Summary
Att utföra in vitro-experiment för att återspegla in vivo-förhållanden så väl som möjligt är inte en lätt uppgift. Användningen av primära cellkulturer är ett viktigt steg mot att förstå cellbiologi i en hel organism. Den medföljande protokollet beskriver hur man framgångsrikt växa och kultur embryonala mus cerebellär nervceller.
Abstract
Användningen av primära cellkulturer har blivit ett av de viktigaste verktygen för att studera nervsystemet in vitro. Det slutgiltiga målet med att använda detta förenklade modellsystem är att ge en kontrollerad mikromiljö och bibehålla den höga överlevnaden och de naturliga dragen hos dissocierade neuronala och nonneuronala celler så mycket som möjligt under in vitro-betingelser. I denna artikel, vi visar en metod för att isolera primära nervceller från att utveckla mus cerebellum, placera dem i en in vitro-miljö, etablera sin tillväxt, och övervaka deras lönsamhet och differentiering i flera veckor. Denna metod är tillämplig på embryonala neuroner separerade från lillhjärnan mellan embryonala dagar 12 – 18.
Introduction
I flera decennier har cellinjer använts flitigt som ett högt genomflöde verktyg i prekliniska studier och biologisk forskning. Kostnadseffektivitet, snabb tillväxt och minskad användning av levande djur är några fördelar med att använda dessa celler. Emellertid, genetiska förändringar och fenotypiska förändringar ackumuleras efter flera passager in vitro-1. Felidentifiering av cellinjer och genetisk dissimilaritet från primära celler kan leda till irreproducerbara experiment och falska slutsatser2,3,4,5. Därför, trots vissa likheter med differentierade celler såsom nervceller (t. ex., signalsubstanser, jonkanaler, receptorer, och andra neuron-specifika proteiner), neuronala cellinjer kan inte replikera hela fenotyp av nervceller. Använda mogna nervceller är ett annat alternativ; dessa celler är dock icke-skiljande postmitotiska celler som är svåra att sprida i kulturen. Dessutom kan återinträde i cellcykeln utlösa apoptos6.
Tredimensionell (3D) cellkultur, organotypic slice kulturer, och Organoid kulturer har utvecklats för att ge en miljö där celler kan ordna i en 3D-form som härmar in vivo inställning. Således, cell-till-cellkommunikation, migration, invasion av tumörceller i omgivande vävnader, och angiogenes kan studeras7. Men ytterligare kostnader för att använda extra cellulära Matrix (ECM) proteiner eller syntetiska hydrogeler som ett strö, svårigheter att avbilda, och kompatibilitet med hög kapacitet screening instrument är betydande nackdelar med 3D-cellodling. En stor nackdel med organotypic vävnad slice kultur är användningen av ett stort antal djur och de negativa effekterna av axotomi, vilket leder till otillgänglighet av mål och tillväxtfaktorer för axoner, och därmed neuronala död8.
Därför är en alternativ metod, som undviker problem med cellinjer, svårigheten att växa mogna celler, och komplexiteten i vävnader, in vitro-mognad av omogna primära celler. Primär cellerna härstammar direkt från vävnad från människa eller djur och separeras med hjälp av enzymatiska och/eller mekaniska metoder9. De viktigaste principerna för isolering, sådd och underhåll i odlingssubstrat är likartade oavsett vävnads källa. Emellertid, de trofiska faktorer som krävs för att främja spridning och mognad är mycket cellspecifika6.
Att känna till "födelsedatum" för varje cerebellär celltyp är en förutsättning för att utforma en primär kultur experiment. I allmänhet, Purkinje celler (PCs) och nervceller i lillhjärnan kärnor (CN), är födda före de mindre cellerna, inklusive interneuroner (t. ex., korg, stellate celler) och granule celler. Hos möss uppstår datorer mellan embryonala dagen (E) 10 – E13, medan KN-neuroner vid cirka E9 – E1210.
Andra cerebellär nervceller föds mycket senare. Till exempel, hos möss, den Golgi subpopulation av interneuroner genereras från VZ på (~ E14 − E18) och de återstående interneuroner (korg cell och stellate celler) som ligger i det molekylära skiktet dyka upp från att dividera stamceller i den vita substansen mellan tidig postnatal (P) 0 – P711. Granule celler genereras från den yttre avelsmaterial Zone (egz), en sekundär avelsmaterial zon som härrör från rostralt rhombic läpp och går igenom terminalen Division efter födseln. Men innan deras prekursorer uppstår från rhombic läpp från E13-E16, cellerna har redan migrerat rostrally längs Pia ytan för att göra ett tunt lager av celler på rygg ytan av lillhjärnan Anlage. Nonneuronala makrogliala celler som astrocyter och oligodendrocyter, som härstammar från det ventrikulära neuroepitelet, är födda vid e 13,5 − P0 och P0 − P7 respektive11,12,13,14 ,15. Microglia härstammar från gula-SAC primitiva myeloida stamceller mellan E8-E10 och efter invasionen i centralanervsystemet kan upptäckas i mushjärna av E916.
Den metod som presenteras i denna artikel är baserad på den som ursprungligen utvecklades av Furuya et al. och Tabata et al.17,18, som var optimerad för primär odling av Purkinje celler som härrör från Wistar råtta cerebella. Vi har nu anpassat denna metod och noggrant modifierade den för att studera tillväxten av mus cerebellär neuroner19. Till skillnad från i vårt nya protokoll, är kallt dissektion medium den huvudsakliga tvättbuffert som används under dissektion och dissociation steg innan du lägger sådd medium i Furuya protokoll17. Denna buffert saknar näring, tillväxtfaktorer, och hormoner (alla i Dulbecco modifierade Eagle medium: näringsämne blandning F-12 [DMEM/F12]) som är nödvändiga för att stödja celltillväxt och överlevnad under de ovan nämnda stegen. Dessutom, baserat på vår långa erfarenhet med murina primära cerebellär kulturer, vi har använt 500 μl av odlingssubstrat i varje brunn (i stället för 1 ml) och ökade tri-iodothyronine koncentrationen till 0,5 ng/ml, vilket förbättrar tillväxten av neuronala celler, i särskilt de med en Purkinje cell fenotyp, och främjar utväxt av dendritiska grenar i kulturen. Den huvudsakliga metoden i denna artikel kan i stor utsträckning tillämpas på andra små gnagare (t. ex. ekorrar och hamstrar) under embryonal utveckling och kan användas för att studera cerebellär neurogenes och differentiering i de olika embryonala stadierna, som olika arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med institutionella föreskrifter och handledning för vård och användning av försöksdjur från det kanadensiska rådet för djuromsorg och har godkänts av lokala myndigheter ("den Bannatyne Campus djuromsorg Kommittén "). Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur som använts och deras lidande. Tillräckligt djup av anestesi bekräftades genom att Observera att det inte fanns någon förändring i andningsfrekvens i samband med manipulation och tå nypa eller hornhinnan reflex.
1. förberedelser
Notera: Schemalägg tillhandahållandet av tidsinställda dräktiga möss, baserade på forskningsplanen, för E12 – E18 efter befruktningen. Valet av timing beror på önskad cellegenskaper (se nedan). Förbered locket glider och plåtar minst 2 dagar före experimentet. Poly-L-Ornithine används som en beläggning material för att förbättra cell fastsättning till locket glider.
- Täck locket glider 2 dagar före cell isoleringen.
- Placera den runda locket glider i en 24 väl tallrik, under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp. Lämna ett mellanrum mellan varje täckslip för att undvika kontaminering.
- Tillsätt 90 μL Poly-L-Ornithine (PLO, 500 μg/mL) till mitten av varje täckslip. Stäng locket och placera försiktigt plattan i en 37 ° c/5% CO2 inkubator i 2 dagar.
Obs: en större volym kan spilla bort täckhalvor under inkubering. Täckslip behöver inte vara helt täckt med PLO efter att ha placerat en droppe. Under natten inkubering, distribuerar PLO lika till kanten av locket glider.
- En dag före cell isoleringen, Förbered odlingsmediet i (DMEM/F-12 innehållande monomer 100 μm, natriumselenit 30 Nm, L-glutamin 3,9 mm, gentamicin 3,5 μg/ml, Tri-jodtyonin (T3) 0,5 ng/ml, och N3-tillskott [progesteron 4 μm, insulin 20 μg/ml, transferrin 20 mg/mL]) och sådd medium (odlingssubstrat I [utan N3 och T3] innehållande 10% fetalt bovint serum [FBS]) och förvara dem i 4 ° c. Förbered trypsin arbetslösning (0,25%) i DMEM/F12 och behåll den vid 4 ° c.
Anmärkning: medel kompositionerna anges i tabell 1. - På dagen för cell isolering, placera odlingsmedium i och seedning medium i inkubatorn vid 37 ° c.
Obs: innan lillhjärnan isolering, se till att alla verktyg och arbetsytor är sterila. - Tvätta locket glider.
- Ta den 24 brunnen plattan ut ur inkubatorn.
- Tvätta locket glider i 24 väl plattan 3x med dubbeldestillerat vatten (DDW) i ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden. Varje gång låt locket glider blöt i DDW för 5 min innan du påbörjar aspiration.
- Lämna locket glider i ett biosäkerhetsskåp i minst 2 h för att helt torka.
2. cerebellum samling
- Förbered 3 10 cm steril plast petriskålar fyllda med iskalla 1x fosfat-buffrad saltlösning (PBS), 3 petriskålar fyllda med iskalla 1x Hank ' s balanserade salt Solution (HBSS), och cirka 5 petriskålar fyllda med iskallt dissektion medium (1x HBSS innehållande gentamicin 10 μg/mL). Håll dem på is.
- Anesthetize E18 CD1 gravid mus med 40% isofluran. Utför cervikal dislokation på musen. Sterilisera buken med 70% etanollösning.
- Använd en sax för att göra en hud snitt från blygdbensymphysis till xiphoid processen. Håll sedan huden med pinps och öppna bukhålan.
- Punktskatter på livmodern horn med pinps och tvätta dem 3x i iskalla 1x PBS på is.
Anmärkning: följande steg bör alla utföras på is för att minimera ämnesomsättningen och förhindra vävnads-och cellskador.
3. dissekera lillhjärnan
- Efter den sista tvättsteg, med hjälp av ett par fina tång separera embryon från livmodern i 1x HBSS och överföra dem till iskallt dissektion medium. I dissekera medium, halshugga embryona med sax. Placera vävnaden i en ren dissekera medium.
Anmärkning: det är valfritt att använda ett stereomikroskop för microdissection. - Håll skallen med fina pincett och skär genom calvarium med ett par små saxar från den laterala aspekten av skallen i en linje från foramen magnum till den yttre akustiska meatus och sämre gränsen för orbital hålighet.
Anmärkning: med detta steg exponerar kraniala hålighet i nivå med skallbasen och gör det lättare att ta bort hjärnan. - Med hjälp av ett par fina tång, ta bort skallbasen och skala skallen bort från hjärnan.
- Ta försiktigt bort hjärnhinnorna på lillhjärnan, med början från den laterala ytan av mitten lillhjärnan stjälk och Pons.
- Skär både cerebellär stjälkar och separera lillhjärnan från resten av hjärna (figur 1).
- Placera omedelbart den insamlade cerebella i ett sterilt 15 mL koniskt rör fyllt med 14 mL DMEM/F12 på is.
- Centrifugera röret vid 1 000 x g, 4 ° c i 1 min, 3x. Varje gång försiktigt bort supernatanten med en pipett och Omsuspendera pelleten i färskt, iskallt DMEM/F12.
Obs: för att undvika att förlora proverna, Använd skåpet sug så lite som möjligt.
4. cerebellum dissociation
- Tillsätt 2 ml föruppvärmd (37 ° c) trypsin till pelleten från steg 3,7 och försiktigt Pipettera för adekvat blandning.
- Placera röret i en 37 ° c vattenbad i 12 min.
- Efter inkubering, ta röret till ett biosäkerhetsskåp och tillsätt 10 mL DMEM/F12 för att inaktivera trypsin.
- Centrifugera blandningen vid 1 200 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i färskt DMEM/F12. Upprepa 3x.
- Prewet en steril plast överföring Pipettera med DMEM/F12.
- Efter tvättning och den slutliga centrifugering, tillsätt 3,5 mL DNase arbetslösning (1 mL DNase I lagerlösning [0,05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1x Hbss] i 500 μl av VÄRMEINAKTIVERADE FBS och 2 ml DMEM/F12) till pelleten i samma rör.
- Triturate vävnaden med en Pipettera minst 30x tills blandningen uppnår en homogen mjölkaktig färg.
5. cell insamling
- Tillsätt 10 mL iskall DMEM/F12 till blandningen.
- Centrifugera provet vid 1 200 x g, 4 ° c i 5 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten.
- Ta bort sådd mediet från inkubatorn.
- Tillsätt 500 μL förvärmda sådd medium till pelleten och blanda det mycket väl med hjälp av en Pipettera att Omsuspendera cellerna.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Späd cellsuspensionen med sådd mediet till en densitet av 5 x 105 celler/ml.
- Under ett biosäkerhetsskåp, tillsätt 90 μL av den utspädda blandningen till varje brunn i mitten av täckglasappliceringen.
Obs: Fyll inte på partiklar som inte suspenderas i DNase. - Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° c i 3 − 4 h.
- Efter inkubering, tillsätt 500 μL förvärmda odlingssubstrat I till varje brunn och placera plattan tillbaka i inkubatorn (37 ° c).
6. behandling av de återvunna cellerna
- Efter 7 dagar, ersätta det gamla mediet med färsk kultur medium II (odlingssubstrat jag kompletteras med cytosin arabinoside [Ara-C, 4 μM] och 100 μg/mL bovint serum albumin [BSA]; Se tabell 1).
Anmärkning: detta steg är avgörande för att undvika tillväxt av nonneuronala celler. - Övervaka odlingsmediet en gång om dagen. Om pH ändras (indikeras av en markant förändring i färg, vanligtvis yellower), ta bort hälften (nästan 250 μL) av det gamla mediet från alla brunnar och tillsätt 300 μL av förvärmd odlingssubstrat I till var och en av dem för att undvika närings förlust.
Obs: fenol röd i odlingssubstrat är en bra indikator på pH i mediet och aktiviteten av cellerna. Försök att minimera exponeringstiden för cellerna till ur inkubator villkor. Detta förhindrar stress som kan påverka deras lönsamhet.
7. insamling och fixering av celler
Obs: beroende på experimentell design, kan cellerna samlas in varje dag, vid varje tidpunkt.
- Förbered en separat 24 väl tallrik med motsvarande numerisk organisation och tillsätt 100 μL av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) till varje brunn.
- För att skörda celler på de önskade dagarna (beroende på experiment protokollet), försiktigt bort locket glider från brunnarna i den ursprungliga kulturen plattan och placera dem i motsvarande brunnar i PFA-fyllda plattan.
- Lägg till PFA i brunnarna för att helt doppa locket glider.
Obs: för att undvika cell avlossning från följesedeln, Lägg inte till PFA direkt på följesedeln. - Förvara PFA-plattan vid 4 ° c i 30 − 120 min.
- Efter inkubering, återställa plattan till rumstemperatur.
- Tvätta försiktigt locket glider 3x i 5 min med 1x PBS.
- Gå vidare till immunfärgnings processen.
Notera: i denna studie användes ett fluorescensmikroskop utrustat med en kamera för att fånga bilderna och monteras i montage med hjälp av en bildredigeringsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baserat på de olika födelsedatum för neuronala subtyper i lillhjärnan, kulturer från E12 − E18 mus embryon gav olika celltyper. Stora projektion nervceller, såsom CN neuroner (E9 − E12) och PCs (E10 − E13), dök upp tidigt under cerebellär utveckling. Hos möss uppstod granule-och Golgiceller mellan ~ E13 – E18 och genomgick terminala divisioner upp till postnatal vecka 4.
Byta gamla medium i med färsk kultur medium II på dagar in vitro (DIV) 7 kommer så småningom att förhindra gliaceller cellproliferation. Den interneuronen av det molekylära lagrar, liksom korg och stellate celler, gör åtskillnad mellan efter födelse. Därför förväntas de flesta av cellerna i odlingsmediet vid E18 vara en kombination av PC, granule celler, CN, och några Golgi celler. Calbindin 1 (CALB1), en specifik markör för PCs, användes för att spåra de morfologiska förändringarna under 21-dagars tidsförlopp. På DIV 0, cell kropparna av datorer var detekterbara (t. ex., 10 − 11 h av inkubation), men utväxten av neurit hade ännu inte börjat (figur 2A). Genom DIV 3, axonal förlängningen visade framsteg, medan dendritiska processer hade precis börjat. Denna status förblev nästan oförändrad fram till den andra veckan in vitro (WIV) (figur 2b–D). På div 10, några glesa grenar och primära dendriter med Taggar började växa (figur 2e). Sprouting av de nya primära dendriterna inträffade kontinuerligt efter DIV 14. Därför, efter DIV 14, antalet sekundära och tertiär dendriter ökat och utvecklat breda grenar på DIV 21 (figur 2F,G).
Det är viktigt att veta att tidpunkten för de morfologiska förändringarna in vitro inte kan följa samma mönster som in vivo. Efter dessa resultat, i ett annat experiment den dissocierade cerebellär primordia från E12, E13, E14, och E15 var odlade i 3 veckor. De odlade datorerna från E12 och E13 utvecklade inte någon dendritisk utväxt på DIV 18 utom axonala förlängningar (figur 3a,B). Men efter samma tidsperiod, separerade cerebellär primordium kulturer från E14 och E15 visade dendritiska utväxt och arborization (figur 3c,D). Denna tillväxtrytm variation bland neurala celler in vitro kastar ljus på en stor förändring som hände i deras naturliga miljö mellan tidigt och sent skede av cerebellär utveckling, som måste tillämpas in vitro för medelstora optimering.
Tillsammans med datorer, det finns andra neuronala celltyper i lillhjärnan som utvecklas under dissocierade primära cerebellär kulturer som kan upptäckas med hjälp av specifika neuronala markörer. Dubbel immunofluorescensmärkning för CALB1 och ett kalciumbindande albuminprotein, parvalbumin (PVALB), visade att CALB1 uttryck uteslutande begränsades till datorer i primära Cerebellära kulturer, medan PVALB uttrycktes i CALB1+ neuroner ( dvs., PCs) och PVALB+/Calb1– neuroner, som är molekylära skikt interneuroner (korg/stellate celler) (figur 4a–C). Alfa-subenheten (nav1,6) i den spännings-gated natrium kanalen (SCN) är en markör för granule celler och datorer i lillhjärnan20. Dubbel märkning med anti-SCN och anti-CALB1 visar samlokalisering av granule cells kroppar och datorer i odlingsmedium på DIV 21 (figur 4D–F). För andra specifika cerebellär celltyper från dissocierade primära cerebellär kulturer, vänligen se Marzban och Hawkes19.
Figur 1: rygg aspekt av mushjärna som beskriver lillhjärnan vid E18. Hjärnhinnorna indikeras med gula fyrkanter. Placeringen av lillhjärnan beskrivs av den gula linjen, som är begränsad rostrally av mellanhjärnan och caudally av medulla förlängda (beskrivs av bruna streckade linjer). Lillhjärnan vermis och halvklotet visas med bruna streckade linjer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utveckling av Purkinje celler (PCS) som härstammar från mus lillhjärnan vid E18 i primärkulturen för dagar in vitro (div) 0 – 21. (A) PC Somata (pilspetsar) var märkta med immunofluorescens med anti-calbindin 1 (CALB1) vid div 0 (efter 10 h). (B) den första axonala förlängningen (pil) och tidig dendritisk utväxt (Arrowhead) visas på div 3. PCs ' dendritiska utväxt och utveckling (Arrowhead) fortsätta på div 5 (C) och div 7 (D). PCs "dendritiska grenar är tydligt distinguishable på DIV 10 (E) och div 14 (F) (pilspetsar) och utarbeta dendritiska träd är detekterbara på div 21 (pilspets) (G). Skalstreck: A = 100 μm (gäller för panelerna B, C, D, E och F); G = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utveckling av Purkinje celler (PCS) som härstammar från mus cerebellär primordium på E12, E13, E14 och E15 efter 18 dagar i primärkulturen (div 18). Axonerna är de enda utökningar (pil) från PC Somata i primärkulturen i E12 och E13 cerebella primordium efter 18 dagar in vitro (DIV 18) (A,B). PCs Dendrit utväxt och förlängning utvecklas av div 18 (pilspets) endast från E14 (C) och E15 (D) cerebellär primär kulturer. Skalstapel = 20 μm (gäller för panelerna A−D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunofluorescensmärkning av datorer, GABAergic interneuroner (korg och stellate celler), och granule celler från E18 mus cerebellär primär kultur på div 21. (a−C) Dubbel märkning med anti-CALB1 (grön) och anti-pvalb (röd) visar datorer och några interneuroner (Arrow) i kontakt med PC dendritiska arbors. (D−F) Spännings-gated natriumkanaler (SCNs) i PC organ med utarbetade dendriter och många små granule cell organ (Arrowhead) är märkta med anti-SCN (röd) och dubbel-märkt med anti-CALB1 (grön). Förkortningar: Purkinje celler = PCs; CALB1 = calbindin 1; PVALB = parvalbumin; SCN = spännings-gated natrium kanal. Skalstapel = 100 μm (gäller A−F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Grundläggande medium | Monomer | Natriumselenit | L-glutamin | Gentamicin | T3 | N3 | Bsa | Ara-C | Fbs |
| Kultur medium I | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | 0,5 ng/mL | Progesteron 4 μM, insulin 20 μg/mL, transferrin 20 mg/mL | - | - | - |
| Sådd medium | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | - | - | - | - | 10% med odlingsmedium I |
| Kultur medium II | Kultur medium I | 100 μg/mL | 4 μM | - | ||||||
Tabell 1: medie kompositioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av primär kulturer är en välkänd metod som gäller för alla typer av nervceller17,18,19. I det presenterade protokollet, förklarar vi hur man isolerar cerebellär neuroner och bibehålla sin livskraft med optimal överlevnad in vitro i högst 3 veckor. Primärkulturen i cerebellär celler, som isolerades på E15 − E18, bekräftar insamlingen av tre klasser av stora nervceller: PCs, Golgi celler, och CNs. Cellen organ och projektioner av Golgi celler (varav några framträder vid E19 − P5) och Soma av granule celler kan upptäckas av neurogranin (nrgn) och SMI32 antikroppar, respektive, inom 21 dagar av kultur19,21.
En kritisk faktor för överlevnad och underhåll av cerebellär neuroner är den typ av kultur medium som används. FBS kompletterade medium har varit ett standardvillkor för cellinjer och primär kultur i årtionden. Men etiska farhågor, variationer i serum sammansättningen, och dess potential att vara en källa till kontaminering, har lett till viss försiktighet22. Nyligen, tillägg-anrikat DMEM/F-12 medium konstaterades för att minska klyftan mellan fysiologiska tillstånd och in vitro-neuronala modeller. Mediet föreslås av Furuya et al. förbättrad överlevnad av datorer och förbättrat sin Dendrit differentiering jämfört med den utbredda basal medium Eagle (BME)-baserade serumfritt medium17,18,23. Detta medium har blivit grunden för kemiskt definierade medier implementeras i lillhjärnan cell primär kultur.
Primär cellodling av nervceller har begränsningar. Som i alla in vitro-kultur, celler kan överleva under en begränsad tid. Utan undantag, primära neuronala celler odlade in vitro kan endast blint ett begränsat antal gånger. Överdriven passaging kommer att påverka cellulär hälsa, funktion, och fenotyp, och som sådan göra variabla experimentella resultat. Därför, neuronala/nonneuronala primära kulturbaserade experiment sker vanligtvis inom de första 3 veckorna för att starta kulturen24. In vitro-villkoren har ännu inte tillräckligt optimerats för att betjäna alla celler i nervsystemet samtidigt, på ett sätt som liknar deras naturliga miljö. Till exempel, med hjälp av Ara-C för att hämma spridningen av nonneuronala celler är ganska vanligt i studier där uppnå en högre överlevnadsgrad av neuronala celler är en prioritet. Således förlitar sig kvaliteten på primär kulturer på metoder som på ett konstlat sätt balanserar in vitro-cellpopulationen till förmån för de celltyper som intresserar25,26. Trots sina begränsningar, primär cellkultur är ett utmärkt sätt att studera cellulära mekanismer, signalering vägar, och pheno-och genotypisk förändringar under förhållanden där optimerad cellulära tillväxt (med förbehåll för de särskilda Forskningsmålen) är noggrant karaktäriseras och jämförs med in vivo-situationen. Dessutom, primär cerebellär kultur som ett förenklat modellsystem ger en kontrollerad mikromiljö för att undersöka den uppsjö av morfologiska och fysiologiska effekter medieras av de många molekyler som påverkar neuronala celler27, 28. Men i vilken utsträckning de fysiologiska egenskaperna hos dessa celler bevaras utanför in vivo-inställningen återstår att vara helt klarlagd.
Den presenterade metoden är ett kostnadseffektivt allmänt protokoll för odling av primära celler. Det ger bredare alternativ för att manipulera celler och testa droger utan att ändra arten av cellerna, vilket är avgörande för (pre-) kliniska prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Dessa studier stöddes av bidrag från naturvetenskap och teknik forskningrådet (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040), och Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035), och ALS Canada-hjärna Kanada Arthur J. Hudson Translational team Grant (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
