Summary
Bu çalışmada embriyonik kök hücrelerden immün uyarıcı granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktörler taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin izole edilmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Embriyonik kök hücreler (ESC' ler), kendini yenileyebilen ve her türlü embriyonik hücreye ayırabilen pluripotent kök hücrelerdir. Diğer birçok hücre tipi gibi, ESC'ler de ekzomlar gibi küçük membran vesiklelerini hücre dışı ortama bırakır. Ekzozomlar hücreler arası iletişimin temel arabulucuları olarak hizmet eder ve birçok (pato) fizyolojik süreçte temel bir rol oynar. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) immün yanıtı modüle etmek için bir sitokin olarak işlev eder. Eksozomlarda GM-CSF varlığı, bağışıklık düzenleyici işlevlerini artırma potansiyeline sahiptir. Burada, GM-CSF, ES-D3 numaralı murine ESC hücre hattında bıçaklanarak aşırı ifade edildi. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinden yüksek kaliteli eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinleri (EV) izole etmek için bir protokol geliştirilmiştir. İzole ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler çeşitli deneysel yaklaşımlarla karakterize edildi. Daha da önemlisi, eksozom zenginleştirilmiş EV'lerde önemli miktarda GM-CSF bulunduğu bulunmuştur. Genel olarak, ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık düzenleyici faaliyetlerini uygulamak için hücresiz veziküller olarak işlev görebilir.
Introduction
ESC'ler preimplantasyon embriyosunun blastosist aşamasından türetilir1. Pluripotent kök hücreler olarak, ESC'ler her türlü embriyonik hücreye kendi kendini yenileme ve ayırt etme yeteneğine sahiptir. Olağanüstü gelişimsel potansiyelleri ve uzun vadeli proliferatif kapasiteleri nedeniyle, ESC'ler biyomedikal araştırmalar için son derece değerlidir1. Mevcut araştırma çalışmaları büyük ölçüde DIYABET, kalp hastalığı ve nörodejeneratif hastalıklar 2,3,4dahil olmak üzere çeşitli ana patolojik bozukluklar için ESC'lerin terapötikpotansiyelineodaklanmıştır.
ESC'ler de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin hücre dışı ortama değişken boyutlarda veziküller salması bilinmektedir ve bu EV'ler hücreler arası iletişimdeki rolleri nedeniyle birçok fizyolojik ve patolojik işleve sahiptir5. EV'lerin farklı alt tipleri arasında, ekzozomlar, çeşitli hücre tiplerinden, ara endosit bölmelerin, çokvesiküler gövdelerin (MVB'ler) plazma membran6ile füzyonu üzerine hücre dışı boşluğa salınan küçük membran vezikülleridir. Ekzozomların hücreler arası iletişime aracılık yaptığı ve birçok (pato)fizyolojik süreçlerde kritik rol aldığı bildirilmiştir7,8. Ekzozomlar bazı biyolojik işlevleri kendi ebeveyn hücrelerinden miras alırlar, çünkü ekzozomlar proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere sitozolden elde edilen biyolojik malzemeler içerir. Bu nedenle, belirli bir hastalığa özgü immün yanıtı uyarıcı ilişkili antijenler veya faktörler, belirli hücre türlerinden ekzozomlarda kapsüllenir9. Bu, kanser önleyici bir aşı olarak tümör türevi ekzozomları araştıran klinik çalışmaların önünü açtı10.
GM-CSF, farklı bağışıklık hücreleri tarafından salgılanan bir sitokindir11. Ortaya çıkan kanıtlar, GM-CSF'nin bağışıklık sistemini aktive ettiğini ve düzenlediğini ve antijen sunma sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir12. Örneğin, bir klinik rapor GM-CSF'nin tümörlere karşı bağışıklık tepkisini bir aşı adjuvan13olarak uyardığını göstermektedir. KLINIK DENEYLERDE GM-CSF'nin güçlü immün uyarıcı aktivitesini kullanmak için çeşitli GM-CSF tabanlı kanser immünoterapi stratejileri araştırılmıştır14. Bunlar arasında, ışınlanmış GM-CSF salgılayan tümör hücrelerinden oluşan bir kanser aşısı, metastazlı tümörlerde hücresel ve humoral antitümör yanıtları ve sonraki nekrozu indükleyerek ileri melanom hastalarında bazı vaatlerde bulundu15.
ESC'lerden elde edilen ekzozomlar orijinal ESC'lerle benzer biyolojik aktivitelere sahip olduğundan, belki ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozomlar bağışıklık tepkisini düzenlemek için hücresiz veziküller olarak işlev görebilirim. Bu makalede, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmıştır. Bu ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık tepkisini modüle etmek için bağışıklık düzenleyici veziklinler olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ES-D3 hücrelerinin kült örültme
- Eksozom içermeyen fetal sığır serumu (FBS) oluşturmak için FBS'yi 4 °C'de 16 saat boyunca 100.000 x g'da ultracentrifuge ve santrifüje yükleyin. Santrifüjlemeden sonra, ES-D3 murine ESC hücre hattını kültleştirmek ve ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler elde etmek için ekzozom içermeyen FBS olarak serum supernatant toplayın.
- ES-D3 hücrelerini kaplamadan önce, 15 cm doku kültürü yemeklerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca jelatin (%0,1) kullanarak kaplayın.
- Daha önce açıklanan bir protokol16'nınardından, jelatin kaplı 15 cm doku kültürü yemeklerinde besleyici katman hücreleri olmayan ES-D3 hücrelerini kültürleyin. ES-D3 hücre kültürü ortamı DMEM'den oluşur, ekzozom içermeyen FBS (%15), gereksiz amino asitler (0,1 mM), L-glutamin (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penisilin (50 birim/mL), streptomisin (50 μg/mL) ve lösemi inhibitör faktörü (LIF; 100 birim/mL). %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de kültür ES-D3 hücreleri.
- ES-D3 hücreleri 15 cm'lik doku kültürü yemeklerinde yaklaşık% 90 izdiah ulaştığında, ortamı aspirasyonla çıkarın. Hücreleri tripsin kullanarak yıkayın (%5 mL; %0,05). Yemeklere tripsin (5 mL) ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri bulaşıklardan toplayın.
- Trypsin'i devre dışı bırakmak için toplanan hücrelere taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri taze ortamda yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin.
- Hücreleri geçirmek için, ES-D3 hücrelerini (5 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm'lik bir doku kültürü çanağı ile taze orta (15 mL) ve kültür ile 3 gün boyunca plakalayın.
- Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin izolasyonu için hücre kültürü üstnatantını toplamak için, hücre kültürü süpernatantı toplamadan önce 3 gün boyunca ES-D3 hücrelerini (1 x 107)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm doku kültürü kabında taze orta (15 mL) ile tabaklayın.
2. GM-CSF ekspresyon plazmid üretimi
NOT: GM-CSF'yi ES-D3 hücrelerinde aşırı ifade etmek için transfection plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturun. Bu plazmidde, murine GM-CSF cDNA'nın marker proteini ile birlikte renilla reniformis GFP (hrGFP) ifadesi, insan polipeptid zincir uzama faktörü 1α (EF1α) promotörü17,18tarafından tahrik edilir.
- Vektör omurgasını oluşturun.
- İki DNA parçası oluşturmak için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI (100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP 'yi (20 μg DNA) sindirin: vektör omurgası (6,0 kb) ve FD3ER kesici ucu (2,5 kb).
- Sindirilmiş plazmid DNA'nın (10 μg) %50'sini bir adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 saat boyunca 37 °C'de alkali fosfataz (20 birim) ile tedavi edin. Agarose jel elektroforez (%2) kullanarak hem tedavi edilmemiş hem de defosforillenmiş DNA'yı çözün.
- Vektör omurga DNA parçalarını (6,0 kb) DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırın. Tedavi edilmemiş vektör omurgası boş vektör (pEF1α-IRES-hrGFP) görevi görecekken, defosforillenmiş vektör omurgası GM-CSF ifade eden plazmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) oluşturmak için kullanılacaktır.
- GM-CSF cDNA kesici ucu oluşturun.
- İki DNA parçası üretmek için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI(100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP 19 'u (20 μg) sindirin: vektör omurgası (6,5 kb) ve murine GM-CSF cDNA kesici ucu (474 bp).
- Sindirilen DNA'yı agarose jel elektroforezi (%2) ile çözün. DNA jel çıkarma kiti kullanarak murine GM-CSF cDNA parçasını (474 bp) arındırın.
- İfade plazmidlerini oluşturun.
- DNA ligasyon kiti kullanarak 2 ligasyon reaksiyonunu (10 μL toplam hacim) ayarlayın.
- Boş vektör pEF1α-IRES-hrGFP'yi oluşturmak için, işlenmemiş vektör omurgasını adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) kesin.
- pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturmak için, aşağıdaki DNA parçalarını birleştirir: (1) adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) ve (2) adım 2.2.2'de (474 bp; 200 ng) oluşturulan mGM-CSF cDNA parçasından defosforillenmiş vektör omurgası.
- 5 dakika boyunca 25 °C'de ligat. Liglenmiş DNA'yı DH5α yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. Dönüştürülmüş E. coli hücrelerini karbenisilin (50 μg/mL) içeren LB-agar plakaları üzerine plakalayın.
- DNA izolasyon kiti kullanarak plazmidleri tek E. coli kolonilerinden arındırın. Plazmidlerin kimliklerini DNA dizilimi ile doğrulayın.
- DNA ligasyon kiti kullanarak 2 ligasyon reaksiyonunu (10 μL toplam hacim) ayarlayın.
3. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinin üretimi
NOT: GM-CS'yi aşırı ifade etmek için ES-D3 hücrelerini plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP ile transfect. Plazmid pBabe-Neo'yu ES-D3 hücrelerine kotransfect18,20.
- Plazmidleri ES-D3 hücrelerine aktarın.
- ES-D3 hücrelerini (1,4 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 10 cm'lik doku kültürü çanağı ile transfeksiyon için kültür ortamı (10 mL) ile plakalayın. Kültür kaplamalı ES-D3 hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca.
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iki plazmid karışımı hazırlayın: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vektör kontrolü) ile pBabe-Neo (4 μg) ve (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, gm-CSF ifade eden) pBabe-Neo (4 μg). Transfection'ı, üreticinin protokolünü izleyerek bir transfection kiti kullanarak gerçekleştirin.
- Plazmid karışımlarını içeren her tüpe transfeksiyon ortamı (1 mL) ve transfeksiyon reaktifi (64 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın.
- Transfeksiyon karışımlarını ES-D3 hücrelerinin ilgili 10 cm'lik yemeklerine ekleyin. 5 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
- 10 cm'lik yemeklerdeki ortamı taze kültür ortamıyla (10 mL) değiştirin. 24 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
- Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonlarını oluşturun.
- Ortamı transfected ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%2 mL; %0,05). Tripsin (2 mL) ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır. Hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve tripsin nötralize etmek için 2 mL taze kültür ortamı ekleyin. 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj.
- Transknakte olmuş hücreleri taze kültür ortamında (10 mL) yeniden biriktirin. Üreticinin protokolünü izleyerek floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanarak transfected ES-D3 hücrelerinde GFP'nin floresan yoğunluğunu değerlendirin.
- Transfected hücreleri taze kültür ortamı (10 mL) içeren iki adet 10 cm'lik yemeklere aktarın. Bulaşmamış hücreleri ortadan kaldırmak için nembilin (0,5 mg/mL) ekleyin.
- Transkredaklı hücreleri neomisin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamında kültlü çalışmaya devam edin. Transfected ES-D3% 90 izdiah ulaştığında, hücreleri tekrar 15 cm doku kültürü yemeklerine aktarın. İşlemi 2 hafta boyunca tekrarlayın.
- Stably transfected ES-D3 hücrelerinin klonlarını oluşturun.
- Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonları oluşturulduktan sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi toplayın. Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri (1 x 107 hücre/mL) taze kültür ortamında yeniden biriktirin.
- Hücreleri steril 40 μm hücre süzgecinden filtreleyin. Üreticinin protokolüne uyarak FACS kullanarak GFP pozitif ES-D3 hücrelerini arındırın.
- Tek sıralanmış bir ES-D3 hücresini, yenidoğan içermeyen ortamda (200 μL) ebeveyn ES-D3 hücreleri (1 x 103)içeren jelatin kaplı (%0,1) 96 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyusuna plakalayın. Transtransfected ES-D3 hücrelerinin, transtrans enfekte olmayan ebeveyn meslektaşlarıyla birlikte kült halineilmesi, enfekte olmuş tek ES-D3 hücrelerinin tek bir klon olarak hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlar.
- Hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin ve daha sonra 96 kuyu plakalarına nembilin (0,5 mg / mL) ekleyerek enfekte olmayan ebeveyn ES-D3 hücrelerini ortadan kaldırın.
- GFP pozitif ES-D3 hücrelerini 1 hafta boyunca orta boy nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren 96 kuyu doku kültürü plakalarında kültleştirmeye devam edin. Klonal ES-D3 hücre hatlarını 1 hafta boyunca nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamı (5 mL) ile jelatin kaplı (%0,1) 6 cm doku kültürü yemeklerine aktarın.
- Üreticinin protokolüne uyarak, FACS kullanarak transfected ES-D3 hücre klonlarının her birinde GFP floresanının yoğunluğunu belirleyin. GM-CSF'yi veya yüksek düzeyde yeşil floresan içeren boş vektörü ifade eden ES-D3 klonlarını seçin.
- Üreticinin protokolüne uyarak, bir murine GM-CSF ELISA kiti kullanarak ES-D3 hücreleri tarafından salgılanan GM-CSF miktarlarını belirleyin.
4. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin izolasyonu
- ES-D3 hücrelerini (1 x 107) 15cm doku kültürü yemeklerinde 37 °C'de 72 saat boyunca kültür edin. Hücre kültürü üstnatant toplamak. Mağaza, ekzomal bütünlüğü korumak için 1 haftaya kadar 4 °C'de süpernatant topladı.
- Büyük hücre parçalarını yatıştırmak için bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 60 dakika boyunca 5.000 x g'da hücre kültürü üstnatantını santrifüj edin.
- Bir ultracentrifuge kullanarak 4 °C'de 90 dakika boyunca 100.000 x g'da süpernatant ve santrifüjü toplayın.
- Üsttekini çıkarın. Kalan kültür üstnatantı kaldırmak için her peleti fosfat tamponlu salin (PBS; 1 mL) ile iki kez hafifçe durulayın.
- Her peleti PBS'de yeniden diritin. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri protein içeriğine göre ölçün5.
- Ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'lerin protein konsantrasyonlarını bicinkoninik asit (BCA) tahlili ile ölçün. ES-D3 hücrelerinden beklenen ekzozom zenginleştirilmiş EV verimi, hücre kültürü süpernatantının yaklaşık 4 μg proteini / mL'dir. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri PBS'de yeniden canlandırın (protein konsantrasyonu: ~6 μg/μL). Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri -80 °C'de saklayın.
5. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin iletim elektron mikroskopisi ile karakterizasyonu
NOT: İletim elektron mikroskopisi (TEM) 5 kullanarak ESC'lerden izole edilen ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerin bileşimini ve yapısını araştırın5.
- Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (3-5 μg/μL) oda sıcaklığında 2 saat boyunca %2 EM sınıfı paraformaldehit konsantrasyonu ile sabitlayın.
- Sabit numuneleri (10 μL) karbon destek filmi ile bakır ızgaralara yükleyin. Numuneleri bakır ızgaralarla 1 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından ızgaraları filtre kağıdı ile boşaltın.
- Izgaraları üreticinin protokolüne uygun bir boyama çözeltisi ile lekelendirin.
- Izgaraları cımbız kullanarak bir filtre kağıdı parçasına aktarın. Izgaraların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasını bekleyin.
- Üreticinin protokolüne uyarak bir iletim elektron mikroskobu (50.000x büyütme) kullanarak elektron mikroskopi görüntüleri elde edin.
6. Ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin batı leke analizi ile değerlendirilmesi
- Tüm hücre özlerini hazırlayın.
- Ortamı 15 cm'lik yemeklerde kültürlenmiş ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%5 mL; %0,05). Hücrelere tripsin (5 mL) ekleyin. 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. Hücreleri toplayın ve tripsin nötralize etmek için taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. PBS'deki hücreleri yeniden biriktirin.
- Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da tekrar santrifüj edin. %0,5 SDS (5.000 hücre/μL) içeren SDS-PAGE yükleme arabelleğindeki hücreleri yeniden kullanın.
- Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
- Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin lizazlarını hazırlayın.
- Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri 1,2 μg/μL konsantrasyonda %0,5 SDS içeren SDS-PAGE yükleme tamponunda yeniden kullanın.
- Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
- Proteinleri Batı lekesi ile tespit edin.
- Bis-Tris PAGE jelinin her kuyusuna (%4-20) tam hücre özleri (10 μL; 5.000 hücre/μL) ve eksozomla zenginleştirilmiş EV lizazları (10 μL; 1,2 μg/μL) yükleyin. Proteinleri polivinylidene florür (PVDF) membranlarına aktarın.
- Membranları uygun primer ve sekonder antikorlarla kuluçkaya yatır. PBS, Ara-20 (%0,2) ve yağsız kuru süt (%10 w/v) içeren şişirme tamponunda antikorları seyreltin (aşağıda belirtilen konsantrasyonlarda).
- Aşağıdaki primer antikorları kullanın: anti-Annexin V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-sitokrom c (100 ng/mL), anti-protein disülfit isomerase (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) ve anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).
- Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan IgG (20 ng/mL) ve peroksidaz konjuge keçi anti-fare IgG (20 ng/mL).
- Gelişmiş bir kemimuminesans tespit kiti kullanarak proteinleri tespit edin.
7. ELISA tarafından ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerde GM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi
NOT: Üreticinin bazı değişikliklerle yaptığı protokolü izleyerek, ELSA tarafından murine GM-CSF için bir kit kullanarak exozom zenginleştirilmiş EV'lerdeki GM-CSF miktarlarını değerlendirin.
- ELISA plakasını yakalama antikor ile kapla. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (0,6 μg) sadece PBS'de veya PBS + %0,05 Ara-20 (100 μL) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tedavi edin. Kaplamalı ELISA plakasına işlenmiş numuneler ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.
- Örneklere algılama antikorları ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın. Örneklere Avidin-HRP ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.
- Mikro plaka okuyucuda emiciliği 450 nm olarak ölçerek ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerde GM-CSF konsantrasyonlarını belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GM-CSF, murine ESC'lerde aşırı ifade edilir.
ES-D3 hücrelerinde GM-CSF'yi kesin bir şekilde aşırı ifade etmek için, murine GM-CSF cDNA, pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Şekil 1A)ifade vektörünü oluşturmak için bir transfeksiyon vektörüne klonlandı. GM-CSF, ES-D3 hücrelerinde transfeksiyon ile aşırı ifade edildi ve geçici olarak transktaklı ES-D3 hücrelerinin yaklaşık% 20'si GFP pozitifti. GM-CSF'yi veya boş vektör kontrolünü kasten aşırı ifade eden hücre klonları FACS tarafından alındı. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, GM-CSF ifade eden ES-D3 hücre hattının veya boş vektörü ifade eden bir ES-D3 hücre hattının GFP floresan yoğunluğu ebeveyn meslektaşlarından çok daha yüksekti. Farklı hücre hatlarının hücre kültürü üstnatantındaki GM-CSF konsantrasyonlarını değerlendirmek için bir ELISA tahlili yapılmıştır (Şekil 2). GM-CSF'yi ifade eden ES-D3 hücreleri, hücre kültüründe boş vektör kontrollerinden belirgin şekilde daha yüksek GM-CSF seviyeleri üretti. Ayrıca, GM-CSF ifade eden ES-D3 hücreleri tarafından üretilen GM-CSF miktarı, daha önce bildirildiği gibi GM-CSF'yi ifade eden STO fibroblastlarınınkinebenzerdi.
Ekzozomlar, murine ESC'lerden elde edilen hücre dışı vezikliklerde zenginleştirilmiştir.
Vektör kontrolü ve GM-CSF ekspresyörü ES-D3 hücre kültürleri genişletildi ve hücre kültürü üstnatantı toplandı. EV'ler birkaç adım santrifüjlemeden sonra izole edildi. Tek EV'ler ilk olarak TEM tarafından değerlendirildi (Şekil 3). TEM görüntülerinde gösterildiği gibi, izole edilmiş EV'ler ekzomal preparatlarda yaygın olarak gözlenen farklı boyutlarda veziklinler içeriyordu5. Daha da önemlisi, tek tek veziklinlerin çapları 30-100 nm'ydi, eksozomları açıklayan önceki raporlarla tutarlı21. Ayrıca, EV'lerde ekzozomların varlığı Batı şişkinliği ile incelenmiştir (Şekil 4). CD81, annexin V ve Flotillin-1 dahil olmak üzere ekzomal belirteçlerin ekspresyözü, karşılık gelen tüm hücre özlerine (WCE) kıyasla ES-D3 hücrelerinden izole edilmiş EV'lerde belirgin bir şekilde geliştirilmiştir. Daha da önemlisi, ES-D3 türevli EV'lerde diğer subselüler bölme belirteçlerinin varlığı tespit edilmemiştir, (1) endoplazmik retikulum (ER) belirteç protein disülfid isomerase (PDI), (2) mitokondriyal belirteçler sitokrom c ve COX IV-subunit IV ve (3) sitolitik marker GAPDH dahil. Genel olarak, bu veriler ekzozomların ES-D3 hücrelerinden elde edilen EV'lerde yüksek oranda zenginleştiğini göstermektedir.
GM-CSF, ESC'lerden izole edilmiş ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin içinde lokalizedir.
Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin GM-CSF molekülleri içerip içermediğini belirlemek için, GM-CSF ekspresyonu olan veya olmayan ES-D3 hücrelerinden elde edilen ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerde GM-CSF seviyelerini değerlendirmek için ELISA tahlili yapılmıştır (Şekil 5). Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerde GM-CSF protein lokalizasyonunu daha fazla araştırmak için, GM-CSF seviyeleri ELISA tarafından farklı yıkama koşulları altında eksozom bakımından zenginleştirilmiş EV'lerde nicelleştirilmiştir. Bu amaçla, ekzomal zarları permeabilize etmek için ilk olarak Tween-20 (%0.05) deterjanı kullanıldı ve tamponlarda % 0.05 Ara-20 ile veya olmadan ELISA tahlilleri yapıldı. Tween-20'nin protein-protein etkileşimlerini azalttığı bilindiğinden, kontrol EV'lerinde tespit edilen arka plan GM-CSF seviyeleri yıkama tamponunda Tween-20 ile önemli ölçüde azaltılmıştır. Buna karşılık, GM-CSF eksprese eden hücrelerin EV'lerindeki GM-CSF seviyeleri Tween-20 ile önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, Tween-20 indüklenen ekzomal membran permeabilizasyonunun veziküllerin içindeki GM-CSF moleküllerini antikor tanıma için erişilebilir hale getirdiğini ve ekzomal GM-CSF moleküllerinin çoğunluğunun izole veziklin lümeninin içinde lokalize olduğuna dair kanıt sağladığını göstermektedir.
Şekil 1: Eksojen GM-CSF, ES-D3 hücrelerinde saplanarak aşırı ifade edilir.
(A) Bir EF1α promotörünün GM-CSF ifadesini kullandığı ve hrGFP'nin bir ifade işaretçisi olarak hizmet ettiği ES-D3 hücrelerinde murine GM-CSF'yi aşırı ifade etmek için plazmidin şematik diyagramı.
(B) GM-CSF eksprese eden ES-D3 hücrelerinde veya boş vektör kontrol muadillerinde GFP'nin floresan yoğunluğu FACS tarafından belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücreleri yüksek düzeyde GM-CSF üretir.
Belirtilen hücrelerin ortamındaki GM-CSF konsantrasyonları ELISA ile ölçüldü. Veriler, üç bağımsız ELISA ölçümünün ortalama ± standart sapmaları (ortalama ± SD) olarak sunulur: **p < 0.001, NS = önemli değil, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile ANOVA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ES-D3 türevli hücre dışı veziklinler iletim elektron mikroskopisi ile incelenir.
Hücre dışı veziklinler, GM-CSF'yi ifade eden plazmid veya boş vektör muadili ile transkredlenmiş ES-D3 hücrelerinden hazırlandı. Oklar tek tek veziklinleri gösterir. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ekzomal belirteçler, ES-D3 hücrelerinden izole edilmiş hücre dışı veziklilerde yüksek oranda yoğunlaşmıştır.
Belirtilen tüm hücre özlerinde (WCE) ve EV'lerde ekzozomlar, endoplazmik retikülum (ER), mitokondri ve sitozol için belirteç miktarları Batı şişkinliği ile değerlendirildi. PDI = protein disülfid isomerase. Moleküler ağırlık belirteçleri (kD) soldadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerde GM-CSF seviyelerinin değerlendirilmesi.
Belirtilen eksozom zenginleştirilmiş EV'lerdeki GM-CSF düzeyleri farklı ELISA koşullarında belirlendi. Eksozom zenginleştirilmiş EV'ler %0.05 Ara-20 ile veya olmadan ön işlemden geçirildi. ELISA, yalnızca PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 içeren yıkama tamponu kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler, üç bağımsız ELISA testinin ortalama ± SD'si olarak sunulmaktadır. *p < 0.05, **p < 0.005, TUKEY'in çoklu karşılaştırma testi ile ANOVA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, ekozomla zenginleştirilmiş EV'lerin bağışıklık modülatörü etkilerini incelemek için sunulabilen bağışıklık uyarıcı protein GM-CSF'yi taşıyan ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için son derece verimli bir yöntem göstermektedir. Çeşitli çalışmalar ekzomların bağışıklık düzenleyici ve anti-tümör fonksiyonları sergilediğini göstermektedir22. Bu nedenle, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden gelen ekzozomlar da bağışıklık yanıtını düzenleyen biyolojik faaliyetlere sahip olabilir. Bu protokolde eksojen murine GM-CSF, murine ES-D3 hücrelerinde transeksiyon ile sapkumla aşırı ifade edildi (Şekil 1). Daha da önemlisi, GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinden izole edilen ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerde önemli miktarda GM-CSF tespit edilmiştir (Şekil 5).
Bu veriler, neredeyse tüm GM-CSF'nin eksozom zenginleştirilmiş EV'lerde bulunduğunu göstermektedir. Sitokin olarak, GM-CSF proteininin çoğunluğu hücre dışı olarak salgılanır11. Diğer ekzomal kargo malzemeleri (örneğin, mRNA'lar, miRNA'lar ve proteinler) gibi, sitozoldeki GM-CSF molekülleri de çok amaçlı cisimlerin (MVB' ler) intralüminal veziküllerinde (ILV'ler) kapsüllenir 6,23. MVB'lerin plazma membran ile füzyonu üzerine, GM-CSF taşıyan SUV'ler hücre dışı alana salınır.
Bu protokolde önemli bir adım, MURINE ES-D3 hücrelerinde GM-CSF'yi etkili bir şekilde aşırı ifade etmektir (Şekil 2). Retroviral enfeksiyon ile bu hedefe ulaşmak için daha önceki çabalar, muhtemelen ESC'lerde transkripsiyonal seviyelerde retroviral gen ekspresyonunun baskılanması nedeniyle büyük ölçüde başarısız oldu24. İncelenen birkaç viral ve hücresel promotör arasında, insan EF1α promotörü ES-D3 hücrelerinde en sağlam aktiviteyi gösterdi. Daha da önemlisi, EF1α promotörünün kontrolü altındaki transgene ekspresyolü, transfected ES-D3 hücrelerinin uzun süreli hücre kültürünü takiben sabit kaldı. Eksojen GM-CSF'yi başka bir hücre tipinde ifade etmek için, çeşitli organizatörlerin verimliliğini değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV'leri izole etmek için bu yöntemin uygulanması, diğer kök hücre tiplerinin yanı sıra çeşitli sitokinleri ifade etmek için tasarlanmış tümör hücrelerine de genişletilebilir. GM-CSF gibi, çoğu sitokin hücre dışı olarak salgılanır25. Bu nedenle, bu yaklaşımın olası bir sınırlaması, eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerde biriken belirli bir sitokin miktarının biyolojik aktivitesini sergilemek için çok düşük olmasıdır. Belirli bir sitokin için, ekzozomla zenginleştirilmiş EV'lerde protein seviyesini ve biyolojik aktivitesini optimize etmek için yeni çalışmalar yapılması gerekir.
Bu çalışmadaki en kritik engel, GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 klonları üretmektir. Pluripotential durumu korumak ve in vitro hücre çoğalmasını teşvik etmek için, murine ESC'ler genellikle besleyici hücrelerin varlığında kültürlenir26. Sadece ESC'lerden ekzozom elde etmek için, kültür ESC27 için besleyici hücre içermeyen bir protokol kullanıldı. Bu çalışmada jelatin kaplı yemeklerde LIF ile takviye edilen ortam kullanılarak ES-D3 hücreleri kültürlenmiştir. Bu kültür koşulu altında ES-D3 hücrelerinin tek klonlarının plaka verimliliği ve çoğalması son derece düşüktü, bu da tek hücrelerden ES-D3 klonları üretmeyi çok zorlaştırdı. Parental ES-D3 hücrelerinden elde edilen koşullu ortamın eklenmesi, plakalı tek ES-D3 hücrelerinin çoğalma eksikliğini kurtaramadı. Bu sınırlamayı aşmak için, GM-CSF'yi aşırı ifade eden tek ES-D3 hücreleri ebeveyn ES-D3 hücreleri ile birlikte kaplanmıştır. Bu kaplama yaklaşımı, GM-CSF eksprese eden tek ES-D3 klonlarının canlılığını artırarak klonal çoğalmayı ve genişlemeyi kolaylaştırdı. Transktriye yakalandıktan sonra, doku kültürü plakalarına bağlı görünen tek ES-D3 klonları. Diğer ES-D3 hücrelerinin varlığından bağımsız olarak çoğaldılar, çünkü ebeveyn ES-D3 hücreleri kaplandıktan 48 saat sonra ortadan kaldırıldı ve sadece transfected tek ES-D3 hücrelerinin büyümesine izin verdi.
Genel olarak, farklı hastalık koşullarında bağışıklık yanıtını uyarma potansiyeline sahip ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV'leri başarıyla üretmek için bir protokol geliştirilmiştir. Ayrıca, yakın zamanda yayınlanan çalışmamız, ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerin kansere karşı hücresiz profilaktik bir aşı görevi görebildiğini göstermektedir28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li ve John W. Eaton ABD patent başvurusunda "Mühendislik embriyonik kök hücre türevli ekzozomları ve kullanım yöntemlerini içeren kompozisyonlar" sundular.
Acknowledgments
İletim elektron mikroskop görüntülerini elde eden Arkadiusz Slusarczyk ve Kentucky Biyomedikal Araştırma Altyapı Ağı'na (KBRIN, P20GM103436) minnettarız. Bu çalışma kısmen NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 ve CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) ve Free to Breathe Research Grant (K.Y.) hibeleri ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G.
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
