundlæggende medium | Putrescine | Natriumselenit | L-glutamin | Gentamicin | T3 | N3 | Bsa | Ara-C | Fbs |
| Kulturmedium I | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | 0,5 ng/mL | Progesteron 4 μM, insulin 20 μg/mL, transferrin 20 mg/mL | - | - | - |
| Såning medium | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | - | - | - | - | 10% med kulturmedium I |
| Kulturmedium II | Kulturmedium I | 100 μg/mL | 4 μM | - | ||||||
Tabel 1: medie sammensætninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af primære kulturer er en velkendt metode, der gælder for alle typer af neuroner17,18,19. I den præsenterede protokol forklarer vi, hvordan man isolerer cerebellare neuroner og bevarer deres levedygtighed med optimal overlevelse in vitro i højst 3 uger. Primær kultur af cerebellare celler, som blev isoleret ved E15 − E18, bekræfter indsamlingen af tre klasser af store neuroner: pc'er, Golgi celler, og CNs. Celle kroppe og fremskrivninger af Golgi-celler (hvoraf nogle dukker op ved E19 − P5) og Soma af granulet celler kan påvises ved neurogranin (nrgn) og SMI32 antistoffer, henholdsvis inden for 21 dage af kultur19,21.
En kritisk faktor for overlevelse og vedligeholdelse af cerebellare neuroner er den type af kulturmedium, der anvendes. FBS suppleret medium har været en standard betingelse for cellelinjer og primær kultur i årtier. Men, etiske bekymringer, variabilitet i serum sammensætning, og dens potentiale til at være en kilde til kontaminering, har ført til en vis forsigtighed22. For nylig blev supplement-beriget DMEM/F-12 medium fundet for at reducere kløften mellem fysiologiske forhold og in vitro neuronal modeller. Mediet foreslået af Furuya et al. øget overlevelsesraten for pc'er og forbedret deres dendrit differentiering sammenlignet med den udbredte basal medium Eagle (BME)-baseret serum-fri medium17,18,23. Dette medium er blevet grundlaget for kemisk definerede medier implementeret i cerebellum celle primær kultur.
Primær celledyrkning af neuroner har begrænsninger. Som i enhver in vitro-kultur, kan cellerne overleve i en begrænset periode. Uden undtagelse, primære neuronal celler kultiveret in vitro kan kun være urerne et begrænset antal gange. Overdreven passaging vil påvirke cellulære sundhed, funktion, og fænotype, og som sådan gøre variable eksperimentelle resultater. Derfor, neuronal/nonneuronal primær kultur-baserede eksperimenter normalt finde sted inden for de første 3 uger af starten af kulturen24. In vitro-betingelserne er endnu ikke blevet tilstrækkeligt optimeret til at betjene alle celler i nervesystemet samtidig, på en måde svarende til deres naturlige miljø. For eksempel, ved hjælp af ara-C at hæmme spredningen af nonneuronal celler er ganske almindeligt i undersøgelser, hvor opnåelse af en højere overlevelsesrate af neuronal celler er en prioritet. Således, kvaliteten af primære kulturer bygger på metoder, der kunstigt rebalancerer in vitro celle befolkning til fordel for celletyper af interesse25,26. På trods af sine begrænsninger, primær cellekultur er en glimrende tilgang til at studere cellulære mekanismer, signalering veje, og pheno-og genotypiske ændringer under forhold, hvor optimeret cellulære vækst (underlagt de specifikke forskningsformål) er omhyggeligt karakteriseret og sammenlignet med in vivo-situationen. Desuden giver primær cerebellare kultur som et forenklet model system et kontrolleret mikromiljø til at undersøge den overflod af morfologiske og fysiologiske effekter medieret af de talrige molekyler, der påvirker neuronal celler27, 28. Men i hvilket omfang disse cellernes fysiologiske egenskaber bevares uden for in vivo-indstillingen, er fortsat fuldt belyst.
Den præsenterede metode er en omkostningseffektiv generel protokol for dyrkning af primære celler. Det giver bredere muligheder for at manipulere celler og teste narkotika uden at ændre karakteren af cellerne, hvilket er afgørende for (præ-) kliniske forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra naturvidenskab og ingeniør Forskningsråd (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040) og Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035) og ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson translational team Grant (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
