Summary
El artículo actual describe un protocolo detallado para el ayuno intermitente isocalórico 2:1 para proteger y tratar contra la obesidad y el metabolismo de la glucosa deteriorado en ratones de tipo salvaje y ob/ob.
Abstract
El ayuno intermitente (IF), una intervención dietética que implica restricción de energía periódica, se ha considerado para proporcionar numerosos beneficios y contrarrestar las anomalías metabólicas. Hasta ahora, se han documentado diferentes tipos de modelos IF con diferentes duraciones de ayuno y períodos de alimentación. Sin embargo, interpretar los resultados es un reto, ya que muchos de estos modelos implican contribuciones multifactoriales de estrategias de restricción de tiempo y calorías. Por ejemplo, el modelo de ayuno de día alternativo, a menudo utilizado como un régimen IF roedor, puede resultar en la desnutrición, lo que sugiere que los beneficios para la salud de esta intervención probablemente están mediados a través de la restricción calórica y los ciclos de ayunación- realimentación. Recientemente, se ha demostrado con éxito que 2:1 IF, que comprende 1 día de ayuno seguido de 2 días de alimentación, puede proporcionar protección contra la obesidad inducida por la dieta y mejoras metabólicas sin una reducción en la ingesta calórica general. Aquí se presenta un protocolo de esta intervención isocalórica 2:1 IF en ratones. También se describe un protocolo de alimentación por pares (PF) necesario para examinar un modelo de ratón con comportamientos de alimentación alterados, como la hiperfagia. Usando el régimen 2:1 IF, se demuestra que el IF isocalórico conduce a un aumento de peso corporal reducido, homeostasis de glucosa mejorada y un gasto de energía elevado. Por lo tanto, este régimen puede ser útil para investigar los impactos en la salud de IF en diversas condiciones de la enfermedad.
Introduction
El estilo de vida moderno se asocia con un tiempo de ingesta de alimentos diario más largo y períodos de ayuno más cortos1. Esto contribuye a la actual epidemia mundial de obesidad, con desventajas metabólicas en los seres humanos. El ayuno se ha practicado a lo largo de la historia de la humanidad, y sus diversos beneficios para la salud incluyen una vida útil prolongada, daño oxidativo reducido y homeostasis energética optimizada2,3. Entre varias maneras de practicar el ayuno, la privación periódica de energía, llamada ayuno intermitente (IF), es un método dietético popular que es ampliamente practicado por la población general debido a su régimen fácil y simple. Estudios recientes en modelos preclínicos y clínicos han demostrado que IF puede proporcionar beneficios para la salud comparables al ayuno prolongado y la restricción calórica, lo que sugiere que IF puede ser una estrategia terapéutica potencial para la obesidad y las enfermedades metabólicas2,3,4,5.
Los regímenes IF varían en términos de duración y frecuencia del ayuno. El ayuno de día alterno (es decir, 1 día de alimentación/1 día de ayuno; 1:1 IF) ha sido el régimen IF más utilizado en roedores para estudiar sus impactos beneficiosos para la salud en la obesidad, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, etc.2,3. Sin embargo, como se ha demostrado en estudios anteriores6,7, y más mecanicidad confirmada en nuestro análisis de ingesta de energía8, 1:1 IF resulta en la subalimentación (80%) debido a la falta de tiempo de alimentación suficiente para compensar la pérdida de energía. Esto hace que no esté claro si los beneficios para la salud conferidos por 1:1 IF están mediados por restricción calórica o modificación de patrones de alimentación. Por lo tanto, se ha desarrollado un nuevo régimen IF que se muestra aquí, que comprende un patrón de alimentación de 2 días/1 día de ayuno (2:1 IF), que proporciona a los ratones tiempo suficiente para compensar la ingesta de alimentos (99%) y el peso corporal. Estos ratones se comparan con un grupo ad libitum (AL). Este régimen permite el examen de los efectos de la IF isocalórica en ausencia de reducción calórica en ratones de tipo salvaje.
Por el contrario, en un modelo de ratón que presenta un comportamiento de alimentación alterado, la alimentación AL puede no ser una condición de control adecuada para comparar y examinar los efectos de 2:1 IF. Por ejemplo, dado que los ratones ob/ob (un modelo genético comúnmente utilizado para la obesidad) presentan hiperfagia debido a la falta de leptina que regula el apetito y la saciedad, aquellos con 2:1 IF exhiben una ingesta calórica reducida del 20% en comparación con ratones ob/ob con alimentación AL. Por lo tanto, para examinar y comparar adecuadamente los efectos de IF en ratones ob/ob, es necesario emplear un grupo de alimentación de parejas como un control adecuado.
En general, se proporciona un protocolo integral para realizar isocalóricos 2:1 IF, incluido el uso de un control de alimentación por parejas. Se demuestra además que isocalórico 2:1 IF protege a los ratones de la obesidad inducida por la dieta alta en grasas y / o disfunción metabólica en ratones de tipo salvaje y ob/ob. Este protocolo se puede utilizar para examinar los impactos beneficiosos para la salud de 2:1 IF en diversas condiciones patológicas, incluyendo trastornos neurológicos, enfermedades cardiovasculares, y el cáncer.
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Protocol
Todos los métodos y protocolos aquí han sido aprobados por los Comités de Cuidado de Animales en El Servicio de Cuidado de Animales y Veterinaria (ACVS) de la Universidad de Ottawa y el Centro de Fenogenómica (TCP) y se ajustan a las normas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Cabe señalar que todos los procedimientos descritos aquí deben ser realizados bajo aprobación institucional y gubernamental, así como por personal que sea técnicamente competente. Todos los ratones estaban alojados en jaulas ventiladas estándar en habitaciones controladas por temperatura y humedad con ciclos de luz/oscuridad de 12 h/12 h (21–22 oC, 30%-60% de humedad para el alojamiento normal) y acceso libre al agua. Los machos C57BL/6J y los ratones ob/ob fueron obtenidos del Laboratorio Jackson.
1. 2:1 Régimen ISocalórico IF
- Para modelos de ratón de obesidad magros e inducidos por la dieta, preparar una dieta normal (17% grasa, ND) o dieta alta en grasas (45% grasa, HFD).
NOTA: 60% HFD se puede utilizar para inducir obesidad grave inducida por la dieta; sin embargo, debido a la suavidad del pellet de alimentos, es relativamente difícil medir con precisión la ingesta diaria de alimentos. Un sistema automatizado de medición continua puede mejorar la versatilidad para múltiples tipos de dietas. - Mida el peso corporal basal y la composición corporal de cada ratón a las 7 semanas de edad utilizando una báscula y EchoMRI, respectivamente.
NOTA: Consulte la sección 3 para la medición de la composición corporal. - Basado en el peso corporal y los resultados de la composición corporal, al azar e igualmente dividir 7 semanas de edad macho C57BL/6J ratones en dos grupos: ad libitum (AL) y ayuno intermitente (IF) grupos.
- Coloque de dos a tres ratones por jaula y garantice el libre acceso al agua potable.
NOTA: El número de ratones por jaula puede afectar el comportamiento de la ingesta de alimentos. Se recomienda mantener un número igual de ratones por jaula en todos los grupos durante el estudio. - Proporcionar 1 semana de aclimatación al nuevo ambiente de jaula y dieta antes de comenzar el régimen IF.
- Período de ayuno: mueva a los ratones a una jaula limpia con ropa de cama fresca a las 12:00 PM. No agregue alimentos para el grupo IF, mientras que proporciona una cantidad pesada de alimentos al grupo AL.
NOTA: Para cada ciclo de ayuno, es importante cambiar las jaulas para los grupos AL y IF para asegurarse de que ambos grupos están expuestos a la misma cantidad de tiempo de manipulación. - Después de 24 h, mida el peso de los ratones en ambos grupos y los alimentos sobranteen en jaulas de AL.
NOTA: Asegúrese de incluir el peso de las migas de alimentos en la tolva de alimentos y en la parte inferior de la jaula, especialmente cuando utilice HFD, ya que los ratones a menudo eliminan pequeños pellets o fragmentos de alimentos de la tolva y los mantienen cerca de los sitios de nidos. La ingesta media de energía por ratón al final de cada ciclo 2:1 (3 días) es de alrededor de 35 kcal, equivalente a 10 g para una dieta normal (3,3 kcal/g) y 7 g para HFD (4,73 kcal/g). - Período de alimentación: proporcione una cantidad pesada de alimentos a las 12:00 PM para los grupos AL y IF.
- Después de 48 h de proporcionar los alimentos, medir el peso de los alimentos sobrantes y ratones.
- Repita los pasos 1.6–1.10 mientras dure el estudio (porejemplo, 16 semanas).
2. Grupo de control de alimentación por pares (PF)
NOTA: Para un experimento IF en el que se observa un comportamiento alterado de alimentación en un modelo de ratón (por ejemplo, hiperfagia en ratones ob/ob), es necesario tener un grupo de alimentación de parejas como control para una comparación adecuada de calorías independientes de IF.
- Para el grupo de control PF, escalonar la programación del experimento de modo que la misma cantidad de alimentos consumidos por el grupo IF se ofrezca al grupo PF(Figura 2).
- Mida la cantidad de alimentos consumidos por el grupo IF durante 2 días de período de realimentación.
- Divida esta cantidad de alimentos consumidos en el grupo IF uniformemente en tres proporciones y proporciónela diariamente al grupo PF a las 12:00 PM.
NOTA: Proporcionar una cantidad igual de alimentos diariamente es fundamental. En el caso de ratones con hiperfagia, si los ratones alimentados por parejas reciben una cantidad de alimentos inferior a su consumo voluntario a la vez, es probable que consuman todos los alimentos proporcionados y se ayunan eficazmente. Esto puede eimpedir la comparación adecuada con ratones tratados con IF y confundir el resultado. - Repita los pasos 2.1–2.3 mientras dure el estudio.
3. Análisis de composición corporal
NOTA: Dado que la IF a largo plazo afecta el peso corporal en ratones, la composición corporal se puede medir en ciclos apropiados (por ejemplo, cada 3 o 4 ciclos) utilizando un analizador de composición corporal para cuantificar la grasa y la masa magra en ratones vivos no anestesiados.
- Encienda el analizador de composición corporal.
NOTA: Antes de iniciar el programa, deje la máquina encendida durante al menos 2-3 h para calentarla. - Ejecute una prueba del sistema en el analizador de composición corporal para probar su precisión de medición. Si es necesario, calibrar el sistema utilizando muestras de aceite de canola y agua.
- Mida el peso corporal de cada ratón.
- Coloque el ratón en un pequeño soporte cilíndrico animal.
- Inserte un delimitador para restringir el movimiento físico del ratón durante la medición y coloque el soporte en el analizador de composición corporal.
- Ejecute el programa de escaneo.
NOTA: Se tarda aproximadamente 90-120 s para analizar. - Después de la medición, retire el soporte del equipo y lleve el ratón de vuelta a la jaula.
NOTA: Un protocolo más detallado se puede encontrar en una publicación anterior9.
4. Pruebas de tolerancia a la glucosa y a la insulina
- Para la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT), mida el peso corporal y la composición corporal de cada ratón antes de someterlo al ayuno y marque la cola con un marcador permanente para una indexación fácil y rápida.
- Coloque ratones en jaulas nuevas sin comida a las 7:00 PM para ayunar durante la noche.
NOTA: El ayuno nocturno es el protocolo estándar, sin embargo, debido a la fisiología del ratón (por ejemplo, aumento de la utilización de glucosa después de un ayuno prolongado10,11), ayuno más corto (6 h) se puede utilizar como se describe para ITT. - Después de ayunar 14–16 h (9:00 AM en la mañana siguiente), medir el peso corporal y la composición corporal de cada ratón y calcular la cantidad de dosis de glucosa en función del peso corporal.
NOTA: Para evitar la sobreestimación de la intolerancia a la glucosa en ratones obesos, la masa magra obtenida del análisis de la composición corporal se puede utilizar para calcular la dosis de glucosa12,13. - Para cada ratón, corte la punta de la cola (0,5-1,0 mm) con tijeras quirúrgicas limpias. Después de limpiar la primera gota de sangre, extraiga una gota nueva de sangre de la cola y mida el nivel basal de glucosa en sangre en ayunas con el glucómetro.
NOTA: No se requiere corte adicional de cola para cada medición de glucosa en sangre durante GTT o ITT. La herida se puede refrescar abofeteándola con gasa para extraer una gota de sangre. - Sujeto a ratones a una inyección intraperitoneal (i.p.) de glucosa (1 mg/g de peso corporal).
NOTA: Sobre la base del objetivo de un experimento (porejemplo, examinar los efectos de la incretina), la administración oral de glucosa se puede realizar por vía oral. El protocolo para GTT oral (OGTT) se puede encontrar en otro estudio14. - Mida la glucosa en sangre de la cola a 0, 5, 15, 30, 60 y 120 min después de la inyección de glucosa.
- Después de terminar el GTT, proporcione una cantidad suficiente de alimentos.
- Para la prueba de tolerancia a la insulina (ITT), retire los alimentos a las 9:00 AM.
NOTA: Dado que tanto GTT como ITT son experiencias que inducen el estrés para ratones que pueden elevar los niveles de glucosa en sangre y cambiar la fisiología, se recomienda realizar ITT después de proporcionar al menos 2-3 días de recuperación después del experimento GTT. - Después del ayuno durante 6 h (3:00 PM), mida la glucosa en sangre basal de la cola como se describe en el paso 4.4.
- Sujeto a ratones a inyección i.p. de insulina (0,65 mU/g de peso corporal).
- Mida la glucosa en sangre de la cola a 0, 15, 30, 60, 90 y 120 min después de la inyección de insulina.
- Después de terminar ITT, proporcione una cantidad suficiente de alimentos.
5. Calorimetría indirecta
NOTA: El metabolismo energético de los ratones tratados con IF se puede evaluar más a través de la calorimetría indirecta durante un solo ciclo de IF. Esto medirá el consumo de oxígeno (VO2),la producción de dióxido de carbono (VCO2),la relación de intercambio respiratorio (RER) y el calor (kcal/h).
- Encienda la potencia del sistema de calorímetro indirecto al menos 2 horas antes de ejecutar el experimento.
NOTA: Este calentamiento del sistema es importante para una medición precisa. - Prepare jaulas con ropa de cama limpia, llene las botellas de agua y agregue la cantidad prepesada de coma a las tolvas de alimentos.
- Compruebe el estado de la drierita y el refresco de lima. Si aparece un indicador de color de la secadora de color rosa, lo que indica que la rieria ha absorbido una gran cantidad de humedad, es necesario reemplazar o tapar con la secadora fresca.
- Calibrar el sistema utilizando un gas con la composición específica (0,5% CO2, 20,5% O2).
- Mida el peso corporal y la composición corporal de cada ratón, que se utilizará para normalizar los datos de VO2 y VCO2.
- Coloque suavemente un ratón por jaula.
- Montar jaulas metabólicas, colocarlas en la cámara de ambiente controlada por temperatura, y conectar a las líneas de gas y el cable del sensor de actividad.
- Después de configurar el perfil del experimento agregando los parámetros experimentales adecuados utilizando el software, ejecute el programa para la medición. El propósito de la medición del primer día es proporcionar un período de aclimatación y medir el metabolismo energético basal.
- A las 12:00 PM del día siguiente, someta a los ratones a 24 h de ayuno retirando alimentos y migas de la tolva y el fondo de la jaula. Si es necesario, sustituya por ropa de cama limpia.
- Después de 24 h, agregue la cantidad prepesada de chow a la tolva de alimentos durante el período de realimentación.
- Continúe midiendo durante las siguientes 48 h. Compruebe regularmente si el sistema se está ejecutando sin interrupción de hardware o software.
- Después de completar la medición, termine el programa y traiga ratones de vuelta a sus jaulas originales. Mida la cantidad de alimentos sobrantes para examinar la ingesta de alimentos.
- El protocolo detallado para la calorimetría indirecta se puede encontrar en un estudio anterior9.
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Representative Results
La Figura 1 muestra los análisis de alimentación después del ayuno de 24 h y la comparación entre el ayuno intermitente 1:1 y 2:1. Un período de ayuno de 24 h dio lugar a una reducción del peso corporal del 10 %, que se recuperó por completo después de 2 días de realimentación(Figura 1A). Un período de ayuno de 24 h indujo hiperfagia durante los 2 días posteriores de realimentación(Figura 1B). Sin embargo, la comparación de la ingesta de energía entre el ayuno del día alternativo 1:1 y el ayuno intermitente 2:1 reveló que el 1 día del período de realimentación en 1:1 IF no era suficiente (80%) para compensar la pérdida calórica por ayuno, en comparación con la condición AL(Figura 1C). Por otro lado, el 99% de la ingesta de energía fue totalmente compensada durante 2 días de realimentación en 2:1 IF. Este régimen permite el examen de los efectos de la IF isocalórica que son independientes de la diferencia de ingesta calórica.
La Figura 2 ilustra una línea de tiempo esquemática para los regímenes isocalócales 2:1 IF y PF. Para minimizar las diferencias en la ingesta calórica, una observación realizada en el día alterno de ayuno6,7, este protocolo estableció un nuevo régimen IF que comprende de alimentación de 2 días y períodos de ayuno de 1 día (2:1 IF)8, que permitió el examen de los efectos para la salud de la IF isocalórica en ratones de tipo salvaje. Sin embargo, en ratones ob/ob, que mostraban un comportamiento hiperfágico, los ratones ob/ob tratados con IF 2:1 mostraron una reducción de la ingesta calórica del 21%, en comparación con los ratones ob/ob AL15. Puesto que esto evita una comparación correcta tocórica-independiente, se utilizó un grupo de control de PF que mantuvo la misma ingesta calórica que los ratones ob/ob tratados con IF. Brevemente, la cantidad total de alimentos consumidos durante 2 días de alimentación en ratones 2:1 SI se dividió por igual en tres cantidades diarias, luego se proporcionó al grupo PF.
Para obtener una visión general completa de los resultados metabólicos de 2:1 IF, comparamos los efectos de AL, IF y PF en el peso corporal, la ingesta de alimentos y la composición corporal en ratones de tipo salvaje y ob/ob bajo dieta normal (ND) y HFD. En comparación con AL, el tratamiento IF condujo a un menor aumento del peso corporal en ratones WT alimentados con DP y alimentados con HFD sin diferencias significativas en la ingesta de alimentos(Figura 3A,B). El análisis de la composición corporal reveló que IF redujo específicamente la masa grasa sin cambios en la masa magra en ratones de tipo salvaje(Figura 3C). Es posible que una ingesta de energía acumulada ligeramente, aunque no significativamente, durante 16 semanas del programa IF podría resultar en un aumento de peso corporal leve de los animales IF. Sin embargo, experimento IF con el régimen de alimentación de pareja confirmó que la disminución del aumento de peso corporal por IF no se debió a la ingesta de energía alterada(Figura 3D,E). A diferencia de los animales de tipo salvaje, el peso corporal de los ratones ob/ob sometidos a IF (Ob-IF) fue menor que el de los ratones Ob-AL(Figura 3G). Esto se debe a la hiperfagia (comer en exceso) de ratones ob/ob, lo que conduce a un nivel ligeramente más alto (21%) ingesta de alimentos en ratones AL, en comparación con los animales tratados con IF(Figura 3H). Por lo tanto, para examinar específicamente el efecto metabólico de IF de una manera independiente del calor, se empleó un grupo de control de alimentación de parejas. Sin embargo, a diferencia de los ratones de tipo salvaje8, los ratones Ob-PF eran indistinguibles en comparación con los ratones Ob-IF en pesos corporales y composición corporal15 (Figura 3I). Estos resultados sugieren que la leptina probablemente está implicada en la reducción de peso corporal mediada por IF isocalórica en ratones.
El principal beneficio metabólico conferido por IF isocalórico es la homeostasis de glucosa mejorada. Como se muestra en la Figura 4A, B, C,D, ratones HFD-IF exhibió una mejora significativa en la homeostasis de glucosa. GTT demostró que la glucosa en sangre se elimina más rápidamente en ratones tratados con IF, mientras que ITT reveló una mayor sensibilidad a la insulina en ratones HFD-IF, en comparación con ratones HFD-AL o HFD-PF. Inesperadamente, a pesar de los fallos en la reducción de peso mediada por IF, los animales Ob-IF mostraron un manejo significativamente mejor de la glucosa con excursiones de glucosa más pequeñas en GTT, en comparación con los ratones Ob-PF(Figura 4E),mientras que la sensibilidad a la insulina era indistinguible entre los ratones Ob-IF y Ob-PF(Figura 4F). Esta homeostasis de glucosa mejorada en ratones Ob-IF probablemente está mediada por aumentos en el nivel plasmático de péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) y secreción de insulina estimulada por glucosa (datos no mostrados)15. En general, mediante el uso de este protocolo 2:1 IF y el control adecuado de PF independiente del calor, mostramos los beneficios metabólicos de LA IF isocalórica en ratones de tipo salvaje y ob/ob.
Uno de los efectos metabólicos de IF en ratones de tipo salvaje es el mayor consumo total de O2, utilizado para estimar el gasto de energía (Figura 5A,B). Esta elevación en el consumo de O2 se encontró sólo durante el período de alimentación en ratones IF, pero no período de ayuno, en comparación con los ratones AL. El aumento del gasto energético fue mediado en gran medida por la termogénesis adiposa, como el pardo de los tejidos adiposos blancos y la activación del tejido adiposo marrón (datos no mostrados)8,16. La termogénesis adiposa mediada por IF presumiblemente explicaría cómo los ratones de tipo salvaje sometidos a IF mostraron el aumento de peso corporal reducido sin diferencia en la ingesta de alimentos, en comparación con los ratones AL. Por otro lado, SI no pudo aumentar el consumo de O2 en ratones ob/ob (Figura 5C-D),e incluso condujo a una reducción del gasto de energía durante el período de ayuno. Consistentemente, la termogénesis adiposa inducida por IF fue completamente abolida en ratones ob/ob (datos no mostrados). Estos datos sugieren una posible limitación de IF, ya que puede funcionar de manera diferente para individuos con diferentes orígenes genéticos y ambientales.
Figura 1: Análisis de alimentación después de 24 h de ayuno y comparación entre 1:1 y 2:1 IF. (A) Cambios diarios del peso corporal de los ratones antes y después del ayuno de 24 h (n x 10). (B) Ingesta diaria de energía antes y después de 24 h de ayuno (n a 5 jaulas; 2 ratones por jaula). (C) Comparación de la ingesta de energía entre el ayuno de día alterno (esdecir, 1 día de alimentación/1 día de ayuno, 1:1 IF) y 2:1 de ayuno intermitente (es decir, alimentación de 2 días/1 día de ayuno). En el régimen de 1:1 IF, sólo el 80 % de la ingesta de alimentos fue compensada durante el 1 día posterior de realimentación en comparación con la ingesta de alimentos durante 2 días de alimentación. Por otro lado, el 99% de la ingesta de energía se logró cuando se dieron 2 días de realimentación, en comparación con la que se produjo durante 3 días de alimentación. Los datos se expresan como medias: SEM. Esta figura fue reproducida con el permiso de Kim et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración esquemática del régimen isocalórico 2:1 IF. Para el control de la PF, la cantidad de alimentos consumidos durante los 2 días de alimentación por ratones tratados con IF se divide en tres porciones iguales, que luego se proporcionan diariamente a los ratones PF durante el siguiente ciclo. AL - ad libitum; PF : alimentación por pares. Parte de esta figura fue reproducida con el permiso de Kim et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de los efectos de AL, IF y PF sobre el peso corporal, la ingesta de alimentos y la composición corporal entre ratones de tipo salvaje y ob/ob. (A,B,C) Peso corporal, ingesta de alimentos y composición corporal en ratones de tipo salvaje tratados con AL o IF bajo dieta normal (ND) o dieta alta en grasas (HFD) durante 16 semanas de régimen IF. Los datos se expresan como medias -SEM. (ND-AL: n a 7; ND-IF: n a 8; HFD-AL: n a 7; y HFD-IF: n x 8); ANOVA unidireccional o bidireccional con análisis post-hoc Student-Newman-Keuls; **p < 0.01 vs. HFD-AL. (D,E,F) Peso corporal, ingesta de alimentos, y composición corporal en PF vs. IF ratones alimentados con dieta alta en grasas (HFD) durante 12 semanas de régimen IF. (PF: n a 6 y IF: n a 6); prueba t -prueba deestudiante sin emparejar de dos colas; *p < 0.05 vs. HFD-PF; NS no es significativo. (G,H,I) Peso corporal, ingesta de alimentos y composición corporal en ratones ob/ob tratados con IF alimentados con comida normal (Ob-AL: n x 4; Ob-PF: n a 7; OB-IF: n a 6); Ob-AL vs. Ob-PF: *p < 0.05; Ob-AL vs. OB-IF: *p < 0.05; Ob-PF vs. OB-IF. Los paneles A–F fueron reproducidos con el permiso de Kim et al.8. Los paneles G–I fueron reproducidos con el permiso de Kim et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Homeostasis de glucosa mejorada por IF en ratones de tipo salvaje y ob/ob. (A,B) GTT intraperitoneal e ITT en ratones de tipo silvestre HFD-AL y HFD-IF después de 16 semanas de régimen IF. El recuadro muestra el área bajo la curva (AUC); *p < 0,05 frente a HFD-AL. (C,D) GTT e ITT en HFD-PF en comparación con ratones de tipo silvestre HFD-IF después de 12 semanas de régimen IF. El recuadro muestra AUC; *p < 0.05 frente a HFD-PF. (E,F) GTT e ITT en Ob-IF en comparación con los ratones Ob-PF después de 16 semanas de régimen IF. El recuadro muestra AUC (*p < 0.05 vs. Ob-PF). Los paneles A–D fueron reproducidos con el permiso de Kim et al.8. Los paneles E y F fueron reproducidos con permiso de Kim et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis del gasto energético en ratones de tipo salvaje y ob/ob tratados con IF. (A) Rastros de consumo de O2 durante un ciclo de 2:1 IF en ratones de tipo salvaje (esdecir, 1 día de ayuno seguido de 2 días de alimentación). (B) Promedio de O2 consumo por hora durante el ayuno, la alimentación y un ciclo de 2:1 IF. Los datos se expresan como medias : SEM (HFD-AL: n - 6; y HFD-IF: n a 12); *p < 0.05 vs. HFD-AL. (C) O2 trazas de consumo de ratones ob/ob durante un ciclo de 2:1 IF. (D) Promedio de O2 consumo por hora durante el ayuno, la alimentación y un ciclo de 2:1 IF (Ob-PF: n a 7; OB-IF: n a 6); *p < 0.05 vs. Ob-PF. Panel B fue reproducido con permiso de Kim et al.8. Los paneles C y D fueron reproducidos con permiso de Kim et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Ha sido bien documentado que IF proporciona efectos beneficiosos para la salud de diversas enfermedades tanto en humanos como en animales8,15,16,17,18,19. Sus mecanismos subyacentes, como la autofagia y el microbioma intestinal, han sido recientemente aclarados. El protocolo presentado describe un régimen isocalórico 2:1 IF en ratones para investigar los beneficios metabólicos independientes de calorías de IF contra la obesidad inducida por la dieta y la disfunción metabólica asociada. A diferencia del protocolo de ayuno de día alterno (1:1 IF) que resulta en una reducción en la ingesta calórica general6,7, proporcionando 1 día más de realimentación en el régimen 2:1 IF permite el mantenimiento de una condición isocalórica en ratones de tipo salvaje.
Además, en comparación con 1:1 IF, el régimen 2:1 IF puede reducir el posible estrés mediado por ayuno o torpor en ratones20 y también es comparable a un método dietético popular, la dieta 5:22. Aunque sus efectos no han sido probados, el régimen puede ser modificado proporcionando días adicionales de realimentación (por ejemplo, 3:1 o 4:1 IF). Además, este protocolo presentado se puede ajustar fácilmente a una escala horaria llamada alimentación por tiempo restringido (TRF), en la que el acceso a los alimentos está limitado a 8 h por día durante la fase activa21,que se sabe que logra un régimen de dieta isocalórica y proporciona beneficios metabólicos contra la obesidad inducida por La HFD y la diabetes19,21,22.
Como se muestra en el análisis de alimentación(Figura 1B), el comportamiento hiperfágico inmediatamente después de 24 h de ayuno disminuye gradualmente en ratones de tipo salvaje, lo que permite IF isocalórico. Sin embargo, esta condición isocalórica no se puede lograr en ratones ob/ob, ya que carecen de saciedad mediada por la leptina y el metabolismo energético, lo que conduce a un fenotipo hiperfágico continuo23,24. Por lo tanto, antes de realizar un experimento IF, se recomienda examinar el comportamiento de alimentación del modelo de ratón de interés. Para examinar los efectos de IF utilizando un modelo de ratón hiperfálgico (por ejemplo, ob/ob, db/db, Sim1+/-, MC4R-/-)24,25,26, como se describe en este protocolo, el empleo de un grupo de alimentación de parejas como un control experimental isocalórico es importante para hacer comparaciones adecuadas. También requiere una planificación cuidadosa al probar un modelo de ratón con un fenotipo hipofágico (por ejemplo, ratones KO de la hormona que contiene melanina)27.
Un factor importante a tener en cuenta para los estudios IF es la temperatura de la vivienda, que afecta a varios parámetros fisiológicos y conductuales en ratones. En particular, la exposición al frío (4-6 oC) aumenta significativamente la ingesta de energía para mantener la temperatura corporal del núcleo28. Por el contrario, en condiciones termoneutrales (30 oC) bajo las cuales la ganancia de calor se equilibra por la pérdida de calor, las reducciones en el consumo de alimentos se reducen notablemente8. Con respecto a los resultados metabólicos, la exposición al frío induce la termogénesis adiposa, que se ve obstaculizada por una condición termoneutral. Por lo tanto, se espera que la temperatura de la vivienda influya en los fenotipos metabólicos de IF y la relación adecuada de alimentación: ayuno para lograr IF isocalórico.
De hecho, se ha demostrado previamente que el isocalórico 2:1 IF se puede lograr en condiciones termoneutrales, lo que conduce a una mejor salud metabólica en la obesidad inducida por la dieta y la disfunción metabólica sin diferencias en la ingesta de alimentos entre los grupos DE y AL8. Sin embargo, es posible que el IF isocalórico no se pueda lograr con una relación de 2:1 a temperaturas frías, ya que los ratones expuestos al frío mostrarán un fenotipo hiperfálgico, que conduce a la subalimentación en el grupo IF. Dado que la exposición al frío y IF muestran resultados y mecanismos metabólicos comparables (es decir, termogénesis adiposa y homeostasis de glucosa mejorada) que ayudan a combatir la obesidad, hay interés en combinar estas dos intervenciones para maximizar el impacto metabólico. Por lo tanto, para probar correctamente esto, se recomienda realizar el análisis de alimentación antes de ejecutar un experimento IF y utilizar un grupo de control de alimentación de parejas bajo exposición al frío.
Otros factores que pueden afectar potencialmente los resultados de los estudios IF incluyen la densidad de la vivienda. Al igual que en el estudio anterior, que mostró un menor consumo de alimentos en ratones más densamente alojados29,ratones de una jaula de cinco consumió significativamente menos alimentos que los de una jaula de dos (resultados inéditos). Además, se ha demostrado que la densidad de la vivienda afecta significativamente a la temperatura ambiente, ya que la temperatura dentro de una jaula que alberga cinco ratones es 1-2 oC más alta que las que alojan uno o dos ratones30. Aunque este estudio concluyó que la densidad de la vivienda no afectó significativamente la ingesta de alimentos (examinado durante 5 semanas), en un estudio de IF que duró de 12 a 16 semanas, la temperatura dentro de la jaula afectada por la densidad de la vivienda todavía puede influir en la ingesta de alimentos y el metabolismo energético. Juntos, es importante mantener el mismo número de ratones alojados en una jaula y minimizar el cambio del número por jaula en el transcurso de un estudio.
En resumen, este informe muestra un protocolo simple y reproducible para probar isocalórico 2:1 IF en ratones. Aunque el estudio actual se centra en los beneficios metabólicos de IF en la obesidad inducida por la dieta y la disfunción metabólica, se puede adaptar fácilmente para investigar los efectos protectores y terapéuticos de la IF isocalórica contra otras condiciones, como la y enfermedades neurológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
K.-H.K contó con el apoyo de la Beca en Ayuda de la Fundación Corazón y Accidente Cerebrovascular de Canadá (G-18-0022213), la Fundación J. P. Bickell y el fondo de puesta en marcha de la Universidad de Ottawa Heart Institute; H.-K.S. fue apoyado por subvenciones de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (PJT-162083), Reuben y Helene Dennis Scholar y Sun Life Financial New Investigator Award for Diabetes Research de Banting & Best Diabetes Centre (BBDC) y Natural Sciences Y el Consejo de Investigación de Ingeniería (NSERC) de Canadá (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. fue apoyado por una beca de la Universidad de Ottawa Cardiology Research Endowment Fund. J.H.L. fue apoyado por la Beca de Doctorado NSERC y la Beca de Posgrado de Ontario. Y.O. fue apoyado por UOHI Endowed Graduate Award y La Beca de Posgrado Reina Isabel II en Ciencia y Tecnología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
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