Summary
Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.
Abstract
Het gebruik van primaire celculturen is uitgegroeid tot een van de belangrijkste instrumenten om het zenuwstelsel in vitro te bestuderen. Het uiteindelijke doel van het gebruik van dit vereenvoudigde modelsysteem is om een gecontroleerde micro-omgeving te bieden en de hoge overlevingskansen en de natuurlijke kenmerken van gedissocieerde neuronale en niet-neuronale cellen zoveel mogelijk onder in vitro-omstandigheden te handhaven. In dit artikel, we demonstreren een methode van het isoleren van primaire neuronen van de ontwikkelende muis cerebellum, plaatsen van hen in een in vitro omgeving, het vaststellen van hun groei, en het monitoren van hun levensvatbaarheid en differentiatie voor enkele weken. Deze methode is van toepassing op embryonale neuronen die worden losgekoppeld van het cerebellum tussen de embryonale dagen 12 – 18.
Introduction
Voor enkele decennia, cellijnen zijn op grote schaal gebruikt als een high throughput tool in preklinische studies en biologisch onderzoek. Kosteneffectiviteit, snelle groei en vermindering van het gebruik van levende dieren zijn enkele voordelen van het gebruik van deze cellen. Echter, genetische veranderingen en fenotypische veranderingen accumuleren na verschillende passages in vitro1. De identificatie van cellijnen en genetische disgelijkenis van primaire cellen kan leiden tot irreproduceer bare experimenten en valse conclusies2,3,4,5. Daarom, ondanks sommige gelijkenissen met gedifferentieerde cellen zoals neuronen (bijvoorbeeld neurotransmitters, ionenkanalen, receptoren, en andere neuron-specifieke eiwitten), neuronale cellijnen kunnen niet repliceren de volledige fenotype van neuronen. Het gebruik van volwassen neuronen is een andere optie; deze cellen zijn echter niet-delende postmitotische cellen die moeilijk te propageren zijn in cultuur. Bovendien kan opnieuw binnenbrengen in de celcyclus apoptosis6neerslaan.
Driedimensionale (3D) celcultuur, organotypische segment culturen en organoïde culturen zijn ontwikkeld om een omgeving te bieden waarin cellen zich kunnen schikken in een 3D-vorm die de in vivo-instelling nabootst. Zo, cel-naar-cel communicatie, migratie, invasie van tumorcellen in de omringende weefsels, en angiogenese kan worden bestudeerd7. Extra kosten voor het gebruik van extra cellulaire matrix (ECM) eiwitten of synthetische hydrogels als strooisel, moeite met beeldvorming en compatibiliteit met screening-instrumenten met een hoge doorvoer zijn echter aanzienlijke nadelen van 3D celculturing. Een groot nadeel van organotypic weefsel segment cultuur is het gebruik van een grote hoeveelheid dieren en de nadelige effecten van axotomie, wat leidt tot ontoegankelijkheid van de doelstellingen en groeifactoren voor axonen, en bijgevolg neuronale dood8.
Daarom, een alternatieve aanpak, die vermijdt de problemen met cellijnen, de moeilijkheid van het kweken van volwassen cellen, en de complexiteit van de weefsels, is in vitro rijping van onvolgroeide primaire cellen. Primaire cellen worden rechtstreeks afgeleid van menselijk of dierlijk weefsel en gezien met enzymatische en/of mechanische methoden9. De belangrijkste principes van isolatie, seeding en onderhoud in kweekmedium zijn vergelijkbaar, ongeacht de weefsel bron. Echter, de trofische factoren die nodig zijn om proliferatie en rijping te bevorderen zijn zeer cel-specifieke6.
Het kennen van de ' geboortedatum ' van elk celtype cerebellaire is een vereiste voor het ontwerpen van een primaire cultuur-experiment. In het algemeen, Purkinje cellen (PCs) en de neuronen van de cerebellaire kernen (CN), worden geboren voor de kleinere cellen, met inbegrip van de interneuronen (bv., mand, stervormige cellen) en submodule cellen. Bij muizen ontstaan Pc's tussen de embryonale dag (E) 10 – E13, terwijl de CN-neuronen ongeveer E9 – E1210.
Andere cerebellaire neuronen worden veel later geboren. Bijvoorbeeld, bij muizen wordt de Golgi-subpopulatie van interneuronen gegenereerd van VZ op (~ E14 − E18) en de overgebleven interneuronen (mand cellen en ecoagriturismo late Cells) in de moleculaire laag ontstaan uit het verdelen van voorlopercellen in de witte stof tussen vroege postnatale (P) 0 – P711. Submodules worden gegenereerd uit de uitwendige Germinal zone (EGZ), een secundaire kiem zone die is afgeleid van de rostrale migratoire Rhombic lip en na de geboorte door Terminal Division gaat. Maar voordat hun precursoren uit de Rhombic lip van E13 – e16 voortvloeien, zijn de cellen al rostraal over het PIA-oppervlak gemigreerd om een dun laagje cellen op het rugoppervlak van het cerebellum Anlage te maken. Niet-neuronale macrogliale cellen zoals astrocyten en oligodendrocyten, die afkomstig zijn van het ventriculaire neuroepitheel, worden geboren bij e 13.5 − P0 en P0 − P7 respectievelijk11,12,13,14 ,15. Microglia zijn afgeleid van dooier-SAC primitieve myeloïde voorlopercellen tussen E8 – E10 en na invasie in het centrale zenuwstelsel kan worden gedetecteerd in de hersenen van de muis door E916.
De methode die in dit artikel wordt weergegeven is gebaseerd op degene die oorspronkelijk werd ontwikkeld door Furuya et al. en Tabata et al.17,18, die was geoptimaliseerd voor primaire kweek van Purkinje cellen afgeleid van Wistar rat cerebella. We hebben deze methode nu aangepast en zorgvuldig aangepast om de groei van muis cerebellaire neuronen19te bestuderen. In tegenstelling tot ons nieuwe protocol, koude dissectie medium is de belangrijkste wasbuffer gebruikt tijdens dissectie en dissociatie stappen voor het toevoegen van zaaien medium in Furuya protocol17. Deze buffer mist de voeding, groeifactoren, en hormonen (alles in Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium: nutriënten mengsel F-12 [DMEM/F12]) die nodig zijn ter ondersteuning van de celgroei en overleving tijdens de bovengenoemde stappen. Bovendien hebben we, op basis van onze uitgebreide ervaring met de primaire cerebellaire culturen van Murine, 500 μL van het kweekmedium in elke put gebruikt (in plaats van 1 mL) en de Tri-iodothyronine-concentratie verhoogd tot 0,5 ng/mL, wat de groei van neuronale cellen verbetert, in met name die met een Purkinje-cel fenotype, en bevordert de uitgroei van dendritische takken in de cultuur. De belangrijkste methode in dit artikel kan in grote lijnen worden toegepast op andere kleine knaagdieren (bijv. eekhoorns en hamsters) tijdens de embryonale ontwikkeling en kan worden gebruikt voor de studie van cerebellaire neurogenese en differentiatie in de verschillende embryonale stadia, die verschillen tussen soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele voorschriften en de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Canadese Raad voor Dierverzorging en is goedgekeurd door lokale autoriteiten ("de Bannatyne campus Animal Care Comité "). Alle inspanningen werden gedaan om het aantal en het lijden van de gebruikte dieren te minimaliseren. Adequate diepte van anesthesie werd bevestigd door te observeren dat er geen verandering in de ademhalingsfrequentie geassocieerd met manipulatie en teen pinch of corneale reflex.
1. voorbereiding
Opmerking: plan de levering van getimede zwangere muizen, gebaseerd op het onderzoeksplan, voor post-conceptie E12-E18. De keuze van de timing is afhankelijk van de gewenste celkarakteristieken (zie hieronder). Bereid de afdek stroken en platen ten minste 2 dagen voor het experiment. Poly-L-Ornithine wordt gebruikt als coatingmateriaal om de celhechting op de afdek stroken te verbeteren.
- Mantel de afdek stroken 2 dagen voor de celisolatie.
- Plaats de ronde afdekking in een 24-pits bord, onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast. Laat een gat tussen elke Afdekstrook om verontreiniging te voorkomen.
- Voeg 90 μL poly-L-Ornithine (PLO, 500 μg/mL) toe aan het midden van elke Afdekstrook. Sluit de dop en plaats de plaat voorzichtig gedurende 2 dagen in een incubator van 37 °C/5% CO2 .
Opmerking: tijdens de incubatie kan een groter volume van de afdek stroken worden gemorst. De Afdekstrook hoeft niet volledig bedekt te zijn met PLO na het plaatsen van een druppel. Tijdens de nachtelijke incubatie verdeelt de PLO gelijk naar de rand van de dekstroken.
- Een dag voor de celisolatie, bereid het kweekmedium I (DMEM/F-12 met putrestsin 100 μM, Natriumseleniet 30 nm, L-glutamine 3,9 mm, gentamicine 3,5 μg/ml, Tri-iodothyronine (T3) 0,5 ng/ml, en N3 supplementen [progesteron 4 μM, insuline 20 μg/ml, transferrine 20 mg/mL]) en zaai medium (kweekmedium I [zonder N3 en T3] dat 10% foetaal runderserum [FBS] bevat) en bewaar ze in 4 °C. Bereid de trypsine-werkoplossing (0,25%) in DMEM/F12 en houd het op 4 °C.
Opmerking: de middelgrote composities zijn beschikbaar in tabel 1. - Plaats op de dag van de celisolatie kweekmedium I en zaai medium in de incubator bij 37 °C.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle gereedschappen en werkoppervlakken steriel zijn voordat u de cerebellum-isolatie start. - Wash cover slips.
- Neem de 24 goed plaat uit de incubator.
- Was de afdekkap in de 24 goed plaat 3x met dubbel gedistilleerd water (DDW) in een bioveiligheidskast onder steriele omstandigheden. Elke keer laat de afdekking gedurende 5 minuten weken in DDW voor aanvang van de aspiratie.
- Laat de afdekking in een bioveiligheidskast liggen voor ten minste 2 uur om volledig te drogen.
2. cerebellum collectie
- Bereid 3 10 cm steriele plastic Petri schaaltjes gevuld met ijskoude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 3 petrischaaltjes gevuld met ijskoude 1x Hank van gebalanceerde zout (HBSS), en ongeveer 5 petrischaaltjes gevuld met ijskoude dissectie medium (1x HBSS bevattende gentamicine 10 μg/mL). Houd ze op ijs.
- Anesthetiseer de E18 CD1 zwangere muis met 40% isoflurane. Uitvoeren van cervicale dislocatie op de muis. Steriliseren de buik met 70% ethanol oplossing.
- Gebruik een schaar om een huid incisie te maken van de schaam-symphyse tot het xifoïde-proces. Houd vervolgens de huid vast met een tang en open de buikholte.
- Accijnzen de baarmoeder hoorns met een tang en was ze 3x in het ijskoude 1x PBS op ijs.
Opmerking: de volgende stappen moeten allemaal op ijs worden uitgevoerd om de stofwisseling te minimaliseren en beschadiging van de weefsels en cellen te voorkomen.
3. ontleden van het cerebellum
- Na de laatste wasstap, met behulp van een paar fijne Tang scheiden de embryo's van de baarmoeder in 1x HBSS en breng ze over naar de ijskoude dissectie medium. In het dissectie medium onthooi de embryo's met een schaar. Plaats het weefsel in een schoon dissectie medium.
Opmerking: het gebruik van een stereomicroscoop voor micro dissectie is optioneel. - Houd de schedel met fijne Tang en snijd door de calvarium met een paar kleine schaar van het laterale aspect van de schedel in een lijn van het foramen magnum naar de externe akoestische gang en inferieure grens van de orbitale holte.
Opmerking: het nemen van deze stap blootstelt de schedelholte op het niveau van de Skull base en maakt het gemakkelijker om de hersenen te verwijderen. - Met behulp van een paar fijne Tang, verwijder de schedelbasis en schil de schedel weg van de hersenen.
- Verwijder voorzichtig de hersenvliezen op het cerebellum, beginnend vanaf het laterale oppervlak van de middelste cerebellaire bloem en Pons.
- Snijd beide cerebellaire Steel en scheid de hersenen van de rest van het brein (Figuur 1).
- Plaats de verzamelde cerebella onmiddellijk in een steriele 15 mL conische buis gevuld met 14 mL DMEM/F12 op ijs.
- Centrifugeer de buis bij 1.000 x g, 4 °c gedurende 1 minuut, 3x. Verwijder elke keer voorzichtig de supernatant met een pipet en reresumeer de pellet in verse, ijskoude DMEM/F12.
Opmerking: om te voorkomen dat de monsters verliezen, gebruik de kast zuigkracht zo min mogelijk.
4. dissociatie van cerebellum
- Voeg 2 mL voorverwarmde (37 °C) trypsine toe aan de pellet uit stap 3,7 en pipet voorzichtig voor een adequate menging.
- Plaats de buis gedurende 12 minuten in een waterbad van 37 °C.
- Breng na incubatie de buis in een bioveiligheidskast en voeg 10 mL DMEM/F12 toe om de trypsine te deactiveren.
- Centrifugeer het mengsel bij 1.200 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en revoer de pellet in verse DMEM/F12. Herhaal 3x.
- Prewet een steriel plastic Transfer pipet met DMEM/F12.
- Voeg na het wassen en de uiteindelijke centrifugeren 3,5 mL DNase werkoplossing (1 mL DNase I Stock Solution [0,05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS] in 500 μL warmte-GEÏNACTIVEERDE FBS en 2 ml DMEM/F12) toe aan de pellet in dezelfde buis.
- Triturate het weefsel met een pipet ten minste 30x totdat het mengsel een homogene melkachtige kleur bereikt.
5. celverzameling
- Voeg 10 mL ijskoude DMEM/F12 toe aan het mengsel.
- Centrifugeer het monster bij 1.200 x g, 4 °c gedurende 5 min.
- Verwijder voorzichtig de supernatant zonder de pellet te storen.
- Verwijder het zaaien medium uit de incubator.
- Voeg 500 μL voorverwarmde zaaien medium toe aan de pellet en meng het zeer goed met een pipet om de cellen te hervatten.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Verdun de celsuspensie met het zaaien medium tot een dichtheid van 5 x 105 cellen/ml.
- Voeg onder een bioveiligheidskast 90 μL van het verdunde mengsel toe aan elk goed in het midden van de Afdekstrook.
Opmerking: Laad de deeltjes die niet zijn opgeschort in de DNase niet. - Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C gedurende 3 − 4 uur.
- Voeg na incubatie 500 μL voorverwarmde kweekmedium I toe aan elk goed en plaats de plaat terug in de incubator (37 °C).
6. behandeling van de herstelde cellen
- Na 7 dagen, vervang het oude medium door Fresh Culture medium II (kweekmedium ik aangevuld met cytosine uracilarabinoside [Ara-C, 4 μM] en 100 μg/mL boviene serumalbumine [BSA]; Zie tabel 1).
Opmerking: deze stap is essentieel om te voorkomen dat de groei van niet-neuronale cellen. - Bewaak het kweekmedium eenmaal per dag. Als de pH verandert (aangegeven door een uitgesproken kleurverandering, meestal geel), verwijder dan de helft (bijna 250 μL) van het oude medium uit alle putjes en voeg 300 μL voorverwarmde kweekmedium I toe aan elk van hen om nutriënten verlies te voorkomen.
Opmerking: fenolrood in kweekmedium is een goede indicatie van de pH van het medium en de activiteit van de cellen. Probeer de blootstellingstijd van de cellen tot een minimum te beperken. Dit voorkomt elke stress die van invloed kan zijn op hun levensvatbaarheid.
7. verzamelen en fixeren van cellen
Opmerking: afhankelijk van het experimentele ontwerp kunnen de cellen op elke willekeurige dag worden verzameld, op elk gewenst tijdpunt.
- Maak een aparte 24-put met de corresponderende numerieke organisatie en voeg 100 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) toe aan elk goed.
- Om cellen op de gewenste dagen te oogsten (afhankelijk van het experimentele Protocol), verwijdert u voorzichtig de afdek stroken uit de putjes van de oorspronkelijke kweek plaat en plaatst u deze in de corresponderende putjes van de PFA-gevulde plaat.
- Voeg PFA toe aan de putjes om de afdek stroken volledig onder te dompelen.
Opmerking: Voeg de PFA niet rechtstreeks op de Afdekstrook toe om celloslating van de Afdekstrook te voorkomen. - Houd de PFA plaat bij 4 °C gedurende 30 − 120 min.
- Na incubatie, herstelt u de plaat op kamertemperatuur.
- Was de afdek stroken 3x gedurende 5 minuten zachtjes met 1x PBS.
- Ga door naar het immunokleurings proces.
Opmerking: in deze studie werd een fluorescentiemicroscoop met een camera gebruikt om de beelden vast te leggen en in montages te monteren met behulp van een beeldbewerkingssoftware toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebaseerd op de verschillende geboortedata van neuronale subtypen in het cerebellum, leverden culturen van E12 − E18-muis embryo's verschillende celtypen op. Grote projectie neuronen, zoals CN neuronen (E9 − E12) en PCs (E10 − E13), ontstonden vroeg tijdens de Cerebellaire ontwikkeling. In muizen, submodule en Golgi cellen ontstond tussen ~ E13 – E18 en onderging terminale divisies tot postnatale week 4.
Vervanging van oud medium I met Fresh Culture medium II op dagen in vitro (DIV) 7 zal uiteindelijk de proliferatie van gliale cellen voorkomen. De interneuronen van de moleculaire laag, zoals mand en stellaatcellen, differentiëren na de geboorte. Daarom werden de meeste cellen in het kweekmedium bij E18 geacht een combinatie te zijn van Pc's, submodules cellen, CN en sommige Golgi-cellen. Calbindin 1 (CALB1), een specifieke marker van Pc's, werd gebruikt om de morfologische veranderingen tijdens de 21-daagse tijd cursus te volgen. Op DIV 0 waren de cellichamen van Pc's detecteerbaar (bijv. 10 − 11 h van incubatie), maar de uitgroei van neuriet was nog niet begonnen (Figuur 2a). Door DIV 3 toonde de axonale-extensie vooruitgang, terwijl dendritische processen net begonnen waren. Deze status bleef vrijwel onveranderd tot de tweede week in vitro (WIV) (Figuur 2b–D). Op DIV 10 begonnen enkele verspreide takken en primaire dendrites met stekels te groeien (figuur 2e). Het ontkiemen van de nieuwe primaire dendrites gebeurde continu na DIV 14. Na DIV 14 nam het aantal secundaire en tertiaire dendrites dus toe en ontwikkelde het brede takken op DIV 21 (figuur 2F,G).
Het is belangrijk om te weten dat de timing van de morfologische veranderingen in vitro niet hetzelfde patroon als in vivo kan volgen. Naar aanleiding van deze resultaten, in een ander experiment de gezien cerebellaire Primordia van E12, E13, E14, en E15 werden gekweekt voor 3 weken. De gekweekte Pc's uit E12 en E13 ontwikkelen geen dendritische uitgroei op DIV 18 behalve axonale verlengingen (Figuur 3a,B). Echter, na dezelfde periode van tijd, de gezien cerebellaire primordium culturen van E14 en E15 toonde dendritische uitgroei en arborisatie (figuur 3c,D). Deze groeiritme variatie tussen neurale cellen in vitro werpt licht op een grote verandering die gebeurde in hun natuurlijke omgeving tussen de vroege en late fase van Cerebellaire ontwikkeling, die moet worden toegepast in vitro voor middellange optimalisatie.
Samen met pc's, er zijn andere neuronale celtypen in het cerebellum die zich ontwikkelen tijdens gezien primaire cereballaire culturen die kunnen worden gedetecteerd met behulp van specifieke neuronale markers. Dubbele immunofluorescentie-labeling voor CALB1 en een calcium bindend albumine-eiwit, parvalbumine (PVALB), toonde aan dat CALB1 uitdrukking uitsluitend werd beperkt tot Pc's in primaire cerebellaire culturen, terwijl PVALB werd uitgedrukt in CALB1+ neuronen ( dat wil zeggen, PCs) en PVALB+/Calb1– neuronen, die moleculaire laag interneuronen (mand/Stellate cellen) (figuur 4a–C). De Alfa-subeenheid (nav1,6) van het voltage-gated natrium kanaal (SCN) is een marker voor submodules cellen en pc's in het cerebellum20. Dubbele labeling met anti-SCN en anti-CALB1 toont de colokalisatie van cellichamen van submodules en Pc's in kweekmedium op DIV 21 (figuur 4D–F). Voor andere specifieke cerebellaire celtypen van gezien primaire cerebellaire culturen, zie marzban en Hawkes19.
Figuur 1: dorsale aspect van de muis hersenen schetsen van het cerebellum bij E18. De hersenvliezen worden aangeduid met gele vierkantjes. De locatie van het cerebellum wordt geschetst door de gele lijn, die door de middenhersenen en de caudally wordt beperkt door de Medulla Oblongata (geschetst door bruine stippellijnen). De cerebellum cerebellaire en halfrond worden weergegeven door bruine stippellijnen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: ontwikkeling van Purkinje-cellen (PCS) afgeleid van de muis cerebellum bij E18 in de primaire cultuur voor dagen in vitro (DIV) 0 – 21. (A) PC-somata (pijlpunten) werden gelabeld door immunofluorescentie met behulp van anti-calbindin 1 (CALB1) bij DIV 0 (na 10 uur). B) de eerste axonale uitbreiding (pijl) en vroege dendritische uitgroei (pijlpunt) verschijnen op div 3. De PCs ' dendritische uitgroei en ontwikkeling (pijlpunt) gaan verder op DIV 5 (C) en div 7 (D). De dendritische takken van de PCs zijn duidelijk te onderscheiden op DIV 10 (E) en div 14 (F) (pijlpunten) en uitgebreide dendritische bomen zijn detecteerbaar op div 21 (Arrowhead) (G). Schaal staven: A = 100 μm (geldt voor panelen B, C, D, E en F); G = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: ontwikkeling van Purkinje-cellen (PCS) afgeleid van de muis cerebellaire primordium op E12, E13, E14 en E15 na 18 dagen in de primaire cultuur (div 18). De axonen zijn de enige extensies (Arrow) van de PC somata in de primaire cultuur van de E12 en E13 cerebella primordium na 18 dagen in vitro (DIV 18) (A,B). De PCs ' dendriet uitgroei en uitbreiding ontwikkelen door div 18 (pijlpunt) alleen van E14 (C) en E15 (D) cerebellaire primaire culturen. Schaalbalk = 20 μm (geldt voor panelen a−D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: immunofluorescentie labeling van pc's, GABAergic interneuronen (mand en ecoagriturismo late cellen), en submodules cellen van E18 Mouse cerebellaire primaire cultuur bij div 21. (A−C) Dubbele labeling met anti-CALB1 (groen) en anti-PVALB (rood) toont Pc's en een paar interneuronen (Arrow) in contact met de PC dendritische Arbors. (D−F) Voltage-gated natriumkanalen (Scn's) in PC-lichamen met bewerkte dendrieten en tal van kleine submodules cellichamen (pijlpunt) zijn gelabeld met anti-SCN (rood) en dubbel-gelabeld met anti-CALB1 (groen). Afkortingen: Purkinje-cellen = Pc's; CALB1 = calbindin 1; PVALB = parvalbumin; SCN = met spanning gegated natrium kanaal. Schaalbalk = 100 μm (geldt voor A−F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam | Basismedium | Putrestsin | Natriumseleniet | L-glutamine | Gentamicine | T3 | N3 | Bsa | Ara-C | FBS |
| Cultuurmedium I | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | 0,5 ng/mL | Progesteron 4 μM, insuline 20 μg/mL, Transferrin 20 mg/mL | - | - | - |
| Seeding medium | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 μg/mL | - | - | - | - | 10% met kweekmedium I |
| Cultuurmedium II | Cultuurmedium I | 100 μg/mL | 4 μM | - | ||||||
Tabel 1: media composities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van primaire culturen is een bekende methode die van toepassing is op alle soorten neuronen17,18,19. In het gepresenteerde protocol, leggen we uit hoe cerebellaire neuronen isoleren en hun levensvatbaarheid te behouden met optimale overleving in vitro voor een maximum van 3 weken. Primaire cultuur van cerebellaire cellen, die werden geïsoleerd bij E15 − E18, bevestigt de verzameling van drie klassen van grote neuronen: Pc's, Golgi-cellen en CNs. De cellichamen en projecties van Golgi-cellen (waarvan sommige tevoorschijn komen op E19 − P5) en Soma van korrel cellen kunnen worden opgespoord door respectievelijk neurogranin (nrgn) en SMI32 antilichamen, binnen 21 dagen na cultuur19,21.
Een kritieke factor voor de overleving en het onderhoud van cerebellaire neuronen is het type kweekmedium dat wordt gebruikt. FBS aangevuld medium is al decennia lang een standaard aandoening voor cellijnen en primaire cultuur. Echter, ethische zorgen, variabiliteit in de serum samenstelling en het potentieel ervan om een bron van verontreiniging te zijn, hebben tot enige voorzichtigheid geleid22. Onlangs, supplement verrijkte DMEM/F-12 medium bleek te verminderen de kloof tussen fysiologische omstandigheden en in vitro neuronale modellen. Het medium gesuggereerd door Furuya et al. verbeterde overlevingskansen van pc's en verbeterde hun dendriet differentiatie in vergelijking met de veel gebruikte basale medium Eagle (BME)-gebaseerde serum-vrije medium17,18,23. Dit medium is uitgegroeid tot de basis van chemisch gedefinieerde media geïmplementeerd in cerebellum Cell primaire cultuur.
Primaire celculturing van neuronen heeft beperkingen. Zoals in elke in vitro cultuur, cellen kunnen overleven voor een beperkte periode van tijd. Zonder uitzondering, primaire neuronale cellen gekweekt in vitro kan alleen worden doorgangen een beperkt aantal keren. Overmatige passage zal invloed hebben op de cellulaire gezondheid, functie, en fenotype, en als zodanig renderen variabele experimentele resultaten. Daarom, neuronale/nonneuronale primaire cultuur gebaseerde experimenten meestal plaatsvinden binnen de eerste 3 weken van het starten van de cultuur24. De in vitro-omstandigheden zijn nog niet voldoende geoptimaliseerd om alle cellen van het zenuwstelsel gelijktijdig te dienen, op een manier die vergelijkbaar is met hun natuurlijke omgeving. Bijvoorbeeld, met behulp van Ara-C voor de remming van de proliferatie van niet-neuronale cellen is vrij gebruikelijk in studies waar het bereiken van een hogere overlevingskansen van neuronale cellen is een prioriteit. De kwaliteit van de primaire culturen is dus gebaseerd op methoden die de in vitro celpopulatie kunstmatig opnieuw verdelen ten gunste van de celsoorten van de rente25,26. Ondanks de beperkingen, primaire celcultuur is een uitstekende benadering voor het bestuderen van cellulaire mechanismen, signalering trajecten, en feno-en genotypische veranderingen onder omstandigheden waar geoptimaliseerde cellulaire groei (onder voorbehoud van de specifieke doelstellingen van het onderzoek) is zorgvuldig gekenmerkt en vergeleken met de in vivo situatie. Bovendien, primaire cerebellaire cultuur als een vereenvoudigd modelsysteem biedt een gecontroleerde micro-omgeving om te onderzoeken van de overvloed van morfologische en fysiologische effecten gemedieerd door de talrijke moleculen die neuronale cellen beïnvloeden27, 28. In hoeverre de fysiologische eigenschappen van deze cellen buiten de in vivo-instelling bewaard blijven, moet echter volledig worden opgehelderd.
De gepresenteerde methode is een kostenbesparend algemeen protocol voor het kweken van primaire cellen. Het biedt bredere opties voor het manipuleren van cellen en het testen van drugs zonder de aard van de cellen te veranderen, wat cruciaal is voor (pre-) klinische proeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studies werden gesteund door subsidies van de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040), en Children's Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035), en de ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational team subsidie (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
