Summary
Denne undersøgelse beskriver en metode til at isolere exosome-beriget ekstracellulære vesikler transporterer immun-stimulerende granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktorer fra embryonale stamceller.
Abstract
Embryonale stamceller (EPC'er) er pluripotente stamceller, der er i stand til selvfornyelse og differentiering i alle typer embryonale celler. Ligesom mange andre celletyper frigiver EFC'er små membran vesikler, såsom exosomer, til det ekstracellulære miljø. Exosomer tjener som væsentlige mæglere af intercellulær kommunikation og spiller en grundlæggende rolle i mange (pato)fysiologiske processer. Granulocyte-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) fungerer som en cytokin for at modulere immunresponset. Tilstedeværelsen af GM-CSF i exosomer har potentiale til at øge deres immunregulerende funktion. Her blev GM-CSF stukket overekspresset i murine ESC cellelinjen ES-D3. En protokol blev udviklet for at isolere exosomberigede ekstracellulære vesikler (EVs) af høj kvalitet fra ES-D3-celler, der overekspresserer GM-CSF. Isolerede exosome-berigede elbiler var karakteriseret ved en række eksperimentelle tilgange. Det er vigtigt, at betydelige mængder GM-CSF blev anset for at være til stede i exosome-berigede elbiler. Samlet set kan GM-CSF-bærende exosome-berigede elbiler fra EFC'er fungere som cellefrie vesikler til at udøve deres immunregulerende aktiviteter.
Introduction
ESC'er er afledt af blastocyst fase af en præimplantation embryo1. Som pluripotente stamceller har ESC'er evnen til selv at forny og differentiere sig til enhver form for embryonale celler. På grund af deres bemærkelsesværdige udviklingspotentiale og langsigtede proliferative kapacitet er EFC'erne yderst værdifulde for biomedicinsk forskning1. Den nuværende forskningsindsats har i vid udstrækning fokuseret på EFC'ernes terapeutiske potentiale for en række større patologiske lidelser, herunder diabetes, hjertesygdomme og neurodegenerative sygdomme2,3,4.
Pattedyrsceller, herunder EPC'er, er kendt for at frigive vesikler med varierende størrelser til det ekstracellulære miljø, og disse elbiler besidder mange fysiologiske og patologiske funktioner på grund af deres rolle i intercellulær kommunikation5. Blandt forskellige undertyper af elbiler er exosomer små membran vesikler, der frigives fra forskellige celletyper i det ekstracellulære rum ved fusion af mellemliggende endoytiske rum, multivesicular organer (MVB'er), med plasmamembranen6. Exosomer er blevet rapporteret at mægle intercellulær kommunikation og er kritisk involveret i mange (pato)fysiologiske processer7,8. Exosomer arver nogle biologiske funktioner fra deres egne forældreceller, fordi exosomer indeholder biologiske materialer erhvervet fra cytosolen, herunder proteiner og nukleinsyrer. Således er de tilknyttede antigener eller faktorer, der stimulerer immunresponset, der er specifikt for en given sygdom, indkapslet i exosomer fra bestemte typer celler9. Dette banede vejen for kliniske forsøg udforske tumor-afledte exosomer som en anti-cancer vaccine10.
GM-CSF er en cytokin udskilles af forskellige typer af immunceller11. Nye beviser viser , at GM-CSF aktiverer og regulerer immunsystemet og spiller en væsentlig rolle i antigen-præsentationsprocessen12. For eksempel, en klinisk rapport tyder på, at GM-CSF stimulerer immunresponset på tumorer som en vaccine adjuvans13. Flere GM-CSF-baserede kræftimmunterapistrategier til udnyttelse af GM-CSF's potente immunstimulerende aktivitet er blevet undersøgt i kliniske forsøg14. Blandt disse, en kræftvaccine bestående af bestrålet GM-CSF-udskillende tumorceller har vist nogle løfte i avancerede melanom patienter ved at fremkalde cellulære og humoristiske antitumor svar og efterfølgende nekrose i metastaserede tumorer15.
Fordi exosomer stammer fra EFC'er besidder lignende biologiske aktiviteter som de oprindelige EFC'er, måske GM-CSF-regnskabsmæssige exosomer fra EFC'er kunne fungere som cellefri vesikler til at regulere immunresponset. I dette papir beskrives en detaljeret metode til fremstilling af exosomeberigede elbiler af høj kvalitet fra EFC'er, der udtrykker GM-CSF. Disse exosome-beriget elbiler har potentiale til at tjene som immunregulerende vesikler til at modulere immunresponset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrkning af ES-D3-celler
- For at generere eksosomfrit fosterkvægsserum (FBS) skal FBS ind i en ultracentrifuge og centrifuge ved 100.000 x g i 16 timer ved 4 °C. Efter centrifugering, indsamle serum supernatant som exosome-fri FBS for dyrkning af murin ESC celle linje ES-D3 og erhverve exosome-beriget elbiler.
- Før ES-D3-cellerne plates, skal du belægge 15 cm vævskulturretter ved hjælp af gelatine (0,1%) ved stuetemperatur i 30 min.
- Efter en tidligere beskrevet protokol16, kultur ES-D3 celler uden feeder lagceller i gelatine-belagt 15 cm væv kultur retter. ES-D3-cellekulturmediet består af DMEM, exosomefri FBS (15%), uvæsentlige aminosyrer (0,1 mM), L-glutamin (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penicillin (50 enheder/mL), streptomycin (50 μg/mL) og leukæmi-hæmmende faktor (LIF; 100 enheder/mL). Kultur ES-D3-celler ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
- Når ES-D3-cellerne når omkring 90% sammenløb i 15 cm vævskulturskåle, skal du fjerne mediet ved at håbe. Vask cellerne ved hjælp af trypsin (5 mL; 0,05%). Der tilsættes trypsin (5 mL) til opvasken, og inkuber ved 37 °C i 5 min. Saml cellerne fra opvasken.
- Tilsæt frisk kulturmedium (5 mL) til de indsamlede celler for at inaktivere trypsinen. Centrifugere cellerne ved 390 x g i 5 min. Resuspend cellerne i frisk medium og bestemme cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.
- For passaging celler, plade ES-D3 celler (5 x 106) i en gelatine-belagt (0,1%) 15 cm væv kultur skål med frisk medium (15 ml) og kultur i 3 dage før subculturing cellerne.
- For at indsamle cellekulturens supernatant til isolering af exosome-berigede elbiler plade plader ES-D3-cellerne (1 x 107) i en gelatinebelagt (0,1%) 15 cm vævskulturskål med frisk medium (15 ml) i 3 dage før indsamling af cellekultur supernatant.
2. Generering af GM-CSF udtryk plasmid
BEMÆRK: Generer transfection plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP for at overekspressere GM-CSF i ES-D3-celler. I denne plasmid, udtryk for murin GM-CSF cDNA sammen med markør protein humaniseret Renilla reniformis GFP (hrGFP) er drevet af den menneskelige polypeptid kæde forlængelse faktor 1α (EF1α) promotor17,18.
- Generer vektor rygraden.
- Fordøje plasmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) ved hjælp af begrænsningsenzymet EcoRI (100 enheder) ved 37 °C i 2 timer for at generere to DNA-fragmenter: vektorens rygrad (6,0 kb) og FD3ER-skær (2,5 kb).
- 50 % af det fordøjede plasmid-DNA (10 μg) overføres til et 1,5 mL mikrocentrifugrør og behandles med alkalisk fosfatase (20 enheder) ved 37 °C i 1 time. Løs både ubehandlet og dephosphoryleret DNA ved hjælp af agarosegelelektroforese (2%).
- Rense vektor rygrad DNA fragmenter (6,0 kb) ved hjælp af en DNA gel ekstraktion kit . Mens den ubehandlede vektor rygrad vil tjene som den tomme vektor (pEF1α-IRES-hrGFP), den affosphorylerede vektor rygrad vil blive brugt til at generere GM-CSF-udtrykke plasmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
- Generer GM-CSF cDNA-indsatsen.
- Fordøje plasmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) ved hjælp af begrænsningsenzym ecoRI (100 enheder) ved 37 °C i 2 timer for at producere to DNA-fragmenter: vektor rygraden (6,5 kb) og murin GM-CSF cDNA-indsatsen (474 bp).
- Løs det fordøjede DNA gennem agarosegelelektroforese (2%). Rense murin GM-CSF cDNA fragment (474 bp) ved hjælp af en DNA gel ekstraktion kit.
- Generer udtrykket plasmider.
- Opsætning af 2 ligationsreaktioner (10 μL totalvolumen) ved hjælp af et DNA-ligationssæt.
- Hvis du vil generere den tomme vektor pEF1α-IRES-hrGFP, skal du ligate den ubehandlede vektor rygrad fra trin 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
- For at generere pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP skal følgende DNA-fragmenter ligate følgende DNA-fragmenter: (1) den afforseforlede vektor rygrad fra trin 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng) og (2) mGM-CSF cDNA-fragmentet, der blev genereret i trin 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
- Ligate ved 25 °C i 5 min. Omdanne ligated DNA til DH5α kompetente E. coli celler. Pladen de transformerede E. coli-celler på LB-agarplader, der indeholder carbenicillin (50 μg/mL).
- Rense plasmider fra enkelte E. coli kolonier ved hjælp af en DNA isolation kit. Valider plasmidernes identitet ved hjælp af DNA-sekventering.
- Opsætning af 2 ligationsreaktioner (10 μL totalvolumen) ved hjælp af et DNA-ligationssæt.
3. Generering af ES-D3-celler, der overekspresserer GM-CSF
BEMÆRK: Transfect ES-D3-cellerne med plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP for at overekspressere GM-CS. Cotransfect plasmid pBabe-Neo i ES-D3 celler for at lette udvælgelsen af stabilt transfected celler18,20.
- Transfect plasmiderne ind i ES-D3-cellerne.
- ES-D3-cellerne (1,4 x 106)pladespladeres i en gelatinebelagt (0,1%) 10 cm vævskulturret med kulturmedium (10 ml) til transfektion. Kulturbelagte ES-D3-celler ved 37 °C i 24 timer.
- Der fremstilles to plasmidblandinger i 1,5 mL mikrocentrifugrør: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vektorkontrol) med pBabe-Neo (4 μg) og (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, udtrykke GM-CSF) med pBabe-Neo (4 μg). Udfør transfektion ved hjælp af et transfektsæt efter producentens protokol.
- Der tilsættes transfection medium (1 mL) og transfection reagens (64 μL) til hvert rør, der indeholder plasmidblandingerne og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsæt transfection blandinger til respektive 10 cm retter af ES-D3 celler. Inkuberes ved 37 °C i 5 timer.
- Udskift mediet i 10 cm retter med frisk kulturmedium (10 mL). Inkuberes ved 37 °C i 24 timer.
- Generer massepopulationer af stabilt transfected ES-D3-celler.
- Fjern mediet fra transfected ES-D3 celler. Vask cellerne med trypsin (2 mL; 0,05%). Der tilsættes trypsin (2 mL) og inkuberes ved 37 °C i 5 min. Overfør cellerne til et 15 mL centrifugerør og tilsæt 2 mL frisk kulturmedium for at neutralisere trypsin. Centrifuge ved 390 x g i 5 min.
- Brug de transfected celler i frisk kulturmedium (10 mL). Vurder fluorescensintensiteten af GFP i transfected ES-D3-celler ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) efter producentens protokol.
- Overfør de transfected celler i to 10 cm retter, der indeholder frisk kultur medium (10 mL). Tilsæt neomycin (0,5 mg/mL) for at eliminere uoversatte celler.
- Fortsæt med at dyrke de transfected celler i kulturmedium, der indeholder neomycin (0,5 mg/mL). Når den transfected ES-D3 når 90% sammenløb, overføre celler til 15 cm væv kultur retter igen. Gentag proceduren i 2 uger.
- Generer kloner af stabilt transfected ES-D3 celler.
- Når bulkpopulationer af stabilt transfected ES-D3-celler er genereret, indsamle cellerne som før. Bestem cellenumrene ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifugere cellerne ved 390 x g i 5 min. Brug cellerne (1 x 107 celler/mL) i frisk kulturmedium.
- Filtrer cellerne gennem en steril 40 μm cellesnive. Rense GFP-positive ES-D3-celler ved hjælp af FACS efter producentens protokol.
- Plade en enkelt sorteret ES-D3 celle i en brønd af en gelatine-belagt (0,1%) 96-brønd væv kultur plade, der indeholder forældrenes ES-D3 celler (1 x 103) i neomycin-fri medium (200 μL). Samdyrkende transfected ES-D3-celler med deres uoversatte forældremodparter sikrer, at stabilt transfected enkelt ES-D3-celler overlever og formerer sig som en enkelt klon.
- Kultur cellerne i 48 timer, og tilsæt derefter neomycin (0,5 mg/mL) til 96-brønd plader for at eliminere uoversatte forældre ES-D3 celler.
- Fortsæt med at dyrke de GFP-positive ES-D3-celler i 96-brøndvævskulturplader med medium indeholdende neomycin (0,5 mg/mL) i 1 uge. Overfør kloniske ES-D3-cellelinjer til gelatinebelagte (0,1%) 6 cm vævskulturretter med kulturmedium (5 ml), der indeholder neomycin (0,5 mg/ml) i 1 uge.
- Bestem intensiteten af GFP fluorescens i hver af transfected ES-D3 celle kloner ved hjælp af FACS, efter producentens protokol. Vælg ES-D3 kloner, der udtrykker enten GM-CSF eller den tomme vektor med høje niveauer af grøn fluorescens.
- Bestem mængden af GM-CSF udskilles af ES-D3 celler ved hjælp af en murine GM-CSF ELISA kit, efter producentens protokol.
4. Isolering af exosome-berigede ekstracellulære vesikler
- Kultur ES-D3-cellerne (1 x 107) i 15 cm vævskulturskåle i 72 timer ved 37 °C. Saml cellekulturen supernatant. Opbevar opsamlet supernatant ved 4 °C op til 1 uge for at bevare den eksosomale integritet.
- Centrifuge cellekultur supernatant ved 5.000 x g i 60 min ved 4 °C ved hjælp af en centrifuge til sediment store cellefragmenter.
- Supernatanten og centrifugen opsamles ved 100.000 x g i 90 min ved 4 °C ved hjælp af en ultracentrifuge.
- Fjern supernatanten. Skyl forsigtigt hver pille to gange med fosfat-buffered saltvand (PBS; 1 mL) for at fjerne resterende kultur supernatant.
- Resuspend hver pille i PBS. Kvantificer exosome-berigede elbiler ved deres proteinindhold5.
- Mål proteinkoncentrationen af exosomeberigede elbiler med en bicinchoninsyreanalyse (BCA). Det forventede udbytte af exosomeberigede elbiler fra ES-D3-celler er ca. 4 μg protein/mL cellekultur supernatant. Brug de exosomberigede elbiler i PBS (proteinkoncentration: ~6 μg/μL). Opbevar de eksoomberigede elbiler ved -80 °C.
5. Karakterisering af exosome-beriget ekstracellulære vesikler ved transmission elektronmikroskopi
BEMÆRK: Undersøg sammensætningen og strukturen af de exosomeberigede elbiler, der er isoleret fra EFC'er ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM)5.
- De eksosomeberigede elbiler (3-5 μg/μL) med en endelig koncentration på 2 % paraformaldehyd i EM-kvalitet ved stuetemperatur i 2 timer.
- Læg faste prøver (10 μL) på kobbergitre med kulstofstøttefilm. Inkuber prøverne med kobbergitre i 1 min, og dræn derefter gitrene med filterpapir.
- Plette gitrene med en farvningsløsning efter producentens protokol.
- Overfør gitrene til et stykke filterpapir ved hjælp af pincet. Lad gitrene tørre natten over ved stuetemperatur.
- Få elektronmikroskopibilleder ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (50.000x forstørrelse) efter producentens protokol.
6. Evaluering af exosome-beriget ekstracellulære vesikler ved western blot analyse
- Forbered hele celleekstrakter.
- Fjern mediet fra ES-D3 celler, der dyrkes i 15 cm retter. Vask cellerne med trypsin (5 mL; 0,05%). Føj trypsin (5 mL) til cellerne. Inkuberes ved 37 °C i 5 min. Saml cellerne og tilsæt frisk kultur medium (5 mL) for at neutralisere trypsin. Centrifugere cellerne ved 390 x g i 5 min. Brug cellerne igen i PBS.
- Bestemme cellenumre ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifugere cellerne igen ved 390 x g i 5 min. Brug cellerne igen i SDS-PAGE-belastningsbufferen, der indeholder 0,5 % SDS (5.000 celler/μL).
- Soniker prøverne i 10 s ved hjælp af en soniker med 10% amplitud (effekt: 500 W; ultralydsfrekvens: 20 kHz). Prøverne opvarmes ved 100 °C i 5 min.
- Forbered lysates af exosome-berigede elbiler.
- Brug de exosomberigede elbiler igen i SDS-PAGE-belastningsbufferen, der indeholder 0,5 % SDS, i en koncentration på 1,2 μg/μL.
- Soniker prøverne i 10 s ved hjælp af en soniker med 10% amplitud (effekt: 500 W; ultralydsfrekvens: 20 kHz). Prøverne opvarmes ved 100 °C i 5 min.
- Detekter proteiner ved western blot.
- Læg hele celler (10 μL; 5.000 celler/μL) og eksosomberigede EV-lysater (10 μL; 1,2 μg/μL) i hver brønd i en Bis-Tris PAGE gel (4-20%). Overfør proteiner til polyvinylidenfluenfluorid (PVDF) membraner.
- Inkuber membraner med passende primære og sekundære antistoffer. Fortynd antistoffer (i de koncentrationer, der er angivet nedenfor) i blottingbuffer, der indeholder PBS, Tween-20 (0,2%) og fedtfri tør mælk (10% w/v).
- Brug følgende primære antistoffer: anti-annexin V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-flotillin-1 (200 ng/mL), anti-cytochrom c (100 ng/mL), anti-protein disulfid isomerase (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) og anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).
- Brug følgende sekundære antistoffer: peroxidasekonjugeret ged anti-kanin IgG (20 ng/mL) og peroxidase-konjugeret ged anti-mus IgG (20 ng/mL).
- Detekter proteiner ved hjælp af et forbedret chemiluminescensdetekteringssæt.
7. Bestemmelse af GM-CSF-koncentrationer i exosomeberigede ekstracellulære vesikler af ELISA
BEMÆRK: Vurder mængden af GM-CSF i exosome-berigede elbiler ved hjælp af et sæt til murine GM-CSF, efter producentens protokol med nogle ændringer.
- Coat ELISA-pladen med opsamlingsantistof. Forkæl exosomeberigede elbiler (0,6 μg) alene i PBS eller PBS + 0,05 % Tween-20 (100 μL) ved stuetemperatur i 30 min. Tilsæt behandlede prøver til den coatede ELISA-plade og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Vask pladen med PBS alene eller PBS + 0,05% Tween-20.
- Der tilsættes detektionsantistof til prøverne. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Vask pladen med PBS alene eller PBS + 0,05% Tween-20. Føj Avidin-HRP til prøverne. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min. Vask pladen med PBS alene eller PBS + 0,05% Tween-20.
- Bestem koncentrationerne af GM-CSF i exosome-berigede elbiler ved at måle absorbansen ved 450 nm på en mikropladelæser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GM-CSF er overekspresseret i murine ESCs.
For at overekspressere GM-CSF i ES-D3-celler blev murine GM-CSF cDNA klonet til en transfectionvektor for at generere udtrykket vektor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figur 1A). GM-CSF blev overekspresseret i ES-D3-celler ved transfektion, og omkring 20 % af de forbigående overførte ES-D3-celler var GFP-positive. Celle kloner stably overekspressere GM-CSF eller den tomme vektor kontrol blev erhvervet af FACS. Som vist i figur 1Bvar GFP's fluorescensintensitet for en GM-CSF-udtrykkende ES-D3-cellelinje eller en ES-D3-cellelinje, der udtrykte den tomme vektor, meget højere end deres forældrekollegers. Der blev foretaget en ELISA-analyse for at evaluere GM-CSF-koncentrationerne i cellekulturens supernatant af forskellige cellelinjer (figur 2). ES-D3-celler, der udtrykker GM-CSF, producerede markant højere niveauer af GM-CSF i cellekulturens supernatante end deres tomme vektorkontrol. Desuden svarede mængden af GM-CSF, der genereres af GM-CSF-udtrykkende ES-D3-celler, til STO-fibroblaster, der udtrykker GM-CSF, som rapporteret tidligere19.
Exosomer er beriget med ekstracellulære vesikler afledt af murin ESCs.
Vektor kontrol og GM-CSF-udtrykke ES-D3 cellekulturer blev udvidet, og celle kultur supernatant blev indsamlet. Elbiler blev isoleret efter flere trin af centrifugering. Enkelt-elbiler blev først evalueret af TEM (figur 3). Som vist i TEM-billederne indeholdt isolerede elbiler vesikler af forskellige størrelser, som almindeligvis observeres i exosomale præparater5. Det er vigtigt, at diameteren af de enkelte vesikler var 30-100 nm, i overensstemmelse med tidligere rapporter, der beskriver exosomer21. Desuden blev tilstedeværelsen af exosomer i elbiler undersøgt af vestlig blotting (figur 4). Udtrykket af exosomale markører, herunder CD81, annexin V og Flotillin-1, blev markant forbedret i elbiler isoleret fra ES-D3-celler sammenlignet med tilsvarende hele celleekstrakter (WCE). Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af andre subcellulære rummarkører i ES-D3-afledte elbiler ikke blev påvist, herunder (1) endoplasmisk reticulum (ER) markørproteindisulfidisomerase (PDI), 2) mitokondriemarkørerne cytochrom c og COX IV-subunit IV og (3) den cytosolitiske markør GAPDH. Samlet set viser disse data, at exosomer var højt beriget med elbiler, der stammer fra ES-D3-celler.
GM-CSF er lokaliseret inde exosome-beriget ekstracellulære vesikler isoleret fra EFC'er.
For at afgøre, om exosome-berigede elbiler indeholder GM-CSF-molekyler, blev ELISA-analysen udført for at evaluere niveauet af GM-CSF i exosomeberigede elbiler erhvervet fra ES-D3-celler med eller uden GM-CSF-udtryk (Figur 5). For yderligere at undersøge lokalisering af GM-CSF-protein inden for exosomeberigede elbiler blev GM-CSF-niveauerne kvantificeret i exosomeberigede elbiler under forskellige vaskeforhold af ELISA. Til dette formål blev vaskemidlet Tween-20 (0,05%) først anvendt til at gennemtrænge de exosomale membraner, og ELISA-analyser blev udført i bufferne med eller uden 0,05% Tween-20. Da Tween-20 er kendt for at reducere protein-protein interaktioner, baggrunden GM-CSF niveauer opdaget i kontrol-elbiler blev reduceret betydeligt af Tween-20 i vaskebuffer. I modsætning hertil blev GM-CSF-niveauerne i elbiler af GM-CSF-udtrykkende celler øget betydeligt med Tween-20. Disse resultater viser, at Tween-20-induceret exosomal membran permeabilization gør GM-CSF molekyler inde i vesikler tilgængelige for antistof anerkendelse, hvilket giver bevis for, at de fleste exosomale GM-CSF molekyler er lokaliseret inde i lumen af isolerede vesikler.
Figur 1: Eksogen GM-CSF er stabilt overekspresseret i ES-D3-celler.
(A) Det skematiske diagram over plasmid for overekspressering af murin GM-CSF i ES-D3-celler, hvor en EF1α-promotor driver GM-CSF-udtryk, og hrGFP fungerer som udtryksmarkør.
(B) Fluorescensintensiteten af GFP i GM-CSF-udtrykkende ES-D3-celler eller deres tomme vektorkontrolmodstykker blev bestemt af FACS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ES-D3-celler, der overekspresserer GM-CSF, producerer høje niveauer af GM-CSF.
GM-CSF-koncentrationerne i de angivne cellers medium blev målt ved ELISA. Dataene præsenteres som gennemsnitlige ± standardafvigelser (gennemsnitlige ± SD) af tre uafhængige ELISA-målinger: ** p < 0,001, NS = ikke signifikant, ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: ES-D3-afledte ekstracellulære vesikler undersøges ved transmissionselektronmikroskopi.
Ekstracellulære vesikler blev fremstillet af ES-D3 celler transfected med plasmid udtrykke GM-CSF eller dens tomme vektor modstykke. Pile angiver individuelle vesikler. Skalalinje = 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Exosomale markører er stærkt koncentreret i ekstracellulære vesikler isoleret fra ES-D3-celler.
Mængden af markører for exosomer, endoplasmisk reticulum (ER), mitokondrier og cytosol i de angivne hele celleekstrakter (WCE) og elbiler blev evalueret af vestlig blotting. PDI = proteindisulfidisomerase. Molekylvægte markører (kD) er til venstre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Evaluering af GM-CSF-niveauer i exosomeberigede ekstracellulære vesikler.
Niveauet af GM-CSF i de angivne exosome-berigede elbiler blev fastsat under forskellige ELISA-betingelser. Exosome-berigede elbiler blev forbehandlet med eller uden 0,05% Tween-20. ELISA blev udført ved hjælp af vaskebuffer, der enten kun indeholder PBS eller PBS + 0,05% Tween-20. Dataene præsenteres som middel ± SD af tre uafhængige ELISA-analyser. * p < 0,05, ** p < 0,005, ANOVA med Tukey's multiple sammenligning test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser en meget effektiv metode til fremstilling af exosome-berigede elbiler, der bærer immunstimulerende protein GM-CSF, som kan anvendes til at studere immunmodulerende virkninger af exosome-berigede elbiler. Flere undersøgelser tyder på, at exosomer udviser immunregulerende og anti-tumor funktioner22. Eksosomer fra EFC'er, der udtrykker GM-CSF, kan således også have biologiske aktiviteter, der regulerer immunresponset. I denne protokol blev eksogen murin GM-CSF stukket overekspresseret i murin ES-D3-celler ved transfection (Figur 1). Det er vigtigt, at der blev påvist betydelige mængder GM-CSF i exosomeberigede elbiler isoleret fra ES-D3-celler, der overekspresserer GM-CSF (figur 5).
Disse data tyder på, at næsten alle GM-CSF ligger inden for exosome-berigede elbiler. Som cytokin udskilles størstedelen af GM-CSF-protein ekstracellulært11. Ligesom andre exosomale lastmateriale (f.eks mRNAs, miRNAs, og proteiner), GM-CSF molekyler i cytosol er indkapslet i intraluminale vesikler (ILVs) af multivesicular organer (MVBs)6,23. Ved fusion af MVB'er med plasmamembranen frigives GM-CSF-bærende ILV'er i det ekstracellulære rum.
Et vigtigt skridt i denne protokol er effektivt at overekspressere GM-CSF i murine ES-D3-celler (Figur 2). Tidligere bestræbelser på at nå dette mål ved retroviral infektion stort set mislykkedes, sandsynligvis på grund af undertrykkelsen af retrovirale genekspression på transskriptionsniveauerne i EFC24. Blandt flere virale og cellulære initiativtagere, den menneskelige EF1α promotor viste den mest robuste aktivitet i ES-D3 celler. Det er vigtigt, at transgene udtryk under EF1α-promotorens kontrol forblev stabilt efter langsigtet cellekultur af transfected ES-D3-celler. For at udtrykke eksogen GM-CSF i en anden celletype er der behov for yderligere undersøgelser for at evaluere effektiviteten af forskellige initiativtagere. Anvendelsen af denne metode til at isolere GM-CSF-bærende exosome-berigede elbiler kan udvides til andre stamcelletyper samt tumorceller konstrueret til at udtrykke forskellige cytokiner. Ligesom GM-CSF udskilles de fleste cytokiner ekstracellulært25. Derfor er en mulig begrænsning af denne tilgang, at mængden af en given cytokin akkumuleret i exosome-berigede elbiler er for lav til at udstille sin biologiske aktivitet. For en bestemt cytokin skal der udføres nye undersøgelser for at optimere dets proteinniveau og biologiske aktivitet i exosomeberigede elbiler.
Den mest kritiske forhindring i denne undersøgelse er at generere ES-D3 kloner overekspressere GM-CSF. For at opretholde den pluripotential tilstand og fremme cellespredning in vitro dyrkes murine EFC'er generelt i nærværelse af feederceller26. For udelukkende at erhverve exosomer fra EFC'er blev der anvendt en feedercellefri protokol til kultur-EFC'er27. I denne undersøgelse blev ES-D3-celler kultiveret i gelatinebelagte retter ved hjælp af medium suppleret med LIF. Pladeeffektiviteten og udbredelsen af enkelte kloner af ES-D3-celler under denne kulturtilstand var ekstremt lav, hvilket gør det meget udfordrende at generere ES-D3-kloner fra enkelte celler. Tilføjelsen af det betingede medium fra forældrenes ES-D3-celler kunne ikke redde spredningsdefekten hos belagt enkelte ES-D3-celler. For at overvinde denne begrænsning blev enkelte ES-D3-celler, der overekspresserer GM-CSF, forgyldt sammen med forældrenes ES-D3-celler. Denne plating-tilgang forbedrede levedygtigheden af GM-CSF-udtrykkende enkelte ES-D3-kloner og lettede udbredelsen og udvidelsen af kloner. Når transfected, enkelt ES-D3 kloner tilsyneladende knyttet til væv kultur plader. De spredte sig uanset tilstedeværelsen af andre ES-D3-celler, da forældrenes ES-D3-celler blev elimineret 48 timer efter at være blevet belagt, så kun transfected enkelt ES-D3-celler kunne vokse.
Samlet set blev der udviklet en protokol, der med succes skal generere eksosomeberigede elbiler, der transporterer GM-CSF fra EFC'er med potentiale til at stimulere immunresponset under forskellige sygdomsforhold. Desuden viser vores nyligt offentliggjorte undersøgelse, at GM-CSF-bærende exosome-berigede elbiler fra EFC'er kan tjene som en cellefri profylaktisk vaccine mod kræft28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li og John W. Eaton indsendte en amerikansk patentansøgning "Kompositioner bestående af manipulerede embryonale stamcellebaserede exosomer og brugsmetoder heraf."
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Mr. Arkadiusz Slusarczyk og Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) for at erhverve transmission elektron mikroskop billeder. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 og CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) og Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
