Summary
Det er ikke en lett oppgave å utføre in vitro-eksperimenter for å reflektere in vivo-forhold så godt som mulig. Bruken av primær cellekulturer er et viktig skritt mot å forstå cellebiologi i en hel organisme. Den oppgitte protokollen skisserer hvordan du lykkes vokse og kultur embryonale musen lillehjernen neurons.
Abstract
Bruken av primær cellekulturer har blitt en av de viktigste verktøyene for å studere nervesystemet in vitro. Det endelige målet med å bruke dette forenklede modell systemet er å gi en kontrollert mikromiljøet og opprettholde den høye overlevelsesraten og de naturlige egenskapene til dissosiert neuronal og nonneuronal celler så mye som mulig under in vitro forhold. I denne artikkelen viser vi en metode for å isolere primære neurons fra å utvikle musen lillehjernen, plassere dem i et in vitro miljø, etablere sin vekst, og overvåke deres levedyktighet og differensiering i flere uker. Denne metoden gjelder for embryonale neurons dissosiert fra lillehjernen mellom embryonale dager 12-18.
Introduction
I flere ti år har cellelinjer blitt mye brukt som en høy gjennomstrømming verktøy i prekliniske studier og biologisk forskning. Kostnadseffektivitet, rask vekst, og reduksjon av levende dyr bruk er noen fordeler ved å bruke disse cellene. Men genetiske endringer og phenotypical endringer akkumuleres etter flere passasjer in vitro1. Forveksling av cellelinjer og genetiske dissimilarity fra primær celler kan føre til ved uforklarlige eksperimenter og falske konklusjoner2,3,4,5. Derfor, til tross for noen likheter med differensiert celler som neurons (f. eks, nevrotransmittere, ion kanaler, reseptorer, og andre Nevron-spesifikke proteiner), neuronal cellelinjer kan ikke gjenskape den fulle fenotype av neurons. Bruke modne neurons er et annet alternativ; disse cellene er imidlertid ikke-dividere postmitotic celler som er vanskelig å spre i kulturen. Videre re-oppføring i celle syklus kan utløse apoptose6.
Tredimensjonal (3D) cellekultur, organotypic skive kulturer, og organoid kulturer har blitt utviklet for å gi et miljø der cellene kan ordne i en 3D-form som etterligner in vivo innstillingen. Således, celle-til-celle kommunikasjon, migrasjon, invasjon av tumorceller i omkringliggende vev, og angiogenese kan bli studert7. Men, ekstra kostnader ved bruk av ekstra mobilnettet matrise (ECM) proteiner eller syntetiske hydrogeler som et sengetøy, vanskeligheter med bildebehandling, og kompatibilitet med høy gjennomstrømming screening instrumenter er betydelige ulemper av 3D celle dyrking. En stor ulempe med organotypic vev Slice kultur er bruken av et stort antall dyr og de negative virkningene av axotomy, som fører til utilgjengelighet av mål og vekstfaktorer for axons, og følgelig neuronal død8.
Derfor er en alternativ tilnærming, som unngår problemer med cellelinjer, vanskeligheten av voksende modne celler, og kompleksiteten av vev, er in vitro modning av umodne primære celler. Primær-celler er avledet direkte fra menneske eller animalsk vev og dissosiert ved hjelp av enzymatisk og/eller mekaniske metoder9. De viktigste prinsippene for isolasjon, seeding, og vedlikehold i kultur medium er like uavhengig av vevs kilden. Imidlertid er de trofiske faktorene som er nødvendige for å fremme spredning og modning svært celle spesifikk6.
Å vite det ' fødselsdato av hver lillehjernen celle type er en forutsetning for å designe en primær kultur eksperiment. Generelt, Purkinje celler (PCs) og neurons av lillehjernen kjerner (CN), er født før de mindre cellene, inkludert interneurons (f. eks, kurv, Stel celler) og granule celler. I mus, PCer komme mellom embryonale dagen (E) 10-E13, mens CN neurons på ca E9-E1210.
Andre lillehjernen neurons er født mye senere. For eksempel, i mus, Golgi pasientpopulasjonen av interneurons er generert fra VZ på (~ E14 − E18) og de resterende interneurons (kurv celle og Stel celler) som ligger i molekyl laget komme fra å dele stamceller i den hvite saken mellom tidlig Postnatal (P) 0 – P711. Granule celler er generert fra den eksterne Germinal sonen (EGZ), en sekundær Germinal sone som er avledet fra rostral rhombic leppe og går gjennom Terminal divisjon etter fødselen. Men før deres forløpere oppstår fra rhombic leppe fra E13-E16, har cellene allerede migrert rostrally langs Pia overflate for å gjøre et tynt lag av celler på rygg overflaten av lillehjernen anlage. Nonneuronal macroglial celler som astrocytter og oligodendrocytes, som stammer fra ventrikkel neuroepithelium, er født på e 13,5 − p0 og p0 − P7 henholdsvis11,12,13,14 ,15. Mikroglia er avledet fra eggeplomme-SAC primitive myelogen stamceller mellom E8-E10 og etter invasjonen i sentralnervesystemet kan oppdages i musen hjernen ved E916.
Metoden som presenteres i denne artikkelen er basert på den som opprinnelig ble utviklet av FURUYA et al. og Tabata et al.17,18, som var optimalisert for primær dyrking av Purkinje celler avledet fra Wistar Rat cerebella. Vi har nå tilpasset denne metoden og nøye modifisert den til å studere veksten av mus lillehjernen neurons19. I motsetning til inne våre ny protokollen, kulden disseksjon medium er det hovedavdeling vasket buffer anvendt i løpet av disseksjon og dissosiasjon skritt tidligere tilføyer seeding medium inne FURUYA ' protokollen17. Denne bufferen mangler ernæring, vekstfaktorer, og hormoner (alt i Dulbecco ' s modifisert Eagle medium: næringsstoff blanding F-12 [DMEM/F12]) som er nødvendig for å støtte cellevekst og overlevelse i løpet av de nevnte trinnene. I tillegg, basert på vår omfattende erfaring med murine primære lillehjernen kulturer, har vi brukt 500 μL av kultur medium i hver brønn (i stedet for 1 mL) og økt Tri-iodothyronine konsentrasjon til 0,5 ng/mL, noe som forbedrer veksten av neuronal celler, i spesielt de med en Purkinje celle fenotype, og fremmer utvekst av dendrittiske grener i kulturen. Den viktigste metoden omtalt i denne artikkelen kan grovt brukes på andre små gnagere (f. eks, ekorn og hamstere) under embryonale utviklingen og kan brukes til å studere lillehjernen neurogenesis og differensiering i de ulike embryonale stadier, som variere mellom arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med institusjonelle forskrifter og guide til omsorg og bruk av eksperimentelle dyr fra Canadian Council for Animal Care og har blitt godkjent av lokale myndigheter ("The Bannatyne campus Animal Care Komiteen "). Alle anstrengelser var innrettet til minimere antallet og lider av dyrene anvendt. Tilstrekkelig dybde av anestesi ble bekreftet ved å observere at det ikke var noen endring i respirasjonsfrekvensen forbundet med manipulasjon og tå knipe eller hornhinnen refleks.
1. forberedelse
Merk: Planlegg levering av tidsbestemte gravide mus, basert på forsknings plan, for post-unnfangelsen E12 – E18. Valg av timing avhenger av de ønskede celle egenskaper (se nedenfor). Klargjør dekk sedlene og platene minst to dager før eksperimentet. Poly-L-Ornithine brukes som et belegg materiale for å forbedre celle vedlegget til dekselet slips.
- Coat dekselet slips 2 dager før celle isolasjon.
- Legg den runde dekselet slips i en 24 brønn plate, under sterile forhold i et biosafety kabinett. Legg igjen et gap mellom hver deksel slip for å unngå forurensning.
- Tilsett 90 μL av Poly-L-Ornithine (PLO, 500 μg/mL) til midten av hver deksel seddel. Lukk hetten og forsiktig plassere platen i en 37 ° c/5% CO2 inkubator i 2 dager.
Merk: et større volum kan smitte fra deksel sedlene under inkubasjons. Cover slip trenger ikke å være helt dekket med PLO etter å ha plassert en dråpe. I løpet av overnight-inkubasjons distribuerer PLO like mye til kanten av omslaget.
- En dag før celle isolasjon, forberede kulturen medium I (DMEM/F-12 inneholder putresin 100 μM, natrium selenitt 30 nM, L-glutamin 3,9 mM, Gentamicin 3,5 μg/mL, Tri-iodothyronine (T3) 0,5 ng/mL, og N3 kosttilskudd [progesteron 4 μM, insulin 20 μg/mL, transferrin 20 mg/mL]) og seeding medium (kultur medium jeg [uten N3 og T3] som inneholder 10% fosterets storfe serum [FBS]) og lagre dem i 4 ° c. Klargjør Trypsin arbeids løsning (0,25%) i DMEM/F12 og oppbevar den ved 4 ° c.
Merk: medium komposisjoner er gitt i tabell 1. - På dagen for celle isolasjon, sted kultur medium jeg og seeding medium i inkubator ved 37 ° c.
Merk: før du starter lillehjernen isolasjonen, må du sørge for at alle verktøyene og arbeidsflatene er sterile. - Vask deksel slips.
- Ta 24 brønn plate ut av inkubator.
- Vask dekselet glir på 24 brønn platen 3x med dobbelt destillert vann (DDW) i et biosafety kabinett under sterile forhold. Hver gang la dekselet slips suge i DDW i 5 min før du starter aspirasjon.
- La trekket skli i et biosafety skap i minst 2 timer til helt tørt.
2. lillehjernen samling
- Forbered 3 10 cm steril plast Petri retter fylt med iskald 1x fosfat-bufret saltvann (PBS), 3 Petri retter fylt med iskald 1x Hank ' s balansert saltløsning (HBSS), og ca 5 Petri retter fylt med iskald disseksjon medium (1x HBSS inneholder Gentamicin 10 μg/mL). Hold dem på isen.
- Bedøve E18 CD1 gravid mus med 40% isoflurane. Utfør cervical forvridning på musen. Sterilisere magen med 70% etanol løsning.
- Bruk en saks for å lage en hud snitt fra kjønnshår symphesis til xiphoid prosessen. Deretter holder huden med pinsett og åpne bukhulen.
- Avgiftsdirektoratet livmor hornene med pinsett og vask dem 3x i iskaldt 1x PBS på isen.
Merk: følgende trinn bør alle være gjennomført på isen for å minimere metabolske rate og hindre vev og celle skade.
3. dissekere lillehjernen
- Etter siste vask trinn, ved hjelp av et par fine pinsett skille embryo fra livmoren i 1x HBSS og overføre dem til iskald disseksjon medium. I disseksjon medium, halshugge embryo med saks. Plasser vevet i et rent disseksjon medium.
Merk: bruk av stereomikroskopet for microdissection er valgfritt. - Hold skallen med fine tang og skjære gjennom calvarium med et par små saks fra lateral aspekt av skallen i en linje fra foramen Magnum til eksterne akustiske meatus og dårligere grensen av orbital hulrom.
Merk: å ta dette steget eksponerer skallen hulrom på nivået av skallen basen og gjør det lettere å fjerne hjernen. - Ved hjelp av et par fine tang, fjerne skallen base og skrelle skallen bort fra hjernen.
- Forsiktig fjerne hjernehinnene på lillehjernen, fra den laterale overflaten av midten lillehjernen peduncle og Pons.
- Skjær begge lillehjernen peduncles og Skill lillehjernen fra resten av hjernen (figur 1).
- Plasser umiddelbart de innsamlede cerebella i et sterilt 15 mL konisk rør fylt med 14 mL DMEM/F12 på is.
- Sentrifuger røret ved 1 000 x g, 4 ° c i 1 min, 3x. Hver gang forsiktig fjerne det supernatanten med en pipette og resuspend det pellet inne frisk, isen-kulden DMEM/F12.
Merk: for å unngå å miste prøvene, bruk skapet suge så lite som mulig.
4. lillehjernen dissosiasjon
- Tilsett 2 mL prewarmed (37 ° c) Trypsin til pellet fra trinn 3,7 og forsiktig Pipet for adekvat miksing.
- Plasser røret i et vannbad på 37 ° c i 12 minutter.
- Etter inkubasjons, bringe røret å en biosafety skap og sammenlegge 10 mL av DMEM/F12 å deaktivere det Trypsin.
- Sentrifuger blandingen ved 1 200 x g i 5 min. kast supernatanten og resuspend pellet i frisk DMEM/F12. Gjenta 3x.
- Prewet en steril plast overførings Pipet med DMEM/F12.
- Etter vask og den endelige sentrifugering, tilsett 3,5 mL DNase arbeids løsning (1 mL DNase jeg lagerløsning [0,05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS] i 500 μL av varme-deaktivert FBS og 2 ml DMEM/F12) til pellet i samme rør.
- Triturate vevet med en Pipet minst 30x til blandingen oppnår en homogen melkeaktig farge.
5. Cell samling
- Tilsett 10 mL iskald DMEM/F12 i blandingen.
- Sentrifuger prøven ved 1 200 x g, 4 ° c i 5 min.
- Forsiktig fjerne supernatanten uten å forstyrre pellet.
- Fjern seeding medium fra inkubator.
- Tilsett 500 μL av prewarmed seeding medium til pellet og bland det veldig godt ved hjelp av en Pipet å resuspend cellene.
- Tell cellene ved hjelp av en hemocytometer.
- Fortynne celle suspensjonen med seeding medium til en tetthet på 5 x 105 celler/ml.
- Under en biosafety kabinett, tilsett 90 μL av den fortynnede blandingen til hver brønn i midten av trekket slip.
Merk: ikke Legg partiklene som ikke ble suspendert i DNase. - Plasser platen i inkubator ved 37 ° c i 3 − 4 timer.
- Etter inkubasjons, tilsett 500 μL av prewarmed kultur medium jeg til hver brønn og plassere platen tilbake i inkubator (37 ° c).
6. behandling av gjenopprettede celler
- Etter 7 dager, erstatte det gamle mediet med fersk kultur medium II (kultur medium Jeg supplert med cytosin arabinoside [Ara-C, 4 μM] og 100 μg/mL storfe serum albumin [BSA]; se tabell 1).
Merk: dette trinnet er avgjørende for å unngå vekst av nonneuronal celler. - Overvåk kultur mediet en gang om dagen. Hvis pH-verdien endres (indikert av en markert endring i farge, vanligvis yellower), fjerner du halvparten (nesten 250 μL) av det gamle mediet fra alle brønner og legger til 300 μL av prewarmed kultur medium jeg til hver av dem for å unngå nærings tap.
Merk: fenol rød i kultur medium er en god indikator på pH i medium og aktivitet i cellene. Prøv å minimere eksponeringstiden for cellene til ut av inkubator forhold. Dette hindrer stress som kan påvirke levedyktigheten deres.
7. celle innsamling og fiksering
Merk: avhengig av eksperimentell design, kan cellene samles på hvilken som helst dag, til enhver timepoint.
- Forbered en separat 24 brønn plate med tilsvarende numerisk organisasjon og tilsett 100 μL av 4% paraformaldehyde (PFA) til hver brønn.
- Å høste celler på ønsket dager (avhengig av eksperimentell protokoll), forsiktig fjerne dekselet slips fra brønnene i den opprinnelige kulturen plate og plassere dem i de tilsvarende brønner av PFA-fylte plate.
- Legg PFA til brønnene for å fullstendig senke dekselet slips.
Merk: for å unngå celle avløsning fra deksel Seddelen, må du ikke legge til PFA direkte på trekket. - Oppbevar PFA-platen ved 4 ° c i 30 − 120 min.
- Etter inkubasjons, gjenopprette platen til romtemperatur.
- Vask dekslet forsiktig 3x i 5 minutter med 1x PBS.
- Fortsett til immunostaining prosessen.
Merk: i denne studien, en fluorescens mikroskop utstyrt med et kamera ble brukt til å fange opp bilder og satt sammen til montasjer ved hjelp av et bilderedigering program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basert på de forskjellige bursdager av neuronal under typer i lillehjernen, ga kulturer fra E12-E18 en mus embryo forskjellige celletyper. Store projeksjons neurons, slik som CN neurons (E9 − E12) og PCs (E10 − E13), oppsto tidlig under lillehjernen utvikling. I mus oppsto granule og Golgi celler mellom ~ E13 – E18 og gjennomgikk Terminal divisjoner opp til postnatal uke 4.
Erstatte gamle medium jeg med fersk kultur medium II på dager in vitro (DIV) 7 vil til slutt hindre gliacellene celle spredning. Interneurons av molekyl laget, slik som kurv og Stel celler, differensiere etter fødselen. Derfor var de fleste cellene i kultur mediet på E18 forventet å være en kombinasjon av PCer, granule celler, CN, og noen Golgi celler. Calbindin 1 (CALB1), en bestemt markør av PCer, ble brukt til å spore morfologiske endringer i løpet av 21-dagers tid kurs. På DIV 0 var celle kroppene til PCer synlige (f.eks. 10 − 11 timer inkubasjons), men utvekst av neurite hadde ennå ikke startet (figur 2a). Av DIV 3, axonal forlengelsen viste fremgang, stund dendrittiske prosesser fikk rettferdig begynte. Denne statusen forble nesten uendret til den andre uken in vitro (WIV) (figur 2b–D). På DIV 10, noen spredte grener og primære dendrites med pigger begynte å vokse (figur 2e). Spirende av den nye primære dendrites skjedde kontinuerlig etter DIV 14. Derfor, etter DIV 14, antall sekundære og tertiær dendrites økt og utviklet brede grener på DIV 21 (figur 2F,G).
Det er viktig å vite at tidspunktet for de morfologiske endringene i vitro ikke kan følge samme mønster som in vivo. Etter disse resultatene, i et annet eksperiment den dissosiert lillehjernen Primordia fra E12, E13, E14, og E15 var kultivert for 3 uker. Den kultivert PCer fra E12 og E13 ikke utvikle noen dendrittiske utvekst på DIV 18 unntatt axonal Extensions (figur 3a,B). Men etter samme tidsrom, dissosiert lillehjernen primordium kulturer fra E14 og E15 viste dendrittiske utvekst og arborization (figur 3c,D). Denne veksten rytme variasjon blant nevrale celler in vitro kaster lys over en stor forandring som skjedde i sitt naturlige miljø mellom tidlig og sent stadium av lillehjernen utvikling, som må brukes in vitro for medium optimalisering.
Sammen med PCer, er det andre neuronal celletyper i lillehjernen som utvikler seg under dissosiert primære lillehjernen kulturer som kan oppdages ved hjelp av bestemte neuronal markører. Dobbel immunofluorescence merking for CALB1 og en kalsium-binding albumin protein, parvalbumin (PVALB), viste at CALB1 uttrykket var utelukkende begrenset til PCer i primære lillehjernen kulturer, mens PVALB ble uttrykt i CALB1+ neurons ( dvs., PCs) og PVALB+/CALB1– neurons, hvilke er molekylær lag interneurons (kurven/Stel celler) (skikkelsen 4a–C). Alfa-delenhet (nav1,6) på den spennings-gated natrium kanalen (SCN) er en markør for granule celler og PCer i lillehjernen20. Dobbel merking med anti-SCN og anti-CALB1 viser colocalization av granule celle organer og PCer i kultur medium på DIV 21 (figur 4d–F). For andre spesifikke lillehjernen celletyper fra dissosiert primære lillehjernen kulturer, vennligst se Marzban og Hawkes19.
Figur 1: rygg ledd av muse hjernen som beskriver lillehjernen ved E18. Hjernehinnene indikeres med gule firkanter. Plasseringen av lillehjernen er skissert av den gule linjen, som er begrenset rostrally av mellomhjernen og caudally av forlengede styres (skissert av brune stiplede linjer). Den lillehjernen vermis og halvkule er vist av brune stiplede linjer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: utvikling av Purkinje celler (PCs) avledet fra musen lillehjernen på E18 i primær kultur for Days in vitro (div) 0 – 21. (A) PC somata (pilspisser) ble merket av immunofluorescence ved hjelp av anti-calbindin 1 (CALB1) på DIV 0 (etter 10 h). (B) den første axonal forlengelsen (pil) og tidlig dendrittiske utvekst (pilspissen) vises på div 3. Det PCs ' dendrittiske utvekst og utviklingen (pilspissen) fortsette opp på DIV 5 (C) og div 7 (D). PCs ' dendrittiske grener er tydelig gjenkjennelig på DIV 10 (E) og div 14 (F) (pilspisser) og forseggjort dendrittiske TRÆR er synlig på div 21 (pil spiss) (G). Skala stolper: A = 100 μm (gjelder paneler B, C, D, E og F); G = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: utvikling av Purkinje celler (PCs) avledet fra musen lillehjernen primordium på E12, E13, E14, og E15 etter 18 dager i primær kultur (div 18). Det axons er det bare Extensions (pilen) fra det PC somata inne primære kulturen av det E12 og E13 cerebella primordium etter 18 dager inne vitro (DIV 18) (en,B). PCs ' dendrit utvekst og forlengelsen utvikle av DIV 18 (pilspissen) bare fra E14 (C) og E15 (D) lillehjernen primære kulturer. Scale bar = 20 μm (gjelder paneler A−D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Immunofluorescence merking av PCer, GABAergic interneurons (kurv og Stel celler), og granule celler fra E18 mus lillehjernen primære kulturen på div 21. (A−C) Dobbel merking med anti-CALB1 (grønn) og anti-PVALB (rød) viser PC-er og noen få interneurons (pil) i kontakt med PC dendrittiske arbors. (D-F) Spennings-gated natrium kanaler (Scner) i PC-organer med utarbeidet dendrites og en rekke små granule celle organer (pilspissen) er merket med anti-SCN (rød) og dobbel-merket med anti-CALB1 (grønn). Forkortelser: Purkinje celler = PCs; CALB1 = calbindin 1; PVALB = parvalbumin; SCN = spennings-gated natrium kanal. Scale bar = 100 μm (gjelder a−F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Grunnleggende medium | Putresin | Natrium selenitt | L-glutamin | Gentamicin | T3 | N3 | Bsa | Ara-C | FBS |
| Kultur medium jeg | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | 0,5 ng/mL | Progesteron 4 μM, insulin 20 μg/mL, transferrin 20 mg/mL | - | - | - |
| Seeding medium | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | - | - | - | - | 10% med kultur medium I |
| Kultur medium II | Kultur medium jeg | 100 μg/mL | 4 μM | - | ||||||
Tabell 1: medie komposisjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av primære kulturer er en velkjent metode som gjelder for alle typer neurons17,18,19. I den presenterte protokollen, forklarer vi hvordan å isolere lillehjernen neurons og opprettholde sin levedyktighet med optimal overlevelse in vitro for maksimalt 3 uker. Primær kultur av lillehjernen celler, som ble isolert ved E15-E18, bekrefter samlingen av tre klasser av store neurons: PCer, Golgi celler, og CNs. Cellen organer og projeksjoner av Golgi celler (noen som oppstår ved E19 − P5) og Soma av granule celler kan oppdages av neurogranin (NRGN) og SMI32 antistoffer, henholdsvis innen 21 dager kultur19,21.
En kritisk faktor for overlevelse og vedlikehold av lillehjernen neurons er den type kultur medium som brukes. FBS supplert medium har vært en standard tilstand for cellelinjer og primær kultur i flere ti år. Men etiske bekymringer, variasjon i serum sammensetning, og dens potensial til å være en kilde til forurensning, har ført til en viss forsiktighet22. Nylig, supplement-beriket DMEM/F-12 medium ble funnet for å redusere gapet mellom fysiologiske forhold og in vitro neuronal modeller. Mediet foreslått av FURUYA et al. forbedret overlevelse av PCer og forbedret deres dendrit differensiering sammenlignet med mye brukt basal medium Eagle (BME)-basert serum-fri medium17,18,23. Dette mediet har blitt grunnlaget for kjemisk definerte medier implementert i lillehjernen celle primær kultur.
Primær celle dyrking av neurons har begrensninger. Som i enhver in vitro kultur, kan cellene overleve i en begrenset periode. Uten unntak kan primære neuronal celler kultivert in vitro bare passert et begrenset antall ganger. Overdreven passaging vil påvirke cellulær helse, funksjon og fenotype, og som sådan gjengi variable eksperimentelle resultater. Derfor neuronal/nonneuronal primære kultur-baserte eksperimenter vanligvis finner sted innen de første 3 ukene av å starte kulturen24. De in vitro forholdene har ennå ikke vært tilstrekkelig optimalisert til å betjene alle celler i nervesystemet samtidig, på en måte som ligner på deres naturlige miljø. For eksempel bruker Ara-C for å hemme spredning av nonneuronal celler er ganske vanlig i studier der oppnå en høyere overlevelse av neuronal celler er en prioritet. Kvaliteten på primær kulturene er således avhengig av metoder som kunstig balanserer in vitro-celle populasjonen i favør av celle typene av rente25,26. Til tross for sine begrensninger, primær cellekultur er en utmerket tilnærming for å studere cellulære mekanismer, signalnettverk trasé, og pheno-og genotypisk endringer under forhold der optimalisert mobilnettet vekst (underlagt de spesifikke forsknings mål) er nøye sammenlignet med in vivo-situasjonen. I tillegg primær lillehjernen kultur som en forenklet modell system gir en kontrollert mikromiljøet å undersøke mengde morfologiske og fysiologiske effekter formidlet av de mange molekylene som påvirker neuronal celler27, 28og andre. Men i hvilken utstrekning de fysiologiske egenskapene til disse cellene er bevart utenfor in vivo-innstillingen, gjenstår å være fullstendig belyst.
Den presenterte metoden er en kostnadseffektiv generell protokoll for dyrking primære celler. Det gir bredere muligheter for å manipulere celler og testing narkotika uten å endre innholdet i cellene, noe som er avgjørende for (pre-) kliniske forsøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Disse studiene ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences og engineering Research Council (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040), og Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035), og ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson translational team Grant (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
