Summary
Denne studien beskriver en metode for å isolere eksosomberikede ekstracellulære vesikler som bærer immunstimulatorisk granulocytt makrofagkolonistimulerende faktorer fra embryonale stamceller.
Abstract
Embryonale stamceller (ESC) er pluripotente stamceller som er i stand til selvfornyelse og differensiering i alle typer embryonale celler. Som mange andre celletyper frigjør ESC-er små membran vesicles, for eksempel eksosomer, til det ekstracellulære miljøet. Eksosomer tjener som essensielle formidlere av intercellulær kommunikasjon og spiller en grunnleggende rolle i mange (pato)fysiologiske prosesser. Granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) fungerer som en cytokin for å modulere immunresponsen. Tilstedeværelsen av GM-CSF i eksosomer har potensial til å øke immunforsvaret. Her ble GM-CSF stabilt overekspressert i murine ESC-cellelinjen ES-D3. En protokoll ble utviklet for å isolere eksosole-berikede ekstracellulære vesikler av høy kvalitet (EVer) fra ES-D3-celler som overekspresserer GM-CSF. Isolerte eksosomberikede elbiler var preget av en rekke eksperimentelle tilnærminger. Det er viktig at betydelige mengder GM-CSF finnes i eksosomberikede elbiler. Totalt sett kan GM-CSF-bærende exosome-berikede EVer fra ESC-er fungere som cellefrie vesicles for å utøve sine immunregulerende aktiviteter.
Introduction
ESC er avledet fra blastocyststadiet av et preimplantasjonsembryo1. Som pluripotente stamceller har ESC evnen til å fornye seg selv og differensiere seg i alle typer embryonale celler. På grunn av deres bemerkelsesverdige utviklingspotensial og langsiktige proliferative kapasitet, er ESC-er ekstremt verdifulle for biomedisinsk forskning1. Nåværende forskningsinnsats har i stor grad fokusert på det terapeutiske potensialet til ESC for en rekke store patologiske lidelser, inkludert diabetes, hjertesykdom og nevrodegenerative sykdommer2,3,4.
Pattedyrceller, inkludert ESCer, er kjent for å frigjøre vesikler med variable størrelser til det ekstracellulære miljøet, og disse EVene har mange fysiologiske og patologiske funksjoner på grunn av deres rolle i intercellulær kommunikasjon5. Blant forskjellige undertyper av elbiler er eksosomer små membran vesicles frigjort fra ulike celletyper i det ekstracellulære rommet ved sammensmelting av mellomliggende endokytiske rom, multivesikulære legemer (MVB), med plasmamembranen6. Eksosomer har blitt rapportert å megle intercellulær kommunikasjon og er kritisk involvert i mange (pato)fysiologiske prosesser7,8. Eksosomer arver noen biologiske funksjoner fra sine egne foreldreceller, fordi eksosomer inneholder biologiske materialer anskaffet fra cytosolen, inkludert proteiner og nukleinsyrer. Dermed er de tilknyttede antigener eller faktorer som stimulerer immunresponsen som er spesifikk for en gitt sykdom, innkapslet i eksosomene fra bestemte typer celler9. Dette banet vei for kliniske studier som utforsket tumor-avledede eksosomer som en anti-kreftvaksine10.
GM-CSF er en cytokin utskilt av forskjellige typer immunceller11. Nye bevis viser at GM-CSF aktiverer og regulerer immunforsvaret og spiller en viktig rolle i antigen-presentasjonsprosessen12. For eksempel antyder en klinisk rapport at GM-CSF stimulerer immunresponsen på svulster som en vaksine adjuvant13. Flere GM-CSF-baserte kreftimmunoterapistrategier for å utnytte den potente immunstimulatoriske aktiviteten til GM-CSF har blitt undersøkt i kliniske studier14. Blant disse har en kreftvaksine sammensatt av bestrålede GM-CSF-utskillende tumorceller vist noe løfte hos avanserte melanompasienter ved å indusere cellulære og humorale antitumorresponser og påfølgende nekrose i metastaserte svulster15.
Fordi eksosomene avledet fra ESCs har lignende biologiske aktiviteter som de opprinnelige ESCene, kan kanskje GM-CSF-bærende eksosomer fra ESC-er fungere som cellefrie vesicles for å regulere immunresponsen. I dette dokumentet beskrives en detaljert metode for å produsere eksosomberikede elbiler av høy kvalitet fra ESC-er som uttrykker GM-CSF. Disse eksosomberikede ELBIL-ene har potensial til å fungere som immunregulerende vesikler for å modulere immunresponsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culturing ES-D3 celler
- For å generere exosome-fri foster bovint serum (FBS), last FBS inn i en ultracentrifuge og sentrifuge ved 100,000 x g i 16 timer ved 4 °C. Etter sentrifugering samler du serum supernatant som exosome-free FBS for å dyrke murine ESC celle linje ES-D3 og anskaffe exosome-beriket ELBILER.
- Før du plating ES-D3 celler, frakk 15 cm vev kultur retter ved hjelp av gelatin (0,1%) ved romtemperatur i 30 min.
- Etter en tidligere beskrevet protokoll16, kultur ES-D3 celler uten mater lag celler i gelatin-belagt 15 cm vev kultur retter. ES-D3 cellekulturmediet består av DMEM, eksosomfrie FBS (15 %), unødvendige aminosyrer (0,1 mM), L-glutamin (2 mM), β-mercaptoetanol (0,1 mM), penicillin (50 enheter/ml), streptomycin (50 μg/ml) og leukemihemmerfaktor (LIF; 100 enheter/ml). Kultur ES-D3 celler ved 37 °C i en 5 % CO2-fuktet inkubator.
- Når ES-D3-cellene når rundt 90% samløp i 15 cm vevskulturretter, fjern mediet ved aspirasjon. Vask cellene ved hjelp av trypsin (5 ml; 0,05%). Tilsett trypsin (5 ml) til oppvasken og inkuber ved 37 °C i 5 minutter. Samle cellene fra oppvasken.
- Tilsett friskt kulturmedium (5 ml) i de oppsamlede cellene for å inaktivere trypsin. Sentrifuger cellene på 390 x g i 5 min. Resuspend cellene i friskt medium og bestemme cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
- For passerende celler, skriv ES-D3-cellene (5 x 106) i en gelatinbelagt (0,1%) 15 cm vevskulturrett med friskt medium (15 ml) og kultur i 3 dager før du subkulturerer cellene.
- For å samle cellekulturen supernatant for isolering av eksosomberikede elbiler, skriv ES-D3-cellene (1 x 107) i en gelatinbelagt (0,1%) 15 cm vevskulturrett med friskt medium (15 ml) i 3 dager før du samler cellekultur supernatant.
2. Generasjon av GM-CSF uttrykk plasmid
MERK: Generer transfeksjonsplasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP for å overekspressere GM-CSF i ES-D3-celler. I denne plasmiden er uttrykk for murin GM-CSF cDNA sammen med markørproteinet humanisert Renilla reniformis GFP (hrGFP) drevet av den menneskelige polypeptidkjedeforlengelsesfaktoren 1α (EF1α) promotor17,18.
- Generer vektor ryggraden.
- Fordøye plasmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) ved hjelp av begrensningen enzymet EcoRI (100 enheter) ved 37 °C i 2 timer for å generere to DNA-fragmenter: vektorryggbenet (6,0 kb) og FD3ER-innsatsen (2,5 kb).
- Overfør 50% av fordøyd plasmid DNA (10 μg) til ett 1,5 ml mikrosenterrør og behandle med alkalisk fosfatase (20 enheter) ved 37 °C i 1 time. Løs både ubehandlet og defosforylatert DNA ved hjelp av agarose gelelektroforese (2%).
- Rens DNA-fragmentene for vektorryggen (6,0 kb) ved hjelp av et DNA-gelekstraksjonssett . Mens den ubehandlede vektor ryggraden vil tjene som den tomme vektoren (pEF1α-IRES-hrGFP), de defosforylatert vektor ryggraden vil bli brukt til å generere GM-CSF-uttrykkende plasmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
- Generer GM-CSF cDNA-innsatsen.
- Fordøye plasmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) ved hjelp av begrensningen enzymet EcoRI (100 enheter) ved 37 °C i 2 timer for å produsere to DNA-fragmenter: vektorryggbenet (6,5 kb) og murin GM-CSF cDNA-innsatsen (474 bp).
- Løs det fordøyde DNA-et gjennom agarose gelelektroforese (2%). Rens murin GM-CSF cDNA fragmentet (474 bp) ved hjelp av et DNA gel ekstraksjonssett.
- Generer uttrykksplasmidene.
- Sett opp 2 ligation reaksjoner (10 μL totalt volum) ved hjelp av et DNA ligation kit.
- Hvis du vil generere den tomme vektoren pEF1α-IRES-hrGFP, ligaterer du den ubehandlede vektorryggraden fra trinn 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).
- Hvis du vil generere pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligate følgende DNA-fragmenter: (1) defosforylatert vektor ryggrad fra trinn 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) og (2) mGM-CSF cDNA fragment generert i trinn 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
- Ligat ved 25 °C i 5 min. Forvandle ligatert DNA til DH5α kompetente E. coli-celler. Plate de transformerte E. coli-cellene på LB-agarplater som inneholder carbenicillin (50 μg/ml).
- Rens plasmider fra enkelt E. coli-kolonier ved hjelp av et DNA-isolasjonssett. Valider identiteten til plasmidene ved DNA-sekvensering.
- Sett opp 2 ligation reaksjoner (10 μL totalt volum) ved hjelp av et DNA ligation kit.
3. Generasjon ES-D3 celler overekspresserende GM-CSF
MERK: Transfekt ES-D3-cellene med plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP for å overekspressere GM-CS. Cotransfect plasmid pBabe-Neo i ES-D3 celler for å lette valg av stabilt transfekterte celler18,20.
- Transfekt plasmidene inn i ES-D3-cellene.
- Tallerken ES-D3-cellene (1,4 x 106) i en gelatinbelagt (0,1%) 10 cm vevskulturrett med kulturmedium (10 ml) for transfeksjon. Kulturbelagte ES-D3 celler ved 37 °C i 24 timer.
- Forbered to plasmidblandinger i 1,5 ml mikrosenterfugerør: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vektorstyring) med pBabe-Neo (4 μg) og (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, som uttrykker GM-CSF) med pBabe-Neo (4 μg). Utfør transfeksjon ved hjelp av et transfeksjonssett etter produsentens protokoll.
- Tilsett transfeksjonsmedium (1 ml) og transfeksjonsreagens (64 μL) i hvert rør som inneholder plasmidblandingene og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
- Tilsett transfeksjonsblandingene til respektive 10 cm retter av ES-D3-celler. Inkuber ved 37 °C i 5 timer.
- Bytt ut mediet i 10 cm retter med friskt kulturmedium (10 ml). Inkuber ved 37 °C i 24 timer.
- Generer bulkpopulasjoner av stabilt transfected ES-D3 celler.
- Fjern mediet fra transfekterte ES-D3-celler. Vask cellene med trypsin (2 ml; 0,05%). Tilsett trypsin (2 ml) og inkuber ved 37 °C i 5 minutter. Overfør cellene til et 15 ml sentrifugerør og tilsett 2 ml ferskt kulturmedium for å nøytralisere trypsin. Sentrifuge ved 390 x g i 5 min.
- Resuspend de transfekterte cellene i friskt kulturmedium (10 ml). Evaluer fluorescensintensiteten til GFP i transfiserte ES-D3-celler ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS), etter produsentens protokoll.
- Overfør de transfekterte cellene til to 10 cm retter som inneholder ferskt kulturmedium (10 ml). Tilsett neomycin (0,5 mg/ml) for å eliminere utransfected celler.
- Fortsett å dyrke de transfiserte cellene i kulturmediet som inneholder neomycin (0,5 mg/ml). Når den transfekterte ES-D3 når 90% samløp, overfør celler til 15 cm vevskulturretter igjen. Gjenta prosedyren i 2 uker.
- Generer kloner av stabilt transfected ES-D3 celler.
- Når bulkpopulasjoner av stabilt transfekterte ES-D3-celler genereres, samler du cellene som før. Bestem cellenumrene ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger cellene på 390 x g i 5 min. Resuspend cellene (1 x 107 celler / ml) i frisk kultur medium.
- Filtrer cellene gjennom en steril 40 μm cellesil. Rens GFP-positive ES-D3-celler ved hjelp av FACS, etter produsentens protokoll.
- Plate en enkelt sortert ES-D3 celle i en brønn av en gelatin-belagt (0,1%) 96-brønns vev kulturplate som inneholder foreldre ES-D3 celler (1 x 103) i neomycinfritt medium (200 μL). Kokulturerende transfekterte ES-D3-celler med sine utransfected foreldre kolleger sikrer at stabilt transfekterte enkelt ES-D3 celler overlever og sprer seg som en enkelt klone.
- Kultur cellene i 48 timer, og deretter legge neomycin (0,5 mg / ml) til 96-brønns plater for å eliminere utransfected foreldre ES-D3 celler.
- Fortsett å dyrke GFP-positive ES-D3-celler i 96-brønns vevskulturplater med middels inneholdende neomycin (0,5 mg/ml) i 1 uke. Overfør klone ES-D3 cellelinjer til gelatinbelagte (0,1%) 6 cm vevskulturretter med kulturmedium (5 ml) som inneholder neomycin (0,5 mg/ml) i 1 uke.
- Bestem intensiteten av GFP-fluorescens i hver av transfiserte ES-D3 cellekloner ved hjelp av FACS, etter produsentens protokoll. Velg ES-D3-klonene som uttrykker enten GM-CSF eller den tomme vektoren med høye nivåer av grønn fluorescens.
- Bestem mengden GM-CSF utskilt av ES-D3-celler ved hjelp av et murine GM-CSF ELISA-sett, etter produsentens protokoll.
4. Isolering av exosome-beriket ekstracellulære vesicles
- Kultur ES-D3-cellene (1 x 107) i 15 cm vevskulturretter i 72 timer ved 37 °C. Samle cellekulturen supernatant. Oppbevares supernatant ved 4 °C i opptil 1 uke for å opprettholde eksosomal integritet.
- Sentrifuger cellekulturen supernatant ved 5000 x g i 60 min ved 4 °C ved hjelp av en sentrifuge for å sedimentere store cellefragmenter.
- Samle supernatant og sentrifuge ved 100,000 x g i 90 min ved 4 °C ved hjelp av en ultracentrifuge.
- Fjern supernatanten. Skyll forsiktig hver pellet to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS; 1 ml) for å fjerne gjenværende kultur supernatant.
- Resuspend hver pellets i PBS. Kvantifisere eksosomberikede elbiler ved deres proteininnhold5.
- Mål proteinkonsentrasjonen av eksosomberikede elbiler med en bicinchoninic acid (BCA) analyse. Det forventede utbyttet av eksosomberikede elbiler fra ES-D3-celler er ca. 4 μg protein/ml cellekultur supernatant. Resuspend eksosomet-beriket ELBILER i PBS (proteinkonsentrasjon: ~6 μg/μL). Oppbevar de exosome-berikede ELBIL-ene ved -80 °C.
5. Karakterisering av eksosomberikede ekstracellulære vesikler ved overføringselektronmikroskopi
MERK: Undersøk sammensetningen og strukturen til de eksosomberikede EVene isolert fra ESC ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM)5.
- Fest de exosome-berikede ELBIL-ene (3-5 μg/μL) med en sluttkonsentrasjon på 2% EM-grad paraformaldehyd ved romtemperatur i 2 timer.
- Last faste prøver (10 μL) på kobbergitter med karbonstøttefilm. Inkuber prøvene med kobbergitter i 1 min, og tøm deretter gitteret med filterpapir.
- Flekk gitteret med en fargeløsning etter produsentens protokoll.
- Overfør rutenettene til et stykke filterpapir ved hjelp av pinsett. La gitteret tørke over natten ved romtemperatur.
- Anskaffe elektronmikroskopibilder ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop (50 000x forstørrelse), etter produsentens protokoll.
6. Evaluering av exosome-beriket ekstracellulære vesicles ved vestlig blot analyse
- Forbered hele celleekstrakter.
- Fjern mediet fra ES-D3-celler dyrket i 15 cm retter. Vask cellene med trypsin (5 ml; 0,05%). Legg trypsin (5 ml) til cellene. Inkuber ved 37 °C i 5 minutter. Samle cellene og legg til frisk kultur medium (5 ml) for å nøytralisere trypsin. Sentrifuger cellene på 390 x g i 5 min. Resuspend cellene i PBS.
- Bestemme cellenumre ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger cellene igjen ved 390 x g i 5 min. Resuspend cellene i SDS-PAGE lastebuffer som inneholder 0,5% SDS (5,000 celler / μL).
- Soniker prøvene i 10 s ved hjelp av en soniker med 10% amplitude (wattstyrke: 500 W; ultralydfrekvens: 20 kHz). Varm opp prøvene ved 100 °C i 5 minutter.
- Forbered lysates av exosome-beriket ELBILER.
- Resuspend exosome-beriket ELBILER i SDS-PAGE lastebuffer som inneholder 0,5% SDS i en konsentrasjon på 1,2 μg / μL.
- Soniker prøvene i 10 s ved hjelp av en soniker med 10% amplitude (wattstyrke: 500 W; ultralydfrekvens: 20 kHz). Varm opp prøvene ved 100 °C i 5 minutter.
- Oppdag proteiner ved vestlig blott.
- Last hele celleekstrakter (10 μL; 5000 celler/μL) og eksosomberikede EV-lysater (10 μL; 1,2 μg/μL) i hver brønn i en Bis-Tris PAGE gel (4-20%). Overfør proteiner til polyvinyllidfluoridmembraner (PVDF).
- Inkuber membraner med passende primære og sekundære antistoffer. Fortynn antistoffer (ved konsentrasjonene angitt nedenfor) i blotting buffer som inneholder PBS, Tween-20 (0,2%), og ikke-fett tørr melk (10% w / v).
- Bruk følgende primære antistoffer: anti-annexin V (200 ng/ml), anti-CD81 (50 ng/ml), anti-Flotillin-1 (200 ng/ml), anticytokrom c (10 ng/ml), antiproteindisulfid isomerase (200 ng/ml), anti-GAPDH (33 ng/ml) og anti-Oxphos COX IV-subenhet IV (600 ng/ml).
- Bruk følgende sekundære antistoffer: peroksidasekonjugert geit anti-kanin IgG (20 ng/ml) og peroksidasekonjugert geit antimus IgG (20 ng/ml).
- Oppdag proteiner ved hjelp av et forbedret chemiluminescence deteksjonssett.
7. Bestemme GM-CSF-konsentrasjoner i eksosomberikede ekstracellulære vesikler av ELISA
MERK: Evaluer mengden GM-CSF i eksosomberikede elbiler av ELISA ved hjelp av et sett for murine GM-CSF, etter produsentens protokoll med noen modifikasjoner.
- Belegge ELISA-platen med fangstantistoff. Behandle exosome-beriket elbiler (0,6 μg) i PBS alene eller PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) ved romtemperatur i 30 min. Tilsett behandlede prøver på den belagte ELISA-platen og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask platen med PBS alene eller PBS + 0,05% Tween-20.
- Legg til deteksjonsantistoff i prøvene. Inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask platen med PBS alene eller PBS + 0,05% Tween-20. Legg Avidin-HRP til eksemplene. Inkuber ved romtemperatur i 30 min. Vask platen med PBS alene eller PBS + 0,05% Tween-20.
- Bestem konsentrasjonene av GM-CSF i eksosomberikede elbiler ved å måle absorbansen ved 450 nm på en mikroplateleser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GM-CSF er overekspressert i murine ESCs.
For å stabilt overekspressere GM-CSF i ES-D3-celler ble murine GM-CSF cDNA klonet til en transfeksjonsvektor for å generere uttrykksvektoren pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figur 1A). GM-CSF ble overekspressert i ES-D3-celler ved transfeksjon, og omtrent 20% av forbigående transfekterte ES-D3-celler var GFP-positive. Cellekloner stabilt overekspresserende GM-CSF eller tom vektorkontroll ble anskaffet av FACS. Som vist i figur 1Bvar GFP-fluorescensintensiteten til en GM-CSF-uttrykkende ES-D3-cellelinje eller en ES-D3-cellelinje som uttrykte den tomme vektoren, mye høyere enn foreldrenes kolleger. En ELISA-analyse ble utført for å evaluere GM-CSF-konsentrasjonene i cellekulturens supernatant av forskjellige cellelinjer (figur 2). ES-D3 celler som uttrykker GM-CSF produsert markant høyere nivåer av GM-CSF i cellekulturen supernatant enn deres tomme vektorkontroll. Videre var mengden GM-CSF generert av GM-CSF-uttrykkende ES-D3-celler lik sto fibroblaster som uttrykte GM-CSF, som rapportert tidligere19.
Eksosomer er beriket i ekstracellulære vesicles avledet fra murine ESCs.
Vektorkontroll og GM-CSF-uttrykkende ES-D3 cellekulturer ble utvidet, og cellekultur supernatant ble samlet inn. Elbiler ble isolert etter flere trinn med sentrifugering. Enkelt-ELBILER ble først evaluert av TEM (figur 3). Som vist på TEM-bildene inneholdt isolerte elbiler vesikler av forskjellige størrelser, som vanligvis observeres i eksosomale preparater5. Viktigst, diameteren til de enkelte vesiklene var 30-100 nm, i samsvar med tidligere rapporter som beskriver eksosomer21. Videre ble tilstedeværelsen av eksosomer i elbiler undersøkt av vestlig blotting (figur 4). Uttrykket av eksosomale markører, inkludert CD81, annexin V og Flotillin-1, ble markert forbedret hos elbiler isolert fra ES-D3-celler sammenlignet med tilsvarende hele celleekstrakter (WCE). Det er viktig at tilstedeværelsen av andre subcellulære rommarkører i ES-D3-avledede elbiler ikke ble oppdaget, inkludert (1) endoplasmisk retikulum (ER) markørproteindisulfid isomerase (PDI), (2) mitokondriemarkørene cytokrom c og COX IV-subenhet IV, og (3) den cytosytosykliske markøren GAPDH. Samlet sett viser disse dataene at eksosomer var svært beriket i elbiler avledet fra ES-D3-celler.
GM-CSF er lokalisert inne i exosome-beriket ekstracellulære vesicles isolert fra ESCs.
For å avgjøre om eksosomberikede elbiler inneholder GM-CSF-molekyler, ble ELISA-analysen utført for å evaluere nivåene av GM-CSF i eksosomberikede elbiler anskaffet fra ES-D3-celler med eller uten GM-CSF-uttrykk (figur 5). For ytterligere å undersøke GM-CSF protein lokalisering innen exosome-beriket EVs, GM-CSF nivåer ble kvantifisering i exosome-beriket ELBILER under ulike vaskeforhold av ELISA. Til dette formål ble vaskemiddelet Tween-20 (0,05%) først brukt til å permeabilisere de eksosomale membranene, og ELISA-analyser ble utført i bufferne med eller uten 0,05% Tween-20. Fordi Tween-20 er kjent for å redusere proteinproteininteraksjoner, ble bakgrunnen GM-CSF-nivåene som ble oppdaget i kontroll-EVene betydelig redusert av Tween-20 i vaskebufferen. I motsetning til dette ble GM-CSF-nivåene i ELBIL-ene til GM-CSF-uttrykkende celler betydelig økt med Tween-20. Disse resultatene viser at Tween-20-indusert eksosomal membranpermeabilisering gjør GM-CSF-molekyler inne i vesikler tilgjengelig for antistoffgjenkjenning, noe som gir bevis på at flertallet av eksosomale GM-CSF-molekyler er lokalisert inne i lumen av isolerte vesikler.
Figur 1: Eksogen GM-CSF er stabilt overekspressert i ES-D3-celler.
(A) Det skjematiske diagrammet for plasmidet for overekspresserende murine GM-CSF i ES-D3-celler, der en EF1α-promotor driver GM-CSF-uttrykk og hrGFP fungerer som uttrykksmarkør.
(B) Fluorescensintensiteten til GFP i GM-CSF-uttrykkende ES-D3-celler eller deres tomme vektorstyringsmotparter ble bestemt av FACS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: ES-D3-celler som overekspresserer GM-CSF produserer høye nivåer av GM-CSF.
GM-CSF-konsentrasjoner i mediet av de angitte cellene ble målt av ELISA. Dataene presenteres som gjennomsnittlige ± standardavvik (gjennomsnittlig ± SD) av tre uavhengige ELISA-målinger: **p < 0,001, NS = ikke signifikant, ANOVA med Tukeys multippel sammenligningstest. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: ES-D3-avledede ekstracellulære vesicles undersøkes ved transmisjonselektronmikroskopi.
Ekstracellulære vesikler ble fremstilt fra ES-D3-celler transfektert med plasmid som uttrykker GM-CSF eller den tomme vektormotparten. Piler angir individuelle vesikler. Skalastang = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksosomale markører er svært konsentrert i ekstracellulære vesikler isolert fra ES-D3-celler.
Mengdene markører for eksosomer, endoplasmisk retikulum (ER), mitokondrier og cytosol i de angitte hele celleekstraktene (WCE) og ELBILER ble evaluert av vestlig blotting. PDI = proteindisulfid isomerase. Molekylvektmarkører (kD) er til venstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Evaluering av GM-CSF-nivåer i eksosomberikede ekstracellulære vesikler.
Nivåene av GM-CSF i de angitte eksosomberikede ELBIL-ene ble bestemt under forskjellige ELISA-forhold. Exosome-beriket elbiler ble forbehandlet med eller uten 0,05% Tween-20. ELISA ble utført ved hjelp av vaskebuffer som inneholder enten PBS eller PBS + 0,05% Tween-20. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SD av tre uavhengige ELISA-analyser. *p < 0,05, **p < 0,005, ANOVA med Tukeys multisammenligningstest. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien viser en svært effektiv metode for å produsere eksosomberikede elbiler som bærer immunstimulatorisk protein GM-CSF, som kan brukes til å studere immunmodulatoriske effekter av exosome-beriket EVs. Flere studier tyder på at eksosomer viser immunregulerende og anti-tumor funksjoner22. Dermed kan eksosomer fra ESC som uttrykker GM-CSF også ha biologiske aktiviteter som regulerer immunresponsen. I denne protokollen ble eksogen murin GM-CSF stabilt overekspressert i murine ES-D3-celler ved transfeksjon (figur 1). Det er viktig at betydelige mengder GM-CSF ble påvist i eksosomberikede elbiler isolert fra ES-D3-celler som overekspresserte GM-CSF (figur 5).
Disse dataene antyder at nesten alle GM-CSF ligger i eksosomberikede elbiler. Som cytokin utskilles flertallet av GM-CSF-protein ekstracellulært11. Som annet eksosomalt lastmateriale (f.eks. mRNAer, miRNAer og proteiner), er GM-CSF-molekyler i cytosolen innkapslet i intraluminale vesikler (ILVer) av multivesicular kropper (MVB)6,23. Ved sammensmelting av MVB-er med plasmamembranen slippes GM-CSF-bærende ILVer ut i det ekstracellulære rommet.
Et viktig trinn i denne protokollen er å effektivt overekspressere GM-CSF i murine ES-D3-celler (figur 2). Tidligere forsøk på å nå dette målet ved retroviral infeksjon mislyktes i stor grad, sannsynligvis på grunn av undertrykkelse av retroviralt genuttrykk på transkripsjonsnivåene i ESCs24. Blant flere virale og cellulære promotører undersøkt, viste den menneskelige EF1α-promotoren den mest robuste aktiviteten i ES-D3-celler. Det er viktig at transgene uttrykk under EF1α-promotorens kontroll forble stabilt etter langvarig cellekultur av transfekterte ES-D3-celler. For å uttrykke eksogen GM-CSF i en annen celletype, er det nødvendig med ytterligere studier for å evaluere effektiviteten til ulike promotører. Anvendelsen av denne metoden for å isolere GM-CSF-bærende eksosomberikede elbiler kan utvides til andre stamcelletyper samt tumorceller konstruert for å uttrykke ulike cytokiner. I likhet med GM-CSF utskilles de fleste cytokiner ekstracellulært25. Derfor er en mulig begrensning av denne tilnærmingen at mengden av en gitt cytokin akkumulert i eksosomberikede elbiler er for lav til å vise sin biologiske aktivitet. For en bestemt cytokin må nye studier utføres for å optimalisere proteinnivået og biologisk aktivitet i eksosomberikede elbiler.
Det mest kritiske hinderet i denne studien er å generere ES-D3-kloner som overekspresserer GM-CSF. For å opprettholde pluripotential tilstand og fremme celleproliferasjon in vitro, murine ESCs er generelt dyrket i nærvær av materceller26. For å skaffe seg eksosomer utelukkende fra ESCs, ble det brukt en feeder-cellefri protokoll til kultur ESCs27. I denne studien ble ES-D3-celler dyrket i gelatinbelagte retter ved hjelp av medium supplert med LIF. Plateeffektiviteten og spredningen av enkeltkloner av ES-D3-celler under denne kulturtilstanden var ekstremt lav, noe som gjorde det svært utfordrende å generere ES-D3 kloner fra enkeltceller. Tilsetningen av det betingede mediet hentet fra foreldre ES-D3-celler klarte ikke å redde spredningsmangelen til belagte enkle ES-D3-celler. For å overvinne denne begrensningen ble enkle ES-D3-celler som overekspresserer GM-CSF belagt sammen med foreldres ES-D3-celler. Denne plating tilnærmingen forbedret levedyktigheten til GM-CSF-uttrykkende enkelt ES-D3 kloner, noe som letter klonisk spredning og ekspansjon. Når de er transfektert, er enkle ES-D3-kloner tilsynelatende festet til vevskulturplater. De spredte seg uavhengig av tilstedeværelsen av andre ES-D3-celler, da foreldre ES-D3-celler ble eliminert 48 timer etter å ha blitt belagt, slik at bare transfekterte enkle ES-D3-celler kunne vokse.
Totalt sett ble det utviklet en protokoll for å lykkes med å generere eksosomberikede elbiler som bærer GM-CSF fra ESC-er med potensial til å stimulere immunresponsen under forskjellige sykdomstilstander. Videre viser vår nylig publiserte studie at GM-CSF-bærende exosome-beriket EVer fra ESC kan tjene som en cellefri profylaktisk vaksine mot kreft28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kavitha Yaddanapudi, Chi Li og John W. Eaton sendte inn en amerikansk patentsøknad "Komposisjoner bestående av konstruerte embryonale stamcelleavledede eksosomer og bruksmetoder derav."
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Mr. Arkadiusz Slusarczyk og Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) for å skaffe overføringselektronmikroskopbilder. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 og CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) og Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G.
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
