Summary
생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.
Abstract
1 차적인 세포 배양의 사용은 시험관에서 신경계를 공부하는 중요한 공구의 한개가 되었습니다. 이 단순화된 모델 시스템을 사용하는 궁극적인 목표는 통제된 미세 환경을 제공하고 높은 생존율과 해리된 신경 세포 및 비신경세포의 자연적인 특징을 시험관 내 조건 하에서 가능한 한 많이 유지하는 것입니다. 이 문서에서는, 우리는 개발 마우스 소뇌에서 기본 뉴런을 격리 하는 방법을 보여 줍니다., 체 외 환경에서 그들을 배치, 그들의 성장을 설정, 그리고 몇 주 동안 그들의 생존 력 및 분화를 모니터링. 이 방법은 배아 일 12-18 사이에 소뇌로부터 해리된 배아 뉴런에 적용가능하다.
Introduction
수십 년 동안, 세포주 널리 전임상 연구 및 생물학적 연구에 높은 처리량 도구로 사용되었습니다. 비용 효과, 빠른 성장, 그리고 라이브 동물 사용의 감소는 이러한 세포를 사용 하 여 몇 가지 혜택. 그러나, 유전 적 변경 및 표현형 변화는 시험관 내 여러 구절 후 축적1. 1 차 세포에서 세포주 및 유전 적 불일치의 오인은 재현 할 수없는 실험과 거짓결론으로이어질 수 있습니다2,3,4,5. 따라서 뉴런(예: 신경 전달 물질, 이온 채널, 수용체 및 기타 뉴런 특이적 단백질)과 같은 분화 된 세포와 일부 유사성에도 불구하고 뉴런 세포주는 뉴런의 전체 표현형을 복제 할 수 없습니다. 성숙한 뉴런을 사용하는 것은 또 다른 옵션입니다. 그러나, 이들 세포는 배양에서 전파하기 어려운 비분열 후 세포이다. 더욱이, 세포 주기로 재입력은 세포 사멸을 침전시킬 수 있습니다6.
3차원(3D) 세포 배양, 오르노티픽 슬라이스 배양 및 오르가노이드 배양은 세포가 생체 내 설정을 모방하는 3D 형태로 배열할 수 있는 환경을 제공하기 위해 개발되었습니다. 따라서, 세포 간 통신, 이동, 주변 조직으로의 종양 세포의 침입, 및 혈관신생을 연구할 수 있다7. 그러나 엑스트라 셀룰러 매트릭스(ECM) 단백질 또는 합성 하이드로겔을 침구로 사용하는 추가 비용, 이미징의 어려움 및 고처리량 스크리닝 기기와의 호환성은 3D 세포 배양의 상당한 단점입니다. organotypic 조직 슬라이스 배양의 주요 단점은 많은 수의 동물을 사용하고 축삭 절제술의 부작용을 사용하며, 이는 축삭에 대한 표적 및 성장 인자의 접근성 및 결과적으로 신경사멸8로이어진다.
따라서 세포주 문제, 성숙한 세포 성장의 어려움 및 조직의 복잡성을 피하는 대체 접근법은 미성숙 한 1 차 세포의 체외 성숙입니다. 1차 세포는 인간 또는 동물 조직에서 직접 유래되고 효소 및/또는 기계적 방법을 사용하여 해리된다9. 배양 배지에서의 분리, 종자 및 유지의 주요 원리는 조직 공급원에 관계없이 유사하다. 그러나, 증식 및 성숙을 촉진하는 데 필요한 영양 인자는 매우 세포 특이적6이다.
각 소뇌 세포 모형의 '생년월일'을 아는 것은 1 차적인 배양 실험을 디자인하기 위한 전제조건입니다. 일반적으로, Purkinje 세포 (PC) 및 소뇌 핵의 뉴런 (CN), 인터뉴런 (예를 들어, 바구니, 성결민 세포) 및 과립 세포를 포함하는 더 작은 세포 전에 태어난다. 마우스에서, PC는 배아 일 사이 나온다 (E)10-E13, 반면 약 E9-E1210에서CN 뉴런.
그밖 소뇌 신경은 훨씬 나중에 태어납니다. 예를 들어, 마우스에서, 골지 인터뉴런의 소집단은 VZ로부터 생성된다 (~E14−E18) 및 분자 층에 위치한 나머지 인터뉴런 (바구니 세포 및 성세포)은 초기 사이의 백색 물질에서 전구 세포를 분할에서 나온다. 산후 (P)0- P711. 과립 세포는 외부 발아 영역(EGZ)으로부터 생성되며, 이차 발아 영역은 로스트랄 마름모꼴 립으로부터 유래되고 출생 후 말단 분열을 거치게 된다. 그러나 그들의 선구자가 E13-E16에서 마름모꼴 입술에서 발생하기 전에, 세포는 이미 소뇌 말단의 등쪽 표면에 세포의 얇은 층을 만들기 위해 피아 표면을 따라 장작으로 이동했다. 심실 신경 상피에서 유래하는 성상 세포 및 올리고벤드로시테와 같은 비신경성 거시세포는 각각 E13.5−P0 및 P0−P7에서태어난다11,12,13,14 ,15. 마이크로글리아는 E8-E10 사이와 중추 신경계로의 침입 후 E916에의해 마우스 뇌에서 검출될 수 있는 노른자-낭 원시 골수성 전구 세포로부터 유래된다.
본 문서에 제시된 방법은 원래 후루야 외 및 타바타 외17,18에의해 개발된 것을 기반으로 하며, 이는 위스타 쥐 세레벨라로부터 유래된 Purkinje 세포의 1차 배양에 최적화되었다. 우리는 지금 이 방법을 적응하고 마우스 소뇌신경19의성장을 공부하기 위하여 주의깊게 그것을 수정했습니다. 우리의 새로운 프로토콜과는 달리, 냉간 해부는 후루야의프로토콜(17)에파종 배지를 첨가하기 전에 해부 및 해동 단계에서 사용되는 주요 세척 버퍼이다. 이 버퍼는 영양 부족, 성장 인자, 그리고 호르몬 (모두 덜베코의 수정 된 독수리 매체에: 영양소 혼합물 F-12 [DMEM/F12]) 상기 단계 동안 세포 성장 및 생존을 지원 하기 위해 필요한. 또한, 뮤린 1 차 소뇌 배양에 대한 광범위한 경험을 바탕으로, 우리는 각 우물에서 500 μL의 배양 배지를 사용했으며 (1 mL 대신) 트리 요오드 티로닌 농도를 0.5 ng /mL로 증가하여 신경 세포의 성장을 향상시킵니다. 특히 Purkinje 세포 표현형을 가진 사람들은 배양에서 수지상 가지의 성장을 촉진합니다. 이 기사에서 특징인 주요 방법은 배아 발달 중에 다른 작은 설치류 (예 : 다람쥐 및 햄스터)에 광범위하게 적용 될 수 있으며 다양한 배아 단계에서 소뇌 신경 발생 및 분화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 종마다 다릅니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 캐나다 동물 관리 위원회의 기관 규정 및 실험 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 지방 당국의 승인을 받았습니다("Bannatyne Campus 동물 관리" 위원회"). 사용된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다. 마취의 적당한 깊이는 조작과 발가락 핀치 또는 각막 반사와 관련되었던 호흡 비율에 있는 아무 변경도 없었다는 것을 관찰해서 확인되었습니다.
1. 준비
참고: 임신 후 E12-E18에 대한 연구 계획에 따라 시간 적 임신 마우스의 제공을 예약합니다. 타이밍의 선택은 원하는 셀 특성에 따라 달라집니다(아래 참조). 실험 최소 2일 전에 커버 슬립과 플레이트를 준비합니다. 폴리-L-오르니틴은 커버 슬립에 세포 부착을 향상시키기 위해 코팅 재료로 사용됩니다.
- 셀 분리 2일 전에 커버슬립을 코팅하십시오.
- 원형 커버 슬립을 24개의 웰 플레이트에 놓고, 멸균 조건하에서 생물 안전 성 캐비닛에 놓습니다. 오염을 방지하기 위해 각 커버 슬립 사이에 간격을 두십시오.
- 각 커버 슬립의 중앙에 90 μL의 폴리 L-오르니틴(PLO, 500 μg/mL)을 추가합니다. 뚜껑을 닫고 플레이트를 37°C/5%CO2 인큐베이터에 2일 동안 부드럽게 놓습니다.
참고: 배양 중에 덮개 미끄러짐이 더 많이 유출될 수 있습니다. 커버 슬립은 드롭을 배치 한 후 PLO로 완전히 덮일 필요가 없습니다. 하룻밤 배양 하는 동안, PLO 커버 슬립의 가장자리에 동등 하 게 배포.
- 세포 격리 하루 전에, 배양 배지 I(퍼트린 100 μM, 셀레마이트 나트륨 30 nM, L-글루타민 3.9 mM, 겐타미신 3.5 μg/mL, 트라이-이오드티로닌(T3) 0.5 ng/mL, N3 보충제[N3 μs]를 함유하는 배양 배지 I(DMEM/F-12)를 준비한다. 트랜스페린 20 mg/mL]) 및 시딩 배지(배양 배지 I [N3 및 T3 없이] 10% 태아 소 혈청 [FBS]를 함유)하고 4°C에 저장한다. 트립신 작업 솔루션 준비 (0.25%) DMEM/F12에서 4°C로 유지합니다.
참고: 중간 컴포지션은 표 1에제공됩니다. - 세포 분리의 날에, 배양 배지 I 및 37°C에서 인큐베이터에 시딩 배지를 배치한다.
참고 : 소뇌 격리를 시작하기 전에 모든 도구와 작동 표면이 멸균되어 있는지 확인하십시오. - 커버 슬립을 씻어 주세요.
- 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 꺼낸다.
- 멸균 조건하에서 이중 증류수(DDW)로 24웰 플레이트 3배에 있는 커버 슬립을 세척합니다. 매번 커버가 DDW에 5분 동안 담가 져서 포부를 시작하십시오.
- 커버 슬립을 생물 안전 성 캐비닛에 적어도 2 시간 동안 그대로 두어 완전히 건조하십시오.
2. 소뇌 컬렉션
- 얼음 차가운 1x 인산 완충 식염수(PBS)로 채워진 10cm 멸균 플라스틱 페트리 접시 3개, 차가운 1x 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 채워진 페트리 접시 3개, 얼음-차가운 해부 매체(1x HBSS)로 채워진 페트리 접시 약 5개 준비 10 μg/mL)을 함유하고 있습니다. 얼음에 그들을 유지합니다.
- E18 CD1 임신 마우스를 40% 이소플루란으로 마취시다. 마우스에 자궁 경부 탈구를 수행합니다. 70 % 에탄올 용액으로 복부를 살균하십시오.
- 가위를 사용하여 음모 심립에서 xiphoid 과정에 대한 피부 절개를 만듭니다. 그런 다음 집게로 피부를 잡고 복강을 엽니 다.
- 포셉으로 자궁 경적을 절제하고 얼음에 얼음 차가운 1x PBS에서 3 배 씻어.
참고 : 다음 단계는 모두 신진 대사 속도를 최소화하고 조직과 세포 손상을 방지하기 위해 얼음에 실시되어야한다.
3. 소뇌 해부
- 마지막 세척 단계 후, 한 쌍의 미세 한 포셉을 사용하여 1 x HBSS에서 자궁에서 배아를 분리하고 얼음 차가운 해부 매체로 옮김을 옮김. 해부 매체에서 가위로 배아를 참수하십시오. 깨끗한 해부 매체에 조직을 놓습니다.
참고: 미세 해부에 입체 현미경을 사용하는 것은 선택 사항입니다. - 미세 한 집게로 두개골을 잡고 외부 음향 고기와 궤도 구멍의 열등한 테두리에 포라멘 매그넘에서 라인에 두개골의 측면 측면에서 작은 가위 한 쌍으로 calvarium을 잘라.
참고 : 이 단계를 수행하면 두개골 기지 의 수준에서 두개골 구멍이 노출되고 뇌를 쉽게 제거 할 수 있습니다. - 한 쌍의 미세 한 쌍을 사용하여 두개골 베이스를 제거하고 두개골을 뇌에서 벗겨냅니다.
- 조심스럽게 소뇌의 수막을 제거, 중간 소뇌 peduncle와 폰의 측면 표면에서 시작.
- 소뇌 페달을 잘라 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 분리(그림 1).
- 수집된 세레벨라를 멸균 된 15 mL 원뿔 형 튜브에 즉시 14 mL의 DMEM / F12로 채워진 얼음위에 놓습니다.
- 1,000 x g,4 °C에서 1 분, 3 x로 튜브를 원심 분리합니다. 매번 피펫으로 상류를 부드럽게 제거하고 신선한 얼음으로 차가운 DMEM/F12에 펠릿을 다시 놓습니다.
참고: 시료를 분실하지 않으려면 캐비닛 흡입을 가능한 한 적게 사용하십시오.
4. 소뇌 해리
- 3.7단계에서 펠릿에 미리 따뜻해진 (37°C) 트립신 2 mL을 넣고 적절한 혼합을 위해 부드럽게 피펫을 피펫으로 넣습니다.
- 튜브를 37°C 수조에 12분 동안 놓습니다.
- 배양 후, 튜브를 생체 안전 성 캐비닛에 가져와서 트립신을 비활성화하기 위해 DMEM / F12 10 mL를 추가하십시오.
- 혼합물을 1,200 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 3회 반복합니다.
- DMEM/F12로 멸균 플라스틱 이송 파이펫을 예열합니다.
- 세척 및 최종 원심분리 후, 3.5 mL의 DNase 작업 용액 (DNase I 스톡 용액 1 mL [0.05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBS]를 500 μL의 열 불활성화 FBS 및 2 mL의 DMEM/F12펠릿에 추가합니다.
- 혼합물이 균일 한 유백색 색상에 도달 할 때까지 적어도 30 배 파이펫으로 조직을 삼중화.
5. 셀 수집
- 혼합물에 얼음 차가운 DMEM/F12 10 mL을 추가합니다.
- 샘플을 1,200 x g,4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 상류를 제거합니다.
- 인큐베이터에서 시딩 배지를 제거합니다.
- 펠릿에 미리 온화 한 파종 매체 500 μL을 추가하고 세포를 다시 일시 중단하기 위해 파이펫을 사용하여 아주 잘 섞습니다.
- 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 세포 현탁액을 시딩 배지로 5 x 105 셀/mL의 밀도로 희석합니다.
- 생체 안전 성 캐비닛에서 커버 슬립의 중앙에 희석 된 혼합물의 90 μL을 각 우물에 추가하십시오.
참고: DNase에서 일시 중단되지 않은 파티클을 로드하지 마십시오. - 플레이트를 37°C에서 3-4시간 동안 인큐베이터에 놓습니다.
- 배양 후, 미리 온난화된 배양 배지 I의 500 μL을 각각 잘 첨가하고 플레이트를 인큐베이터(37°C)에 다시 넣는다.
6. 회복 된 세포의 치료
- 7일 후, 구배지를 신선한 배양 배지 II로 교체하였다(배양배지는 시토신 아라비노시드[아라-C, 4 μM]와 100 μg/mL 소 혈청 알부민[BSA]; 표 1참조)로 보충하였다.
참고: 이 단계는 비신경세포의 성장을 피하는 데 매우 중요합니다. - 하루에 한 번 배양 배지를 모니터링합니다. pH가 변화하는 경우(일반적으로 노랗게 표시됨) 모든 웰에서 구 배지의 절반(거의 250 μL)을 제거하고 영양손실을 피하기 위해 미리 온난화된 배양 배지 I의 300 μL을 각각 첨가한다.
참고: 배양 배지에서 페놀 레드는 배지의 pH 및 세포의 활성의 좋은 지표이다. 인큐베이터 조건에서 세포의 노출 시간을 최소화하십시오. 이렇게 하면 생존 가능성에 영향을 줄 수 있는 스트레스를 방지할 수 있습니다.
7. 셀 수집 및 고정
참고 : 실험 설계에 따라 세포는 언제든지 언제든지 수집 할 수 있습니다.
- 상응하는 수치 조직과 별도의 24 웰 플레이트를 준비하고 각 웰에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 100 μL을 첨가한다.
- 원하는 날에 세포를 수확하려면 (실험 프로토콜에 따라), 원래 배양 판의 우물에서 커버 슬립을 부드럽게 제거하고 PFA 충전 플레이트의 해당 우물에 놓습니다.
- 우물에 PFA를 추가하여 커버 슬립을 완전히 담그습니다.
참고: 커버 슬립에서 셀 분리를 방지하려면 커버 슬립에 직접 PFA를 추가하지 마십시오. - PFA 플레이트를 30-120분 동안 4°C로 유지합니다.
- 배양 후 플레이트를 실온으로 복원하십시오.
- 1x PBS로 커버 슬립을 5분 동안 3x 가볍게 씻으십시오.
- 면역 염색 과정을 진행합니다.
참고: 이 연구에서는 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고 이미지 편집 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 몽타주로 조립했습니다.
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Representative Results
소뇌에 있는 신경 특수형의 다른 생년월일에 근거를 두어, E12-E18 마우스 태아에게서 배양은 다른 세포 모형을 산출했습니다. CN 뉴런 (E9−E12) 및 PC (E10−E13)와 같은 대형 프로젝션 뉴런은 소뇌 발달 중에 일찍 나타났습니다. 마우스에서, 과립 및 골지 세포는 ~ E13-E18 사이에서 발생하였고 산후 주 4까지 말단 분열을 겪었다.
오래된 배지I를 시험관 내(DIV) 7일에서 신선한 배양 배지 II로 대체하면 결국 신경교 세포 증식을 방지할 것이다. 바구니와 성결민 세포와 같은 분자 층의 인터뉴런은 출생 후 분화합니다. 따라서, E18에서 배양 배지내의 대부분의 세포는 PC, 과립 세포, CN 및 일부 골지 세포의 조합일 것으로 예상되었다. PC의 특정 마커인 Calbindin 1(CALB1)은 21일 시간 코스 동안 형태학적 변화를 추적하는 데 사용되었습니다. DIV 0에서, PC의 세포체는 검출가능하였다(예를 들어, 10-11시간의 배양), neurite의 자성장은 아직 시작되지않았다(도 2A). DIV 3에 의해, 축축한 연장은 진전을 보여주었습니다, 수지상 프로세스는 막 시작된 동안. 이 상태는 시험관 내 2주까지 거의 변하지않았다(WIV) (그림 2B–D). DIV 10에서 척추가 있는 몇 가지 희소한 가지와 1차 모수석이 자라기 시작했습니다(그림2E). 새로운 1차 모수석의 발아는 DIV 14 이후 지속적으로 발생하였다. 따라서 DIV 14 이후, 이차 및 삼차 모수석의 수가 증가하고 DIV 21에서 넓은 분기를 개발하였다(도2F,G).
생체 외에서 형태학적 변화의 타이밍이 생체 내에서와 동일한 패턴을 따르지 않을 수 있다는 것을 아는 것이 중요합니다. 이러한 결과에 따라, 또 다른 실험에서 E12, E13, E14 및 E15로부터의 해리된 소뇌 프리모르디아를 3주 동안 배양하였다. E12 및 E13으로부터의 배양된 PC는 축축확장(도3A,B)을제외한 DIV 18에서 어떤 수지상 의 성장도 개발하지 않았다. 그러나, 같은 기간 이후에, E14 및 E15로부터의 해리된 소뇌 프리모르듐 배양체는 수지상 의 자생 및 수입원화(도3C,D)를보였다. 시험관내 신경세포 간의 이러한 성장 리듬 변화는 소뇌 발달초기와 후기 단계 사이의 자연 환경에서 일어난 큰 변화에 빛을 비추며, 이는 중간 최적화를 위해 시험관내에서 적용되어야 한다.
PC와 함께, 특정 신경 마커를 사용 하 여 검출 될 수 있는 해리 된 기본 소뇌 문화 동안 개발 하는 소뇌에 다른 신경 세포 유형이 있다. CALB1과 칼슘 결합 알부민 단백질에 대한 이중 면역 형광 라벨링, 파르브 알부민 (PVALB), CALB1 발현은 1 차 소뇌 배양에서 PC로 독점적으로 제한된 반면 PVALB는 CALB1+ 뉴런 (neurons) 즉, PC) 및 PVALB+/CALB1– 뉴런, 이는 분자층 인터뉴런 (바구니/스텔레이트 세포)(도 4A–C). 전압 게이트 나트륨 채널(SCN)의 알파 소단위(Nav1.6)는소뇌(20)에서과립 세포 및 PC에 대한 마커이다. 반대로 SCN 및 반대로 CALB1을 가진 이중 표지는 DIV 21에 배양 배지에 있는 과립 세포 바디 및 PC의 동경화를 나타낸다(도 4D–F). 해리 된 기본 소뇌 배양에서 다른 특정 소뇌 세포 유형에 대 한, 마즈반과 호크스 를 참조 하십시오19.
그림 1: E18에서 소뇌를 설명하는 마우스 뇌의 등쪽 양상. 수막은 노란색 사각형으로 표시됩니다. 소뇌의 위치는 중뇌에 의해 rostrally 및 수질 oblongata에 의해 (갈색 파선에 의해 설명)에 의해 codally 제한 되는 노란색 선에 의해 설명 됩니다. 소뇌 말과 반구는 갈색 파선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: E18에서 마우스 소뇌로부터 유래된 퍼킨제 세포(PC)의 발달은 시험관내(DIV) 0-21일 동안 일 동안 일 체내에서 배양된다. (A)PC 소마타(화살촉)는 DIV 0(10시간 이후)에서 항칼빈빈 1(CALB1)을 사용하여 면역형광에 의해 표지되었다. (B)첫 번째 축축확장(화살표) 및 초기 수지상 자성장(화살촉)이 DIV 3에 나타납니다. PC의 수지상 성장과 개발 (화살촉)은 DIV 5(C)및 DIV 7(D)에서계속됩니다. PC의 수지상 가지는 DIV10(E)및 DIV 14(화살촉)에서 명확하게 구별할 수 있으며, 정교한 수지상 나무는 DIV 21(화살촉)(G)에서 감지할 수 있습니다. 축척 막대: A = 100 μm(패널 B, C, D, E 및 F에 적용됩니다); G = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 1차 배양에서 18일 후 E12, E13, E14 및 E15에서 마우스 소뇌 프리모르듐으로부터 유래된 푸르킨제 세포(PC)의 개발(DIV 18). 축색은 18일 간 시험관내(DIV 18)(A,B)에서E12 및 E13 세레벨라 프리모르듐의 1차 배양에서 PC 소마타로부터 의 유일한 확장(arrow)이다. PC의 수상돌기 의 자생 및 확장은 E14(C)및 E15(D)소뇌 기본 문화에서만 DIV 18 (화살촉)에 의해 개발됩니다. 스케일 바 = 20 μm (패널 A에적용 -D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: DIV 21에서 E18 마우스 소뇌 1차 배양으로부터의 PC, GABAergic 인터뉴런(바구니 및 성골 세포) 및 과립 세포의 면역형 광증 라벨링. (A−C) 반대로 CALB1 (녹색) 및 반대로 PVALB (빨강)를 가진 이중 라벨은 PC 및 PC 수지상 아버와 접촉하는 몇몇 인터뉴런 (화살표)를 보여줍니다. (D−F) 정교한 수상돌기와 수많은 작은 과립 세포 체 (화살촉)가있는 PC 바디의 전압 게이트 나트륨 채널 (SCN)은 안티 SCN (빨간색)으로 표시되고 안티 CALB1 (녹색)으로 이중 라벨이 지정됩니다. 약어: 퍼킨제 세포 = PC; CALB1 = 칼빈딘 1; PVALB = 파브알부민; SCN = 전압 게이트 나트륨 채널. 스케일 바 = 100 μm (A-F에적용). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 기본 매체 | 푸트르신 | 셀레네 나트륨 | L-글루타민 | 겐타미신 | T3 | N3 | Bsa | 아라 C | FBS |
| 배양 배지 I | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3.9 mM | 3.5 μg/mL | 0.5 ng/mL | 프로게스테론 4 μM, 인슐린 20 μg/mL, 트랜스퍼린 20 mg/mL | - | - | - |
| 시종 매체 | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3.9 mM | 3.5 μg/mL | - | - | - | - | 10% 배양 배지 I |
| 배양 배지 II | 배양 배지 I | 100 μg/mL | 4 μM | - | ||||||
표 1: 미디어 컴포지션.
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Discussion
1차 배양물의 사용은 모든 유형의 뉴런에 적용할 수 있는 공지의 방법17,18,19. 제시된 프로토콜에서, 우리는 소뇌 뉴런을 격리하고 최대 3 주 동안 시험관내에서 최적의 생존으로 생존력을 유지하는 방법을 설명합니다. E15−E18에서 분리된 소뇌 세포의 1차 배양은 PC, 골지 세포 및 CN의 세 가지 종류의 큰 뉴런의 집합을 확인합니다. 골지 세포의 세포 체 및 돌출부(일부는 E19−P5에서 나타남) 및 과립 세포의 소종은 각각 뉴로그라닌(NRGN) 및 SMI32 항체에 의해, 배양 21일 이내에19,21.
소뇌 뉴런의 생존 및 유지를 위한 중요한 요소는 사용되는 배양 배지의 유형이다. FBS 보충 된 매체는 수십 년 동안 세포주 및 기본 배양에 대 한 표준 조건 되었습니다. 그러나, 윤리적 관심사, 혈청 조성의 가변성, 그리고 오염의 근원이 될 그것의 잠재력은, 몇몇 주의를주도했다 22. 최근, 보충 농축 된 DMEM/F-12 배지 생리 조건과 생체 외 신경 모델 사이의 격차를 줄이기 위해 발견 되었다. 후루야 등에서 제안한 배지는 PC의 생존율을 향상시키고 널리 사용되는 기저 배지 독수리(BME)에 비해 그들의 모수분 분화를 향상시켰다.-무혈청 배지17,18,23. 이 배지는 소뇌 세포 1 차 배양에서 구현된 화학적으로 정의된 매체의 기초가 되었다.
뉴런의 1 차적인 세포 배양에는 한계가 있습니다. 어떤 시험관 내 배양에서와 같이, 세포는 시간의 제한된 기간 동안 살아남을 수 있습니다. 예외 없이, 시험관 내에서 배양된 1차 신경세포는 제한된 횟수만 으로 통과될 수 있다. 과도한 패시징은 세포 건강, 기능 및 표현형에 영향을 미치며, 이러한 렌더링 가변 실험 결과. 따라서, 뉴런/비신경성 1차 배양계 실험은 일반적으로배양24를시작한 후 처음 3주 이내에 일어난다. 시험관 내 조건은 아직 충분히 그들의 자연 환경과 유사한 방식으로, 신경계의 모든 세포를 동시에 제공하기 위해 최적화되지 않았습니다. 예를 들면, Nonneuronal 세포의 증식을 억제하기 위하여 Ara-C를 사용하여 신경세포의 더 높은 생존율을 달성하는 것이 우선순위인 연구 결과에서 아주 일반적입니다. 따라서, 1차 배양물의 질은 관심있는 세포유형인 25,26에찬성하여 시험관내 세포 집단을 인위적으로 재조정하는 방법에 의존한다. 그것의 한계에도 불구하고, 1 차적인 세포 배양은 최적화된 세포 성장 (특정 연구 목표에 따라) 주의 깊게 조건 하에서 세포 기계장치, 신호 통로 및 페노 및 genotypic 변경을 공부하는 훌륭한 접근입니다 생체 내 상황과 비교됩니다. 또한, 단순화된 모델 시스템으로서 1차 소뇌 배양은신경세포(27)에영향을 미치는 수많은 분자에 의해 매개되는 형태학적 및 생리적 효과의 과다를 조사하기 위한 제어된 미세환경을제공한다. 28. 그러나, 이들 세포의 생리적 특성이 생체내 설정 의 외부에 어느 정도 보존되는지는 완전히 해명될 수 있다.
제시된 방법은 1차 세포를 배양하기 위한 비용 효율적인 일반 프로토콜이다. 그것은 세포의 본질을 변경하지 않고 세포를 조작하고 약물을 테스트하기위한 광범위한 옵션을 제공합니다, 이는 에 중요한 (사전)임상 시험.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (HM: NSERC 발견 교부금 # RGPIN-2018-06040), 그리고 매니토바의 어린이 병원 연구소 (HM: 그랜트 # 320035), 그리고 ALS 캐나다-뇌 캐나다 아서 J에서 보조금에 의해 지원 되었다. 허드슨 번역 팀 그랜트 (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
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