Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכה של ההשפעות המטבולית של Isocaloric 2:1 לסירוגין צום בעכברים

Published: November 27, 2019 doi: 10.3791/60174
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 3,4,5, 1,2
1University of Ottawa Heart Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט עבור isocaloric 2:1 הצום לסירוגין להגן ולטפל נגד השמנת יתר ומטבוליזם הגלוקוז לקוי בסוג פראי ו ob/ob עכברים.

Abstract

צום לסירוגין (IF), התערבות תזונתיים מעורבים הגבלת אנרגיה תקופתית, נחשב לספק יתרונות רבים ולנטרל חריגות מטבולית. עד כה, סוגים שונים של מודלים IF עם משכים שונים של תקופות צום והאכלה תועדו. עם זאת, פענוח התוצאות הוא מאתגר, כפי שרבים מדגמים אלה כוללים תרומות רב עצרת מתוך אסטרטגיות הגבלת זמן וקלוריות. לדוגמה, מודל הצום החלופי של היום, המשמש לעתים קרובות כמשטר IF מכרסם, יכול לגרום האכלה, מציע כי היתרונות הבריאותיים מהתערבות זו צפויים לתווך דרך שתי הגבלת הקלוריות ומחזורי האכלה מחדש הצום. לאחרונה, זה כבר הראה בהצלחה כי 2:1 IF, המורכב 1 יום של צום ואחריו 2 ימים של האכלה, יכול לספק הגנה מפני השמנת יתר דיאטה ושיפורים מטבוליים ללא הפחתה של צריכת הקלוריות הכוללת. מוצג כאן הוא פרוטוקול של isocaloric 2:1 אם התערבות בעכברים. המתואר גם הוא פרוטוקול של האכלה זוגית (PF) הנדרש כדי לבדוק מודל העכבר עם התנהגויות אכילה שונה, כגון hyperphagia. באמצעות 2:1 IF משטר, זה הוכיח כי isocaloric אם מובילה לעלייה במשקל הגוף מופחת, שיפור הומאוסטזיס גלוקוז, והוצאות אנרגיה מוגבר. לפיכך, משטר זה עשוי להיות שימושי כדי לחקור את ההשפעות הבריאותיות של IF בתנאי מחלה שונים.

Introduction

אורח החיים המודרני קשור לזמן צריכת מזון יומיומי ארוך יותר ותקופות צום קצר יותר1. זה תורם מגיפת ההשמנה הגלובלית הנוכחית, עם חסרונות מטבולית לראות בני אדם. צום התאמן במהלך ההיסטוריה האנושית, ואת היתרונות הבריאותיים המגוונים שלה כוללים תוחלת חיים ממושכת, נזק חמצוני מופחת, ו אופטימיזציה הומאוסטזיס אנרגיה2,3. בין מספר דרכים לתרגל צום, מניעת אנרגיה תקופתית, כינה צום לסירוגין (IF), היא שיטה תזונתיים פופולרית הנהוגה באופן נרחב על ידי האוכלוסייה הכללית בשל משטר קל ופשוט שלה. מחקרים שנעשו לאחרונה במודלים פרה-קליניים וקליניים הוכיחו כי אם ניתן לספק יתרונות בריאותיים הדומים להגבלה ממושכת של צום וקלוריק, מציע שאם יכולה להיות אסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית להשמנת יתר ומחלות מטבוליות2,3,4,5.

אם משטרי משתנה במונחים של משך צום ותדירות. יום חלופי צום (כלומר, 1 יום האכלה/1 יום צום; 1:1 IF) כבר בשימוש הנפוץ ביותר אם משטר מכרסמים לחקור את ההשפעות הבריאותיות המועילה שלה על השמנת יתר, מחלות לב וכלי דם, מחלות ניווניות, וכו '2,3. עם זאת, כפי שמוצג במחקרים קודמים6,7, ועוד מכונאי אישר בניתוח צריכת האנרגיה שלנו8, 1:1 אם תוצאות האכלה (~ 80%) בשל חוסר זמן האכלה מספיק כדי לפצות על אובדן אנרגיה. זה הופך את זה לא ברור אם היתרונות הבריאותיים שהוענקו על ידי 1:1 אם הם מתווכת על ידי הגבלת קלוריות או שינוי של דפוסי אכילה. לכן, משטר IF חדש פותחה ומוצגת כאן, הכוללת של 2 יום האכלה/1 יום צום (2:1 IF) דפוס, אשר מספק עכברים עם זמן מספיק כדי לפצות על צריכת המזון (~ 99%) ומשקל הגוף. עכברים אלה מושווים לקבוצת ad libitum (אל). משטר זה מאפשר בדיקת ההשפעות של isocaloric אם בהעדר הפחתת קלוריות בעכברים מסוג פראי.

לעומת זאת, במודל העכבר שמוצגים התנהגות האכלה, האכלה אל לא יכול להיות מצב שליטה מתאים כדי להשוות ולבחון את ההשפעות של 2:1 IF. לדוגמה, מאז ob/ob עכברים (מודל גנטי נפוץ עבור השמנת יתר) התערוכה hyperphagia בשל חוסר לפטין הוויסות התיאבון והשובע, אלה עם 2:1 IF מוצג ~ 20% צריכת הקלוריות מופחתת בהשוואה ob/ob עכברים עם האכלה אל. כך, כדי לבחון ולהשוות את ההשפעות של IF ב ob/ob עכברים, קבוצה האכלה זוג כפקד מתאים צריך להיות מועסק.

בסך הכל, פרוטוקול מקיף מסופק לבצע isocaloric 2:1 IF, כולל שימוש בבקרת האכלה זוג. זה הוכיח עוד כי isocaloric 2:1 אם מגן על עכברים מפני השמנה גבוהה תזונה שומן המושרה ו/או תפקוד מטבולית בשני פראי סוג ו ob/ob עכברים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעות הבריאותיות המומלצות של 2:1 אם בתנאים פתולוגיים שונים, כולל הפרעות נוירולוגיות, מחלות לב וכלי דם וסרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות והפרוטוקולים כאן אושרו על ידי ועדות טיפול בעלי חיים ב טיפול בעלי חיים וטרינרי שירות (ACVS) של אוניברסיטת אוטווה והמרכז לפנוגנומיקה (TCP) ולהתאים את הסטנדרטים של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. יש לציין כי כל ההליכים המתוארים כאן צריכים להתבצע תחת אישור מוסדי וממשלתי, כמו גם על ידי צוות הבקי באופן טכני. כל העכברים שוכנו בכלובים הסטנדרטיים של פרקו בחדרים עם שליטת טמפרטורה ולחות עם 12 h/12 h מחזורי אור/כהים (21-22 ° c, 30% – 60% לחות לדיור רגיל) וגישה חופשית למים. C57BL זכר/6J ו ob/ob עכברים התקבלו מהמעבדה ג'קסון.

1.2:1 משטר אם

  1. עבור רזה ודיאטה המושרה מודלים עכבר השמנת יתר, להכין תזונה נורמלית (17% שומן, ND) או דיאטה שומן גבוה (45% שומן, HFD).
    הערה: 60% hfd ניתן להשתמש כדי לגרום להשמנה חמורה הנגרמת דיאטה; עם זאת, בשל הרכות של הגלולה המזון, קשה יחסית למדוד את צריכת המזון היומית באופן מדויק. מערכת מדידה רציפה אוטומטית יכולה לשפר את הרב-תכליתיות עבור סוגים מרובים של דיאטות.
  2. מדידת משקל הגוף הבסיסי ואת הרכב הגוף של כל עכבר ב 7 שבועות של גיל באמצעות סולם ו אכעמרי, בהתאמה.
    הערה: עיין בסעיף 3 למדידת הרכב הגוף.
  3. בהתבסס על משקל הגוף ואת תוצאות הרכב הגוף, באופן אקראי ובאותה מידה לחלק 7 שבוע בן זכר C57BL/6J עכברים לשתי קבוצות: ad libitum (אל) ולסירוגין הצום (IF) קבוצות.
  4. מניחים שניים עד שלושה עכברים לכל כלוב ומבטיחים גישה חופשית למים לשתייה.
    הערה: מספר העכברים לכל כלוב יכול להשפיע על התנהגות צריכת המזון. מומלץ לשמור על מספר שווה של עכברים לכל כלוב בכל הקבוצות במהלך המחקר.
  5. ספק שבוע של הסתגלות לסביבת הכלוב החדשה ולדיאטה לפני הפעלת משטר IF.
  6. תקופת צום: עכברים להעביר לכלוב נקי עם מצעים טריים ב 12:00 PM. אין להוסיף מזון לקבוצת IF, תוך מתן כמות מספקת של מזון לקבוצת AL.
    הערה: עבור כל מחזור צום חשוב לשנות כלובים לקבוצות של אל ו-IF כדי להבטיח ששתי הקבוצות ייחשפו לאותה כמות של זמן טיפול.
  7. לאחר 24 שעות, למדוד את המשקולות של עכברים בשתי הקבוצות ושאריות מזון בכלובים אל.
    הערה: הקפד לכלול את המשקל של פירורי מזון על הופר המזון התחתון של הכלוב, במיוחד בעת שימוש HFD, כמו עכברים לעתים קרובות להסיר כדורי קטנות או שברי מזון מן הופר ולשמור אותם ליד אתרי הקן. צריכת האנרגיה הממוצעת לכל עכבר בסוף כל 2:1 מחזור (3 ימים) היא סביב 35 קק ל, שווה ל ~ 10 g עבור דיאטה נורמלית (3.3 קלוריות/g) ו ~ 7 g עבור HFD (4.73 קק ל/g).
  8. תקופת האכלה: לספק כמות שקלה של מזון בשעה 12:00 PM עבור קבוצות AL ו-IF.
  9. לאחר 48 h של מתן המזון, למדוד את המשקל של שאריות מזון ועכברים.
  10. חזור על שלבים 1.6 – 1.10 למשך המחקר (למשל, 16 שבועות ).

2. קבוצת הבקרה של האכלה זוגית (PF)

הערה: עבור ניסוי IF שבו התנהגות האכלה שונה נצפתה במודל העכבר (למשל, hyperphagia ב ob/ob עכברים), יש צורך להיות קבוצה האכלה זוג כפקד עבור השוואה נכונה הקלוריות עצמאית IF.

  1. עבור קבוצת הבקרה של PF, סדר את לוח הזמנים של הניסוי כך שאותה כמות מזון הנצרכת על-ידי קבוצת IF מוצעת לקבוצת PF (איור 2).
  2. מדוד את כמות המזון הנצרכת על-ידי קבוצת IF למשך יומיים של תקופת הזנה מחדש.
  3. חלק כמות זו של מזון נצרך בקבוצה IF באופן שווה לשלוש פרופורציות ולספק אותה מדי יום לקבוצת PF בשעה 12:00 PM.
    הערה: הענקת כמות שווה של מזון יומית היא קריטית. במקרה של עכברים עם hyperphagia, אם העכברים הזנת זוג מסופקים עם כמות של מזון פחות מאשר הצריכה ההתנדבות שלהם בבת אחת, הם כנראה לצרוך את כל המזון סיפק ולהפוך באופן יעיל. הדבר עלול למנוע השוואה נכונה לעכברים שטופלו במידה ולבלבל את התוצאה.
  4. חזור על שלבים 2.1 – 2.3 למשך המחקר.

3. ניתוח הרכב הגוף

הערה: מאז לטווח ארוך אם משפיע על משקל הגוף בעכברים, הרכב הגוף יכול להיות נמדד במחזורים המתאימים (למשל, כל 3 או 4 מחזורים) באמצעות מנתח הרכב הגוף לכמת שומן המסה רזה בחיים, עכברים לא מורדם.

  1. הפעל את מנתח הרכב הגוף.
    הערה: לפני תחילת התוכנית, להשאיר את המחשב על לפחות 2-3 h כדי להתחמם.
  2. הפעל בדיקת מערכת על מנתח הרכב הגוף כדי לבדוק את דיוק המדידה שלו. במקרה הצורך, כיילו את המערכת באמצעות דגימות שמן קנולה ומים.
  3. למדוד את משקל הגוף של כל עכבר.
  4. מניחים את העכבר במחזיק בעלי חיים קטנים.
  5. הוסף מפריד כדי להגביל את התנועה הפיזית של העכבר במהלך המדידה והכנס את המחזיק לתוך מנתח הרכב הגוף.
  6. . הפעל את תוכנית הסריקה
    הערה: זה לוקח בערך 90-120 s לנתח.
  7. לאחר המדידה, להסיר את המחזיק מהציוד ולהביא את העכבר בחזרה לכלוב.
    הערה: פרוטוקול מפורט יותר ניתן למצוא בפרסום הקודם9.

4. גלוקוז ובדיקות עמידות לאינסולין

  1. עבור בדיקת עמידות גלוקוז (GTT), למדוד את משקל הגוף ואת הרכב הגוף של כל עכבר לפני העומס לצום ולסמן את הזנב עם סמן קבוע ליצירת אינדקס קל ומהיר.
  2. מניחים עכברים בכלובים חדשים ללא אוכל בשעה 7:00 בלילה לצום.
    הערה: צום לילה הוא הפרוטוקול הסטנדרטי, אך בשל הפיזיולוגיה של העכבר (g., הגביראת ניצול הגלוקוז לאחר צוםממושך 10,11), צום קצר (~ 6 h) ניתן להשתמש כמתואר עבור הויט.
  3. לאחר הצום 14 – 16 h (9:00 בבוקר למחרת), למדוד את משקל הגוף ואת הרכב הגוף של כל עכבר ולחשב את כמות המינון הגלוקוז על בסיס משקל הגוף.
    הערה: כדי למנוע הערכה יתר של חוסר סובלנות של גלוקוז בעכברים שמנים, המסה רזה שהושג ניתוח הרכב הגוף ניתן להשתמש כדי לחשב את המינון גלוקוז12,13.
  4. עבור כל עכבר, לחתוך את קצה הזנב (0.5 – 1.0 מ"מ) באמצעות מספריים כירורגי נקי. לאחר לנגב את טיפת הדם הראשונה, לצייר טיפה טרייה של דם מן הזנב ולמדוד בסיסית הצום של רמת הגלוקוז בדם עם הגלוקומיטר.
    הערה: חיתוך זנב נוסף אינו נדרש עבור כל מדידת הגלוקוז בדם במהלך GTT או אוויט. הפצע יכול להיות מרענן על ידי שהוא משלחים אותו עם גזה כדי למשוך טיפת דם.
  5. עכברים נושא להזרקה הצפק (כגון) של גלוקוז (1 מ"ג/g של משקל הגוף).
    הערה: מבוסס על מטרת הניסוי (למשל, בחינת אפקטים בבדיל), מינהל אוראלי של גלוקוז ניתן לבצע על ידי gavage אוראלי. הפרוטוקול עבור GTT אוראלי (OGTT) ניתן למצוא במחקר אחר14.
  6. מדידת הגלוקוז בדם מהזנב ב 0, 5, 15, 30, 60, ו 120 דקות לאחר הזרקת גלוקוז.
  7. לאחר סיום GTT, לספק כמות מספקת של מזון.
  8. עבור בדיקת עמידות לאינסולין (אוויט), הסר מזון ב 9:00 בבוקר.
    הערה: מכיוון ששניהם GTT ו-אוויט הם חוויות לגרימת מתח עבור עכברים שיכולים להעלות את רמות הגלוקוז בדם ולשנות את הפיזיולוגיה, מומלץ לבצע את האוויט לאחר שהוא מספק לפחות 2-3 ימים של שחזור לאחר ניסוי GTT.
  9. לאחר צום עבור 6 h (3:00 PM), למדוד את הגלוקוז דם הבסיסי מן הזנב כמתואר בשלב 4.4.
  10. עכברים הנושא להזרקת אינסולין (0.65 mU/g של משקל הגוף).
  11. מדידת הגלוקוז בדם מהזנב ב 0, 15, 30, 60, 90, ו 120 מינימום לאחר הזרקת אינסולין.
  12. לאחר לסיים את הרייט, לספק כמות מספקת של מזון.

5. קלורימטריה עקיפה

הערה: מטבוליזם אנרגיה של עכברים IF שטופלו ניתן להעריך עוד יותר באמצעות calorimetry עקיפה על מחזור אחד של IF. זה יהיה למדוד את צריכת החמצן (VO2), הייצור פחמן דו חמצני (vco2), יחס החילוף הנשימתי (RER), וחום (קק ל/h).

  1. הפעל את העוצמה של מערכת קלורימטר עקיפה לפחות 2 h לפני הפעלת הניסוי.
    הערה: חימום מערכת זה חשוב למדידה מדויקת.
  2. הכינו כלובים עם מצעים נקיים, מילוי בקבוקי מים, והוסיפו את כמות האוכל המוקדמת ביותר למזון.
  3. בדקו את מצב הדריריט. וסודה ליים אם מחוון צבע של הדריריט מופיע ורוד, מה שמעיד על כך שהדריריט ספג כמות גבוהה של לחות, יש צורך להחליף או לעלות בדריריט טרי.
  4. כיול המערכת באמצעות גז עם הרכב מסוים (0.5% CO2, 20.5% O2).
  5. מדידת משקל הגוף ואת הרכב הגוף של כל עכבר, אשר ישמש כדי לנרמל את VO2 ו vco2 נתונים.
  6. מניחים בעדינות עכבר אחד לכל כלוב.
  7. להרכיב כלובים מטבולית, למקם אותם בחדר הסביבה מבוקרת טמפרטורה, ולהתחבר קווי גז וכבל חיישן הפעילות.
  8. לאחר הגדרת פרופיל הניסוי על-ידי הוספת פרמטרים ניסיוניים מתאימים באמצעות התוכנה, הפעל את התוכנית למדידה. מטרת המדידה של היום הראשון היא לספק תקופת ההסתגלות ולמדוד את חילוף החומרים של האנרגיה הבסיסית.
  9. בשעה 12:00 ביום למחרת, הנושא עכברים ל -24 שעות של צום על ידי הסרת מזון ופירורים מהחגב והתחתון של הכלוב. במקרה הצורך, החליפו במצעים נקיים.
  10. לאחר 24 שעות, להוסיף את כמות מראש שקלה של אוכל הופר מזון לתקופת האכלה מחדש.
  11. המשך למדוד ל-48 h הבא. בדוק באופן קבוע אם המערכת פועלת ללא הפרעה בחומרה או בתוכנה.
  12. לאחר השלמת המדידה, לסיים את התוכנית ולהביא עכברים בחזרה לכלובים המקורי שלהם. מדדו את כמות שאריות המזון כדי לבחון צריכת מזון.
  13. הפרוטוקול המפורט לקלאורימטר עקיף ניתן למצוא במחקר הקודם9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את ניתוחי האכלה לאחר הצום 24 h ואת ההשוואה בין 1:1 ו 2:1 לסירוגין צום. תקופת צום של 24 שעות הביא לירידה של ~ 10% במשקל הגוף, אשר התאושש לגמרי לאחר 2 ימים של האכלה מחדש (איור 1א). תקופת צום של 24 שעות הנגרמת hyperphagia במהלך 2 הימים הבאים של האכלה מחדש (איור 1B). אף על פי כן, השוואת צריכת האנרגיה בין 1:1 יום אלטרנטיבי צום ו 2:1 הצום לסירוגין חשף כי 1 יום של תקופת האכלה מחדש ב 1:1 אם לא היה מספיק (~ 80%) כדי לפצות על אובדן הקלוריות על ידי צום, לעומת מצב אל (איור 1ג). מצד שני, 99% מצריכת האנרגיה היתה מפצה מלאה במהלך יומיים של הזנה מחדש ב 2:1 IF. משטר זה מאפשר בחינת ההשפעות של isocaloric אם כי הם עצמאיים הפרש צריכת הקלוריות.

איור 2 ממחיש ציר זמן סכימטי 2:1 IF ו-PF משטרי. כדי למזער את ההבדלים צריכת הקלוריות, התבוננות שנעשתה ביום חלופי בצום6,7, פרוטוקול זה הקים חדש IF משטר הכוללת של 2 יום האכלה ו 1 הצום תקופות (2:1 if)8, אשר איפשר את הבדיקה של ההשפעות הבריאותיות של isocaloric אם בעכברים מסוג פראי. עם זאת, ב אבוב/ob עכברים, אשר הציגו התנהגות hyperphagic, 2:1 אם התייחסו אבוב/ob עכברים הראו הפחתת צריכת הקלוריות 21%, לעומת העכברים ob/ob אל15. מאחר שפעולה זו מונעת השוואה מתאימה באמצעות הקלוריות, קבוצת שליטה של PF שמרה על אותה צריכת הקלוריות של השימוש בעכברים שטופלו ב- ob/ob . בקצרה, הכמות הכוללת של מזון נצרך במהלך 2 ימים של האכלה ב 2:1 אם העכברים חולקו באופן שווה לשלושה כמויות יומיות, ולאחר מכן המסופקים לקבוצת PF.

לסקירה מקיפה על תוצאות מטבולית של 2:1 אם, אנו השוונו את ההשפעות של אל, IF, ו-PF במשקל הגוף, צריכת מזון הרכב הגוף בסוג פראי ו ob/ob עכברים תחת דיאטה רגילה (ND) ו-hfd. לעומת אל, אם הטיפול הוביל להגדיל את המשקל בגוף נמוך ב-ND-הפד ו HFD-הפד בעכברים WT ללא הבדלים משמעותיים צריכת מזון (איור 3A, B). ניתוח הרכב הגוף חשף כי אם מופחתת במיוחד מסת שומן ללא שינויים במסה רזה בעכברים מסוג פראי (איור 3ג). ייתכן כי מעט, אם כי לא באופן משמעותי, עודף צריכת אנרגיה שהצטברו מעל 16 שבועות של תוכנית IF עלול לגרום לעלייה במשקל הגוף של אם בעלי חיים. עם זאת, אם ניסוי עם משטר האכלה זוג אישר כי ירידה משקל הגוף לעלות על ידי IF לא היה עקב צריכת אנרגיה שונה (איור 3D, E). שלא כמו חיות פרא, משקל הגוף של העכברים ob/ob נתון אם (OB-IF) היה נמוך יותר מאשר זה של עכבר OB-אל (איור 3G). זה נובע hyperphagia (אכילה מוגזמת) של העכברים ob/ob , המוביל לגבוה במקצת (21%) צריכת מזון בעכברים אל, לעומת בעלי חיים אם מטופלים (איור 3H). לכן, כדי לבחון באופן ספציפי את ההשפעה המטבולית של IF באופן בלתי תלוי בקלורי, קבוצת בקרת האכלה זוג הועסק. עם זאת, בניגוד עכברים מסוג פראי8, העכברים OB-PF לא היו זהים לעומת העכברים OB-אם במשקולות הגוף והרכב הגוף15 (איור 3I). תוצאות אלה מראים כי לפטין הוא כנראה מעורב isocaloric IF בתיווך הגוף הפחתת משקל בעכברים.

הטבה מטבולית העיקריים הענקת על ידי isocaloric אם הוא הומאוסטזיס גלוקוז משופר. כפי שמוצג באיור 4A, B, C, D, hfd-אם עכברים הציגו שיפור משמעותי הומאוסטזיס גלוקוז. GTT הראה כי הגלוקוז בדם מנוקה במהירות רבה יותר בעכברים אם מטופלים, בעוד שאוויט חשף רגישות גבוהה יותר לאינסולין בעכברים HFD-IF, לעומת עכברים HFD-AL או HFD-PF. באופן בלתי צפוי, למרות הכשלים בהפחתת המשקל IF-בתיווך, Ob-IF בעלי חיים הציגו באופן משמעותי לטיפול בגלוקוז עם טיולי גלוקוז קטנים יותר GTT, לעומת עכברים Ob-PF (איור 4E), ואילו רגישות האינסולין היה זהה בין העכברים ob-IF ו-Ob-pf (איור 4F). זה הומאוסטזיס גלוקוז משופר ב Ob-IF עכברים כנראה מתווכת על ידי הגדלת ברמת הפלזמה של glucagon כמו פפטיד-1 (GLP-1) ו גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין (נתונים לא מוצגים)15. באופן כללי, על ידי שימוש זה 2:1 IF פרוטוקול ובקרת PF בלתי תלוי הקלוריות הנכון, הראינו את היתרונות מטבולית של isocaloric אם בסוג פראי ו ob/ob עכברים.

אחת ההשפעות המטבולית של IF בעכברים מסוג פראי היא הכוללת יותר O2 צריכת, משמש להערכת הוצאות האנרגיה (איור 5א, ב). העלאה זו בצריכת O2 נמצאה רק במהלך תקופת האכלה בעכברים IF, אבל לא תקופת צום, לעומת עכברים אל. ההוצאה האנרגטית המוגברת הייתה מתווכת במידה רבה על ידי אדיפוז תרמוגנזה, כגון בראונינג ברקמות שאדיפוז לבן והפעלת רקמת השומן החום (נתונים לא מוצגים)8,16. אם בתיווך האדיפוז התרמוגנזה היה כנראה מסביר כיצד עכברים מסוג פראי חשופים אם הציגו את משקל הגוף מופחת לצבור ללא הבדל צריכת המזון, לעומת עכברים אל. מצד שני, אם לא הצליחה להגדיל את צריכת O2 ב ob/Ob עכברים (איור 5C-D), ואף הובילה לירידה בהוצאות האנרגיה במהלך תקופת הצום. באופן עקבי, האדיפוז התרמוגנגנזה בוטלה לחלוטין ב ob/ob עכברים (נתונים לא מוצגים). נתונים אלה מצביעים על הגבלה אפשרית של IF כפי שהוא עשוי לפעול באופן שונה עבור אנשים עם רקעים גנטיים וסביבתיים שונים.

Figure 1
איור 1: מנתח האכלה לאחר הצום 24 h והשוואה בין 1:1 ו 2:1 IF. (א) הגוף היומי שינויים במשקל של עכברים לפני ואחרי 24 h צום (n = 10). (ב) צריכת אנרגיה יומית לפני ואחרי 24 שעות הצום (n = 5 כלובים; 2 עכברים לכל כלוב). (ג) השוואת צריכת האנרגיה בין צום היום החלופי (כלומר, 1 יום האכלה /1 יום צום, 1:1 אם) ו 2:1 לסירוגין הצום (כלומר, 2 יום האכלה/1 יום צום). ב 1:1 IF משטר, רק ~ 80% צריכת המזון היה מפוצה במהלך היום 1 הבאים של האכלה מחדש בהשוואה צריכת המזון על 2 ימים של האכלה. מצד שני, 99% מצריכת האנרגיה הושגה כאשר 2 ימים של האכלה מחדש ניתנה, לעומת זה מעל 3 ימים של האכלה. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. נתון זה שוחזר באישור קים ואח '.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: המחשה סכמטית של isocaloric 2:1 IF אם משטר. עבור בקרת PF, כמות המזון הנצרכת במהלך 2 הימים של האכלה על ידי עכברים אם מטופלים מחולקת לשלושה חלקים שווים, אשר מסופקים לאחר מכן מדי יום לעכברים PF במהלך המחזור הבא. אל = לlibitum; PF = האכלה זוגית. חלק מדמות זו שוחזר באישור קים ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השוואת השפעות אל, IF ו-PF על משקל הגוף, צריכת המזון והרכב הגוף בין מסוג פראי לבין ob/ob עכברים. (א, ב, ג) משקל הגוף, צריכת המזון, והרכב הגוף בעכברים מסוג פראי או אם מטופלים תחת דיאטה רגילה (ND) או דיאטה שומן גבוה (HFD) במהלך 16 שבועות של משטר IF. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. (ND-AL: n = 7; ND-IF: n = 8; HFD-AL: n = 7; ו-HFD-IF: n = 8); מערך ANOVA יחיד או דו כיוון עם ניתוח של סטודנט-ניומן-קלס לאחר-הוק; * * p < 0.01 לעומת HFD-AL. (D, E, F) משקל הגוף, צריכת המזון, ואת הרכב הגוף ב PF vs. IF עכברים ניזונה דיאטה שומן גבוהה (hfd) במהלך 12 שבועות של משטר IF. (PF: n = 6 ו-IF: n = 6); מבחן tדו-זנבי של סטודנט שאינו משויך; * p < 0.05 לעומת ה, המשך NS = אינו משמעותי. (G, H, I) משקל הגוף, צריכת המזון, והרכב הגוף ב-AL, PF, או אם התייחסו לעכברים ob/ob הניזון מאוכל רגיל (OB-AL: n = 4; Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); . אוב-אל נגד Ob-PF: *p < 0.05; . אוב-אל נגד Ob-אם: * p < 0.05; . לעומתזאת . אני מבין. פאנלים A – F שוחזרו באישור קים ואח '8. פאנלים G – אני שוחזרו באישור קים ואח '15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הומאוסטזיס גלוקוז משופר על ידי IF בסוג פראי ו ob/ob עכברים. (א, ב) ה-GTT ו-אוויט ב-HFD-AL ו-HFD-עכברים בעלי סוג פראי לאחר 16 שבועות של משטר IF. ההזחה מראה אזור תחת עקומה (אוק); * p < 0.05 vs. HFD-AL. (C, D) GTT ו-אוויט ב hfd-PF בהשוואה ל-hfd-if עכברים מסוג פראי לאחר 12 שבועות של משטר if. ההזחה מראה את ה-אוק; * p < 0.05 לעומת hfd-pf. (E, F) GTT ו-אוויט ב-ob-אם בהשוואה לעכברים Ob-PF לאחר 16 שבועות של משטר IF. הכניסה מראה את ה-אוק (* p < 0.05 vs. Ob-PF). פאנלים A-D שוחזרו באישור קים ואח '8. פאנלים Eו-Fשוחזרו עם אישור מקים ואח '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח ההוצאה לאנרגיה בסוג פראי אם מטופלים ו ob/ob עכברים. (א) עקבות של צריכת O2 במהלך מחזור אחד של 2:1 אם בעכברים מסוג פראי (כלומר, 1 יום צום ואחריו 2 ימי האכלה). (ב) ממוצע של O2 צריכת לשעה במהלך צום, האכלה, ומחזור אחד של 2:1 IF. נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM (HFD-AL: n = 6; ו-HFD-IF: n = 12); * p < 0.05 לעומת HFD-AL. (ג) או2 הצריכה של שרידים של אבוב/ob עכברים במחזור אחד של 2:1 IF. (ד) ממוצע צריכת O2 לשעה במהלך צום, האכלה, ומחזור אחד של 2:1 IF (Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); * p < 0.05 לעומת ב-Ob-PF פאנל B שוחזר באישור קים ואח '8. לוחות C ו-D שוחזרו באישור קים ואח '15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זה היה מתועד היטב כי אם מספק השפעות בריאותיות מועילות על מחלות שונות בבני אדם ובעלי חיים8,15,16,17,18,19. המנגנונים הבסיסיים שלה, כגון המעי האוטומטי ומיקרובידום המעיים, הובהר לאחרונה. הפרוטוקול המוצג מתאר isocaloric 2:1 IF משטר אם בעכברים לחקירת הטבות מטבולית בלתי תלוי קלוריות של IF נגד השמנה הנגרמת מפני דיאטה ותפקוד מטבולי משויך. בניגוד ליום חלופי הצום (1:1 IF) פרוטוקול שתוצאתו הפחתת צריכת הקלוריות הכוללת6,7, מתן 1 יום נוסף של הזנה מחדש ב 2:1 אם משטר מאפשר תחזוקה של מצב isocaloric בעכברים סוג פראי.

בנוסף, לעומת 1:1 IF, משטר 2:1 IF עשוי להפחית האפשרי צום בתיווך מתח או טורפור בעכברים20 והוא גם דומה לשיטה תזונתיים פופולרית, 5:2 דיאטה2. למרות השפעותיו לא נבדקו, המשטר יכול להיות שונה על ידי מתן ימים נוספים של האכלה מחדש (למשל, 3:1 או 4:1 IF). יתר על כן, פרוטוקול זה הציג ניתן לכוונן בקלות בקנה מידה שנקרא זמן מוגבל האכלה (trf), שבו גישה למזון מוגבל 8 h ליום במהלך השלב הפעיל21, אשר ידוע להשיג משטר דיאטה isocaloric ולספק הטבות מטבולית נגד hfd המושרה השמנה סוכרת19,21,22.

כפי שמוצג בניתוח האכלה (איור 1B), התנהגות hyperphagic מיד לאחר 24 שעות של ירידות צום בהדרגה עכברים מסוג פראי, אשר מאפשר ISOCALORIC IF. עם זאת, מצב isocaloric זה לא ניתן להשיג בעכברים ob/ob , כאשר הם חסרים לפטין איתות בתיווך ומטבוליזם האנרגיה, המוביל היפראפארגיות מתמשך פנוטיפ23,24. לכן, לפני ביצוע ניסוי IF, מומלץ לבחון את התנהגות ההזנה של מודל העכבר המעניין. כדי לבחון את ההשפעות של אם באמצעות מודל העכבר hyperphagic (למשל, ob/ob, db/db, Sim1+/-, MC4R-/-)24,25,26, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, התעסוקה של קבוצה זוג האכלה כפקד ניסיוני isocaloric חשוב לביצוע השוואות הנכון. זה גם דורש תכנון זהיר בעת בדיקת מודל העכבר עם פנוטיפ hypopרגיות (למשל, מלנין המכיל עכברים KO הורמון)27.

גורם חשוב לשקול עבור IF מחקרים היא טמפרטורת הדיור, אשר משפיע על פרמטרים פיזיולוגיים שונים התנהגותיים בעכברים. במיוחד, חשיפה קרה (4 – 6 ° c) מגביר באופן משמעותי את צריכת האנרגיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ליבה28. לעומת זאת, בתנאים מנוגדים (30 ° c) שבהם הרווח התרמי מתאזן על ידי איבוד חום, הפחתת צריכת המזון מופחתת במידה ניכרת8. ביחס לתוצאות המטבולית, החשיפה הקרה גורמת לאדיפוז תרמוגנזה, שהוא הושפע מהמצב התרמי. לכן, הוא צפוי כי טמפרטורת הדיור משפיע על פנוטיפים מטבולית של IF המתאים האכלה: יחס צום כדי להשיג isocaloric IF.

אכן, זה כבר הוכיחה בעבר כי isocaloric 2:1 IF ניתן להשיג בתנאים thermoneutral המובילה לבריאות מטבולית משופרת ב-דיאטה המושרה השמנה ותפקוד מטבולי ללא הבדלים צריכת מזון בין קבוצות IF ו-AL8. עם זאת, isocaloric אם לא יכול להיות השגה עם 2:1 יחס בטמפרטורות קר, כי עכברים תחת חשיפה קרה יראה פנוטיפים hyperphagic, אשר מוביל האכלה בקבוצה IF. מאז חשיפה קרה ואם להציג תוצאות מטבולית דומה ומנגנונים (כלומר, אדיפוז תרמוגנזה ומשופר הומאוסטזיס גלוקוז) המסייעים להילחם השמנה, יש עניין בשילוב שתי התערבויות אלה כדי למקסם את ההשפעה המטבולית. לכן, כדי לבדוק את זה כראוי, ביצוע ניתוח האכלה לפני הפעלת ניסוי IF וניצול של קבוצת בקרת זוג האכלה תחת חשיפה קרה מומלץ.

גורמים אחרים שעלולים להשפיע על התוצאות של מחקרי IF כוללים צפיפות הדיור. בדומה למחקר הקודם, שהראה צריכת מזון מופחתת בעכברים שוכנו יותר בצפיפות29, עכברים מכלוב של חמישה צורכים מזון משמעותי פחות מאלה מכלוב של שניים (תוצאות שלא פורסמו). בנוסף, היא הוכיחה כי צפיפות הדיור משפיע באופן משמעותי על טמפרטורת הסביבה, כמו הטמפרטורה בתוך כלוב הדיור חמישה עכברים הוא 1 – 2 ° צ' גבוה יותר מאשר דיור אחד לשני עכברים30. למרות מחקר זה הסיק כי צפיפות הדיור לא השפיע באופן משמעותי צריכת מזון (נבדק 5 שבועות), במחקר IF מתמשך 12 – 16 שבועות, הטמפרטורה בתוך הכלוב מושפע צפיפות הדיור עלול עדיין להשפיע על צריכת מזון חילוף החומרים והאנרגיה. יחד, חשוב לשמור את אותו מספר של עכברים שוכנו בכלוב ולמזער את המספר לכל כלוב במהלך המחקר.

לסיכום, דוח זה מראה פרוטוקול פשוט ומהווה לצורך בדיקה isocaloric 2:1 IF בעכברים. למרות המחקר הנוכחי מתמקד הטבות מטבולית של IF המושרה דיאטה השמנה, תפקוד מטבולית, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור את ההשפעות המגן והטיפולי של isocaloric אם נגד תנאים אחרים, כגון לב וכלי דם ומחלות נוירולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

K.-H. K היה נתמך על ידי הקרן לב ושבץ של קנדה גרנט בסיוע (G-18-0022213), J. P. קרן ביקל ו אוניברסיטת אוטווה מכון הלב הקרן למעלה; ח.-K.S. היה נתמך על ידי מענקים מן המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (PJT-162083), ראובן והלן דניס המלומד ופרס החוקר החדש הפיננסי של יום ראשון לחקר הסוכרת של בנטינג & מרכז הסוכרת הטוב ביותר (BBDC) ומדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי (NSERC) של קנדה (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. היתה נתמכת על ידי מחבר מאוניברסיטת אוטווה הקרן למחקר קרדיולוגיה. J.H.L. היה נתמך על ידי מלגת הדוקטורט NSERC ומלגת בוגרת אונטריו. בן היה נתמך על ידי UOHI בוגר פרס והמלכה אליזבת השנייה בוגרת מלגה במדע וטכנולוגיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) Columbus Instruments Indirect calorimeter
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 For GTT
EchoMRI 3-in-1 EchoMRI EchoMRI 3-in-1 Body composition analysis
Glucometer and strips Bayer Contour NEXT These are for GTT and ITT experiments
High Fat Diet (45% Kcal% fat) Research Diets Inc. #D12451 3.3 Kcal/g
High Fat Diet (60% Kcal% fat) Research Diets Inc. #D12452 4.73 Kcal/g
Insulin El Lilly Humulin R For ITT
Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J The Jackson Laboratory #000632 Ob/Ob mouse
Mouse Strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory #000664
Normal chow (17% Kcal% fat) Harlan #2918
Scale Mettler Toledo Body weight and food intake measurement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
  2. Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
  3. Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
  4. Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
  5. Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
  6. Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
  7. Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
  8. Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
  9. Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  11. Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
  12. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
  13. Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
  14. Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
  15. Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
  16. Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
  17. Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
  18. Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
  19. Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
  20. Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
  21. Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
  22. Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
  23. Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
  24. Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
  25. Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
  26. Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
  27. Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
  28. Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
  29. Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
  30. Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).

Tags

ביולוגיה סוגיה 153 צום לסירוגין isocaloric התערבות דיאטה השמנת יתר הומאוסטזיס גלוקוז GTT אוויט הרכב הגוף
הערכה של ההשפעות המטבולית של Isocaloric 2:1 לסירוגין צום בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, R. Y., Lee, J. H., Oh, Y.,… More

Kim, R. Y., Lee, J. H., Oh, Y., Sung, H. K., Kim, K. H. Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60174, doi:10.3791/60174 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter