Summary
Bu makalede, yabani tip ve ob/ob farelerde obezite ve bozulmuş glikoz metabolizmasına karşı korumak ve tedavi etmek için izokalorik 2:1 aralıklı oruç için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Aralıklı açlık (IF), periyodik enerji kısıtlaması içeren bir diyet müdahalesi, çok sayıda fayda sağlamak ve metabolik anormallikleri karşı koymak için kabul edilmiştir. Bugüne kadar, açlık ve beslenme süreleri değişen sürelere sahip farklı TIPIF modelleri belgelenmiştir. Ancak, bu modellerin çoğu hem zaman hem de kalori kısıtlama stratejilerinin çok faktörlü katkılarını içerdiğinden, sonuçların yorumlanması zordur. Örneğin, genellikle kemirgen IF rejimi olarak kullanılan alternatif gün oruç modeli, yetersiz beslenmeye neden olabilir ve bu müdahalenin sağlığa yararlarının hem kalori kısıtlaması hem de oruç-yeniden besleme döngüleri yoluyla aracılık ettiğini düşündürmektedir. Son zamanlarda, 2 gün oruç ve ardından 2 günlük beslenmeden oluşan 2:1 IF'nin, genel kalori alımında azalma olmadan diyete bağlı obezite ve metabolik iyileşmelere karşı koruma sağlayabileceği başarıyla gösterilmiştir. Burada sunulan bu isocaloric bir protokoldür 2:1 farelerde IF müdahale. Ayrıca hiperfaji gibi değiştirilmiş yeme davranışları olan bir fare modelini incelemek için gereken çift besleme (PF) protokolü de tanımlanmıştır. 2:1 IF rejimi kullanılarak, bu isocaloric IF azaltılmış vücut kilo alımına yol açtığı gösterilmiştir, geliştirilmiş glikoz homeostazı, ve yüksek enerji harcaması. Bu nedenle, bu rejim çeşitli hastalık koşulları üzerinde IF sağlık etkilerini araştırmak için yararlı olabilir.
Introduction
Modern yaşam tarzı uzun günlük gıda alım süresi ve daha kısa açlık süreleri ile ilişkilidir1. Bu mevcut küresel obezite salgını katkıda, metabolik dezavantajları insanlarda görülen ile. Oruç insanlık tarihi boyunca uygulanmıştır, ve çeşitli sağlık yararları uzun ömürlü dahil, azaltılmış oksidatif hasar, ve optimize enerji homeostaz2,3. Oruç uygulamanın çeşitli yolları arasında, periyodik enerji yoksunluğu, aralıklı oruç olarak adlandırılır (IF), yaygın olarak genel nüfus tarafından kolay ve basit rejimi nedeniyle uygulanan popüler bir diyet yöntemidir. Preklinik ve klinik modellerde yapılan son çalışmalar, IF'nin uzun süreli açlık ve kalori kısıtlamasına benzer sağlık yararları sağlayabileceğini göstererek, IF'nin obezite ve metabolik hastalıklar için potansiyel bir tedavi stratejisi olabileceğini düşündürmektedir2,3,4,5.
IF rejimleri oruç süresi ve sıklığı açısından değişir. Alternatif gün oruç (yani, 1 gün beslenme / 1 gün oruç; 1:1 IF) obezite, kardiyovasküler hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar, vb 2,3üzerindeki yararlı sağlık etkilerini incelemek için kemirgenler en sık kullanılan IF rejimi olmuştur . Ancak, önceki çalışmalarda gösterildiği gibi6,7, ve daha fazla mekanistik bizim enerji alım analizi nde doğruladı8, 1:1 underfeeding sonuçları (~ 80%) enerji kaybını telafi etmek için yeterli besleme süresi nin olmaması nedeniyle. Bu, 1:1 IF'in sağladığı sağlık yararlarının kalori kısıtlaması veya yeme alışkanlıklarının değiştirilmesi yle aracılık edilip edilmediği belirsizliğini sağlar. Bu nedenle, yeni bir IF rejimi geliştirilmiştir ve burada gösterilmiştir, 2 günlük beslenme/1 günlük oruç (2:1 IF) deseninden oluşan, farelere gıda alımını telafi etmek için yeterli zaman sağlayan (~99%) ve vücut ağırlığı. Bu fareler daha sonra bir reklam libitum (AL) grubu ile karşılaştırılır. Bu rejim, yabani tip farelerde kalori azalması yokluğunda izokalorik IF etkilerinin incelenmesini sağlar.
Buna karşılık, değiştirilmiş besleme davranışı sergileyen bir fare modelinde, AL besleme karşılaştırmak ve 2:1 IF etkilerini incelemek için uygun bir kontrol koşulu olmayabilir. Örneğin, ob/ob fareler (obezite için yaygın olarak kullanılan bir genetik model) iştah ve tokluğu düzenleyen leptin eksikliği nedeniyle hiperfaji sergilediğinden, 2:1 IF sergileyenler AL beslemeli ob/ob farelere göre kalori alımını ~%20 azaltırlar. Bu nedenle, ob/ob farelerde IF'nin etkilerini doğru bir şekilde incelemek ve karşılaştırmak için uygun bir kontrol olarak çift besleme grubunun istihdam edilmesi gerekmektedir.
Genel olarak, bir çift besleme kontrolü kullanımı da dahil olmak üzere izocaloric 2:1 IF gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sağlanır. Ayrıca, ozokalorik 2:1 IF'in fareleri yüksek yağlı diyetkaynaklı obeziteden ve/veya hem yabani tip hem de ob/ob farelerde metabolik disfonksiyondan koruduğu gösterilmiştir. Bu protokol, nörolojik bozukluklar, kardiyovasküler hastalıklar ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlar üzerinde 2:1 IF yararlı sağlık etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Buradaki tüm yöntem ve protokoller Ottawa Üniversitesi ve Fenogenomik Merkezi'nin (TCP) Hayvan Bakım ve Veterinerlik Hizmetleri (ACVS) hayvan bakım komiteleri tarafından onaylanmıştır ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi standartlarına uygundur. Burada açıklanan tüm prosedürlerin kurumsal ve resmi onay altında ve teknik olarak yeterli personel tarafından yapılması gerektiği unutulmamalıdır. Tüm fareler, 12 saat/12 h ışık/karanlık döngüye (21-22 °C, normal muhafaza için %30-%60 nem) ve suya ücretsiz erişime sahip standart havalandırmalı kafeslerde yer aldı. Erkek C57BL/6J ve ob/ob fareler Jackson Laboratuvarı'ndan alındı.
1. 02:1 Isocaloric IF Rejimi
- Yağsız ve diyete bağlı obezite fare modelleri için normal bir diyet (%17 yağ, ND) veya yüksek yağlı diyet (%45 yağ, HFD) hazırlayın.
NOT: %60 HFD şiddetli diyet kaynaklı obeziteye neden olmak için kullanılabilir; ancak, gıda pelet yumuşaklığı nedeniyle, doğru günlük gıda alımını ölçmek için nispeten zordur. Otomatik bir sürekli ölçüm sistemi diyetler birden fazla türiçin çok yönlülük artırabilir. - Bir ölçek ve EchoMRI kullanarak 7 haftalık bir ölçekte her farenin temel gövde ağırlığı ve vücut kompozisyonu ölçün.
NOT: Vücut kompozisyonu ölçümü için bölüm 3'e bakın. - Vücut ağırlığı ve vücut kompozisyonu sonuçlarına göre, 7 haftalık erkek C57BL/6J fareleri rastgele ve eşit olarak ikiye ayırın: ad libitum (AL) ve aralıklı açlık (IF) grupları.
- Kafes başına 2-3 fare yerleştirin ve içme suyuna ücretsiz erişim sağlayın.
NOT: Kafes başına fare sayısı gıda alımı davranışını etkileyebilir. Çalışma sırasında tüm gruplarda kafes başına eşit sayıda fare bulundurulması önerilir. - IF rejimine başlamadan önce yeni kafes ortamına ve diyete 1 haftalık uyum sağlayın.
- Oruç süresi: 12:00 de taze yatak ile temiz bir kafese fareler taşıyın. AL grubuna tartılı miktarda yiyecek sağlarken IF grubu için yiyecek eklemeyin.
NOT: Her oruç döngüsü için, her iki grubun da aynı miktarda kullanım süresine maruz kaldığından emin olmak için hem AL hem de IF grupları için kafesdeğiştirmek önemlidir. - 24 saat sonra, her iki gruptaki farelerin ağırlıklarını ve AL kafeslerinde kalan yiyecekleri ölçün.
NOT: Fareler genellikle hazneden küçük peletleri veya yiyecek parçalarını çıkarıp yuva bölgelerinin yakınında tuttuğundan, özellikle HFD kullanırken, gıda kırıntılarının ağırlığını kafesin alt kısmında ve gıda haznesi üzerinde eklediğinizden emin olun. Her 2:1 döngüsünün (3 gün) sonunda fare başına ortalama enerji alımı 35 kcal civarındadır, normal bir diyet için ~10 g 'ye eşdeğerdir (3.3 kcal/g) ve HFD için ~7 g (4.73 kcal/g). - Beslenme süresi: hem AL hem de IF grupları için saat 12:00'de tartılan bir gıda miktarı sağlar.
- Gıda sağlayan 48 saat sonra, artık gıda ve farelerin ağırlığını ölçmek.
- Çalışma süresince (örn.16 hafta) adımları 1.6-1.10 olarak tekrarlayın.
2. Çift besleme (PF) Kontrol Grubu
NOT: Bir fare modelinde (örn. ob/ob farelerde hiperfaji) değiştirilmiş beslenme davranışının gözlendiği bir IF deneyi için, IF ile uygun kaloriden bağımsız karşılaştırma için bir çift besleme grubuna sahip olmak gerekir.
- PF kontrol grubu için, IF grubu tarafından tüketilen aynı miktarda yiyeceğin PF grubuna sunulması gibi deney takvimini stagger(Şekil 2).
- IF grubu tarafından tüketilen gıda miktarını 2 günlük yeniden besleme süresi boyunca ölçün.
- IF grubundaki bu tüketilen gıda miktarını eşit olarak üç orana bölün ve günlük olarak 12:00'de PF grubuna sağlayın.
NOT: Günlük eşit miktarda yiyecek sağlamak çok önemlidir. Hiperfajili farelerde, çift beslenen farelere gönüllü tüketimlerinden daha az yiyecek sağlanırsa, büyük olasılıkla sağlanan tüm yiyecekleri tüketir ve etkili bir şekilde oruç tutarlar. Bu daha sonra IF-tedavi fareler için uygun karşılaştırma önlemek ve sonucu şaşırtmak olabilir. - Çalışma süresince 2.1-2.3 adımlarını tekrarlayın.
3. Vücut Kompozisyon analizi
NOT: Uzun süreli IF farelerde vücut ağırlığını etkilediği için, vücut kompozisyonu canlı, anesteziolmayan farelerde yağ ve yağsız kütleyi ölçmek için bir vücut kompozisyonu analizörü kullanılarak uygun döngülerde (örn. her 3 veya 4 döngü) ölçülebilir.
- Vücut kompozisyonu analizörlerini açın.
NOT: Programa başlamadan önce, ısınmak için makineyi en az 2-3 saat bekletin. - Ölçüm doğruluğunu test etmek için vücut kompozisyonu analizörü üzerinde bir sistem testi çalıştırın. Gerekirse, kanola yağı ve su örnekleri kullanarak sistemi kalibre edin.
- Her farenin gövde ağırlığını ölçün.
- Fareyi küçük bir hayvan silindirtutucuye yerleştirin.
- Ölçüm sırasında farenin fiziksel hareketini kısıtlamak için bir sınır çözücü yerleştirin ve tutucuyu gövde kompozisyonu analizörüne yerleştirin.
- Tarama programını çalıştırın.
NOT: Analiz etmek yaklaşık 90-120 s alır. - Ölçümden sonra tutucuyu ekipmandan çıkarın ve fareyi kafese geri getirin.
NOT: Daha ayrıntılı bir protokol önceki bir yayında bulunabilir9.
4. Glikoz ve İnsülin Tolerans Testleri
- Glukoz tolerans testi (GTT) için, oruç tutmaktan önce her farenin vücut ağırlığını ve vücut kompozisyonu ölçmek ve kolay ve hızlı indeksleme için kalıcı bir belirteç ile kuyruk işaretleyin.
- Fareleri akşam 7:00'de yiyeceksiz yeni kafeslere yerleştirin.
NOT: Gece oruç standart protokol, henüz fare fizyolojisi nedeniyle (örneğin, uzun süre oruç sonra artan glikoz kullanımı10,11), kısa oruç (~ 6 h) ITT için açıklandığı şekilde kullanılabilir. - Oruç sonra 14-16 h (09:00 ertesi sabah), her farenin vücut ağırlığı ve vücut kompozisyonu ölçmek ve vücut ağırlığına göre glikoz doz miktarını hesaplamak.
NOT: Obez farelerde glikoz intoleransının aşırı tahmin intoleransını önlemek için, vücut kompozisyonu analizinden elde edilen yağsız kütle glukoz dozu hesaplamak için kullanılabilir12,13. - Her fare için, temiz cerrahi makas kullanarak kuyruğun ucunu (0,5-1,0 mm) kesin. Kan ilk damla sildikten sonra, kuyruk kan taze bir damla çekmek ve glucometer ile bazal açlık kan şekeri düzeyini ölçmek.
NOT: GTT veya ITT sırasında her kan şekeri ölçümü için ek kuyruk kesimi gerekmez. Yara, bir damla kan çekmek için gazlı bezle ezilerek tazelenebilir. - Konu fareler intraperitoneal (i.p.) glukoz enjeksiyonuna (vücut ağırlığı nın 1 mg/g).
NOT: Bir deneyin amacına göre(örn., inkretin etkilerinin incelenmesi), glikozun oral uygulaması oral gavaj ile yapılabilir. Oral GTT (OGTT) protokolü başka bir çalışmada bulunabilir14. - 0, 5, 15, 30, 60 ve 120 dk glukoz sonrası enjeksiyonda kuyruktaki kan şekerini ölçün.
- GTT'yi bitirdikten sonra, yeterli miktarda yiyecek sağlayın.
- İnsülin tolerans testi (ITT) için, 09:00'da yiyecekleri çıkarın.
NOT: Hem GTT hem de ITT, kan şekeri düzeylerini yükseltebilen ve fizyolojiyi değiştirebilen fareler için strese neden olan deneyimler olduğundan, GTT deneyinden sonra en az 2-3 günlük iyileşme sağladıktan sonra ITT'nin kullanılması önerilir. - 6 saat (3:00 PM) oruç sonra, adım 4.4 açıklandığı gibi kuyruk temel kan şekeri ölçün.
- İnsülin i.p. enjeksiyonuna tabi fareler (vücut ağırlığı 0.65 mU/g).
- 0, 15, 30, 60, 90 ve 120 dk post-insülin enjeksiyonu kuyruk kan şekeri ölçün.
- ITT'yi bitirdikten sonra, yeterli miktarda yiyecek sağlayın.
5. Dolaylı Kalorimetre
NOT: IF ile tedavi edilen farelerin enerji metabolizması, tek bir IF döngüsü boyunca dolaylı kalorimetre ile daha da değerlendirilebilir. Bu oksijen tüketimini ölçecektir (VO2),karbondioksit üretimi (VCO2),solunum değişim oranı (RER), ve ısı (kcal/h).
- Denemeyi çalıştırmadan önce dolaylı kalorimetre sisteminin gücünü en az 2 saat açın.
NOT: Bu sistem ısınma doğru ölçüm için önemlidir. - Temiz yatak takımları ile kafesler hazırlayın, su şişeleri doldurun ve gıda haznelerine önceden tartılmış miktarda yemek ekleyin.
- Drierite ve limonlu sodanın durumunu kontrol edin. Drierite bir renk göstergesi pembe görünürse, Hangi Drierite nem yüksek miktarda emmiş olduğunu gösterir, bu taze Drierite ile değiştirmek veya üst gereklidir.
- Sistemi belirli bileşimle bir gaz kullanarak kalibre edin (%0,5 CO2,%20,5 O2).
- VO2 ve VCO2 verilerini normalleştirmek için kullanılacak her farenin gövde ağırlığını ve gövde kompozisyonu ölçün.
- Yavaşça kafes başına bir fare yerleştirin.
- Metabolik kafesleri monte edin, ısı kontrollü ortam odasına yerleştirin ve gaz hatlarına ve aktivite sensörü kablosuna bağlayın.
- Yazılımı kullanarak uygun deneysel parametreler ekleyerek deneme profilini ayarladıktan sonra, ölçüm için programı çalıştırın. İlk gün ölçümünün amacı bir alışma dönemi sağlamak ve temel enerji metabolizmasını ölçmektir.
- Ertesi gün saat 12:00'de fareler, kafesin haznesinden ve dibinden yiyecek ve kırıntıları çıkararak 24 saat oruç tutarlar. Gerekirse, temiz yatak ile değiştirin.
- 24 saat sonra, yeniden besleme süresi için gıda haznesine önceden tartılmış chow miktarını ekleyin.
- Sonraki 48 saat boyunca sistemin donanım veya yazılım kesintisi olmadan çalışıp çalışmadığını düzenli olarak kontrol edin.
- Ölçümü tamamladıktan sonra, programı sonlandırın ve fareleri orijinal kafeslerine geri getirin. Gıda alımını incelemek için artık gıda miktarını ölçün.
- Dolaylı kaloriyetri için ayrıntılı protokol bir önceki çalışmada bulunabilir9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, 24 saat oruç tan sonra beslenme analizlerini ve 1:1 ile 2:1 aralıklı oruç arasındaki karşılaştırmayı göstermektedir. 24 saat açlık dönemi vücut ağırlığında ~%10 azalma ile sonuçlandı ve 2 günlük yeniden beslenmeden sonra tamamen iyileşti (Şekil 1A). 24 h açlık dönemi, sonraki 2 günlük yeniden besleme sırasında hiperfajiye neden olur (Şekil 1B). Bununla birlikte, 1:1 alternatif gün oruç ve 2:1 aralıklı oruç arasında enerji alımı nın karşılaştırılması 1:1 IF refeeding döneminin 1 gün yeterli olmadığını ortaya koymuştur (~ 80%) al durumuna göre açlıkla kalori kaybını telafi etmek için (Şekil 1C). Öte yandan, enerji alımının% 99 tam olarak 2:1 IF yeniden besleme 2 gün boyunca telafi edildi. Bu rejim, kalori alımı farkı bağımsız isocaloric IF etkilerinin incelenmesini sağlar.
Şekil 2 izocaloric 2:1 IF ve PF rejimleri için şematik bir zaman çizelgesi göstermektedir. Kalori alımındaki farklılıkları en aza indirmek için, alternatif gün oruç6yapılan bir gözlem,7, Bu protokol 2 gün beslenme ve 1 günlük oruç süreleri (2:1 IF)8oluşan yeni bir IF rejimi kurdu , hangi yabani farelerde izokalorik IF sağlık etkilerinin incelenmesini sağladı. Ancak, hiperphagic davranış sergileyen ob /ob farelerde, 2:1 IF-tedavi ob /ob fareler% 21 kalori alımı azaltma gösterdi, ob / ob AL fareler ile karşılaştırıldığında15. Bu, uygun bir kalori-bağımsız karşılaştırmayı önlediği için, IF ile tedavi edilen ob/ob farelerle aynı kalori alımını sağlayan bir PF kontrol grubu kullanılmıştır. Kısaca, 2:1 Fareler eşit üç günlük miktara bölündü, daha sonra PF grubuna sağlanan 2 gün beslenme sırasında tüketilen toplam gıda miktarı.
2:1 IF metabolik sonuçları hakkında kapsamlı bir genel bakış için, al, IF ve PF'nin vücut ağırlığı, gıda alımı ve vücut kompozisyonu ile normal beslenme (ND) ve HFD altında yabani tip ve ob/ob farelerdeki etkilerini karşılaştırdık. AL ile karşılaştırıldığında, IF tedavisi gıda alımında önemli farklılıklar olmaksızın ND ile beslenen ve HFD ile beslenen WT farelerde vücut ağırlığının daha düşük artmasına yol açmıştır(Şekil 3A,B). Vücut kompozisyonu analizi, IF'nin özellikle yabani tip farelerde yağsız kütlede değişiklik olmadan yağ kütlesini azalttığını ortaya koymuştur(Şekil 3C). Bu biraz mümkündür, önemli olmasa da, if programının 16 hafta içinde düşük birikmiş enerji alımı IF hayvanların azaltılmış vücut ağırlığı alımına neden olabilir. Ancak IF çifti besleme rejimi ile yapılan deney, IF'nin vücut ağırlığındaki azalmanın değiştirilmiş enerji alımına bağlı olmadığını doğrulamıştır(Şekil 3D,E). Yabani tip hayvanların aksine, IF'e (Ob-IF) maruz kalan ob/ob farelerin vücut ağırlığı Ob-AL farelerinden daha düşüktü(Şekil 3G). Bu ob / ob farelerin hiperfaji (aşırı yeme) nedeniyle, hafif yüksek (% 21) yol AL farelerde gıda alımı, IF ile tedavi edilen hayvanlara göre(Şekil 3H). Bu nedenle IF'nin metabolik etkisini özellikle kalori-bağımsız bir şekilde incelemek için çift besleme kontrol grubu kullanılmıştır. Ancak, yabani tip farelerin aksine8, Ob-PF fareler vücut ağırlıkları ve vücut kompozisyonu Ob-IF fareler ile karşılaştırıldığında ayırt edilemez15 (Şekil 3I). Bu sonuçlar leptin büyük olasılıkla farelerde isocaloric IF aracılı vücut ağırlığı azaltma karıştığını göstermektedir.
Isocaloric IF tarafından verilen en önemli metabolik fayda gelişmiş glikoz homeostazıdır. Şekil 4A,B,C,D,HFD-IF farelerinde gösterildiği gibi glukoz homeostazında önemli bir iyileşme görüldü. GTT, IF-tedavi edilen farelerde kan şekerinin daha hızlı temizlendiğini, ITT'nin ise HFD-IF farelerinde HFD-AL veya HFD-PF farelere göre daha yüksek insülin duyarlılığı saptandığını gösterdi. Beklenmedik bir şekilde, IF aracılı ağırlık azaltmadaki başarısızlıklara rağmen Ob-IF hayvanları GTT'deki daha küçük glikoz gezileri ile glikoz kullanımında ob-PF farelere göre önemli ölçüde iyileştirilmiş glikoz kullanımı sergilediler(Şekil 4E),insülin duyarlılığı ise Ob-IF ve Ob-PF fareler arasında ayırt edilemezdi(Şekil 4F). Ob-IF farelerde bu gelişmiş glikoz homeostazı büyük olasılıkla glukagon benzeri peptid-1 plazma düzeyinde artışlar aracılık edilir (GLP-1) ve glikoz uyarılmış insülin salgısı (veriler gösterilmez)15. Genel olarak, bu 2:1 IF protokolü ve uygun kalori-bağımsız PF kontrolü kullanarak, yabani tip ve ob /ob farelerde izokalorik IF metabolik faydalarını gösterdik.
Yabani tip farelerde IF'nin metabolik etkilerinden biri, enerji harcamalarını tahmin etmek için kullanılan toplam O2 tüketiminin daha yüksek olmasıdır(Şekil 5A,B). O2 tüketimindeki bu yükseklik, AL farelerine kıyasla sadece IF farelerinde beslenme döneminde, ancak açlık döneminde bulunmaz. Artan enerji harcaması büyük ölçüde yağ termogenez aracılık edildi, beyaz yağ dokularının esmerleştirilmesi ve kahverengi yağ dokusunun aktivasyonu gibi (veriler gösterilmez)8,16. IF aracılı yağ termogenezi muhtemelen IF'e maruz kalan yabani farelerin AL farelere kıyasla gıda alımında hiçbir fark olmadan vücut ağırlığı nın azaldığını açıklar. Öte yandan, IF ob /ob farelerde O2 tüketimini artırmayı başaramadı(Şekil 5C-D),ve hatta oruç döneminde enerji harcamalarında azalmaya yol açtı. Ob/ob farelerde IF'ye bağlı yağ termogenezi sürekli olarak tamamen ortadan kaldırılmıştır (veriler gösterilmemiştir). Bu veriler, farklı genetik ve çevresel geçmişe sahip bireyler için farklı çalışabileceğinden IF'nin olası bir sınırlaması olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: 24 saat oruç tan sonra beslenme analizleri ve 1:1 ile 2:1 IF arasında karşılaştırma. (A) Farelerin 24 saat oruç tan önce ve sonra günlük vücut ağırlığı değişiklikleri (n = 10). (B) 24 saat oruç tan önce ve sonra günlük enerji alımı (n = 5 kafes; kafes başına 2 fare). (C) Alternatif gün oruç (yani., 1 gün beslenme/1 gün oruç, 1:1 IF) ve 2:1 aralıklı oruç (yani, 2 gün beslenme/1 gün oruç) arasında enerji alımının karşılaştırılması. 1:1 IF rejiminde, gıda alımının sadece ~%80'i, 2 günlük besleme gününe kıyasla yeniden beslemenin sonraki 1 gününde telafi edilebildi. Öte yandan, 2 günlük yeniden besleme yapıldığında enerji alımının %99'u elde edilirken, 3 günlük beslenme ile karşılaştırıldığında. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Bu rakam Kim ve ark.8'inizniyle çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Izocaloric 2:1 IF rejiminin şematik illüstrasyonu. PF kontrolü için, IF ile tedavi edilen fareler tarafından beslenme 2 gün boyunca tüketilen gıda miktarı üç eşit bölüme ayrılır, daha sonra bir sonraki döngüsü sırasında PF fareler için günlük olarak sağlanır. AL = reklam libitum; PF = çift besleme. Bu rakamın bir kısmı Kim ve ark.8'inizniyle çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Al, IF ve PF etkilerinin vücut ağırlığı, gıda alımı ve yabani tip ve ob/ob fareler arasındaki vücut kompozisyonu üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması. (A,B,C) Vücut ağırlığı, gıda alımı ve normal diyet altında AL veya IF tedavi yabani tip fareler vücut kompozisyonu (ND) veya yüksek yağlı diyet (HFD) IF rejimi 16 hafta boyunca. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir(ND-AL: n = 7; ND-IF: n = 8; HFD-AL: n = 7; ve HFD-IF: n = 8); öğrenci-Newman-Keuls post-hoc analizi ile bir veya iki yönlü ANOVA; **p < 0,01 vs. HFD-AL. (D,E,F) VÜCUT ağırlığı, gıda alımı ve PF ve IF fareler yüksek yağlı diyet (HFD) if rejimi 12 hafta boyunca beslenen vücut kompozisyonu. (PF: n = 6 ve IF: n = 6); iki kuyruklu unpaired Öğrencinin t-testi; *p < 0,05 vs. HFD-PF; NS = önemli değil. (G,H,I) Vücut ağırlığı, gıda alımı ve AL, PF veya IF-tedavi ob / ob fareler normal chow ile beslenen vücut kompozisyonu (Ob-AL: n = 4; Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); Ob-AL vs. Ob-PF: *p < 0.05; Ob-AL vs. Ob-IF: *p < 0.05; Ob-PF vs. Ob-IF. Paneller A-F Kim ve ark.8izni ile çoğaltıldı. Paneller G-I Kim ve ark.15izni ile çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hem yabani tip hem de ob/ob farelerde IF tarafından geliştirilmiş glikoz homeostazı. (A,B) 16 haftalık IF rejiminden sonra HFD-AL ve HFD-IF yabani farelerde intraperitoneal GTT ve ITT. Inset eğri (AUC) altında alan gösterir; *p < 0.05 vs. HFD-AL. (C,D)GTT ve ITT HFD-PF'de HFD-IF vahşi tipi farelere göre 12 haftalık IF rejimi. Inset AUC gösterir; *p < 0.05 vs. HFD-PF. (E,F) GTT ve ITT Ob-IF'de 16 haftalık IF rejiminden sonra Ob-PF farelere göre. Inset AUC gösterir (*p < 0.05 vs. Ob-PF). Paneller A-D Kim ve ark.8izni ile çoğaltıldı. Paneller E ve F Kim ve ark.15izni ile çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: IF ile tedavi edilen yabani tip ve ob/ob farelerde enerji harcama analizi. (A) Yabani tip farelerde 2:1 IF döngüsü sırasında O2 tüketiminin izleri(yani, 1 günlük oruç ve ardından 2 günlük beslenme). (B) Oruç, beslenme sırasında saatte Ortalama O2 tüketimi ve 2:1 IF döngüsü. Veriler ortalama ± SEM (HFD-AL: n = 6; ve HFD-IF: n = 12); *p < 0,05 vs. HFD-AL. (C) O2 2:1 IF bir döngü sırasında ob / ob farelerin tüketim izleri. (D) Oruç, beslenme sırasında saatte 2tüketiminin ortalaması ve 2:1 IF (Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); *p < 0,05 vs. Ob-PF. Panel B Kim ve ark.8izni ile çoğaltıldı. Paneller C ve D Kim ve ark.15izni ile çoğaltıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iyi belgelenmiştir ki IF insan ve hayvanlarda çeşitli hastalıklar üzerinde yararlı sağlık etkileri sağlar8,15,16,17,18,19. Onun altta yatan mekanizmaları, otofaji ve bağırsak mikrobiyomu gibi, son zamanlarda açıklığa kavuşturulmuş edilmiştir. Sunulan protokol, farelerde diyetkaynaklı obezite ve ilişkili metabolik disfonksiyona karşı IF'nin kaloriden bağımsız metabolik faydalarını araştırmak için farelerde bir isokalorik 2:1 IF rejimini tanımlar. Alternatif gün oruç aksine (1:1 IF) genel kalori alımında bir azalma ile sonuçlanan protokol6,7, 2:1 IF rejimi refeeding 1 gün daha sağlayan yabani tip farelerde izokalorik durumun bakım sağlar.
Ayrıca, 1:1 IF ile karşılaştırıldığında, 2:1 IF rejimi farelerde olası açlık aracılı stres veya torpor azaltabilir20 ve aynı zamanda popüler bir diyet yöntemi ile karşılaştırılabilir, 5:2 diyet2. Etkileri test edilmemiş olsa da, rejim ek besleme günleri sağlayarak değiştirilebilir (örn. 3:1 veya 4:1 IF). Ayrıca, sunulan bu protokol kolayca bir saatlik ölçekte zaman sınırlı beslenme (TRF), hangi gıda erişimi aktif faz sırasında günde 8 saat ile sınırlıdır ayarlanabilir21, hangi bir izokalorik diyet rejimi elde etmek için bilinen ve HFD kaynaklı obezite ve diyabet karşı metabolik faydalar sağlamak19,21,22.
Beslenme analizinde gösterildiği gibi(Şekil 1B), 24 saat oruç tan hemen sonra hiperphagic davranış, izokalorik IF'yi sağlayan yabani tip farelerde yavaş yavaş azalır. Ancak, bu izokalorik durum ob / ob farelerde elde edilemez, onlar leptin sinyal aracılı tokluk ve enerji metabolizması eksikliği gibi, sürekli hiperphagic fenotip yolaçan 23,24. Bu nedenle, bir IF denemesi gerçekleştirmeden önce, ilgi çekici fare modelinin besleme davranışını incelemeniz önerilir. Hiperphagic fare modeli (örn. ob/ob,db/db, Sim1 +/- ) 24,25,26, bu protokolde açıklandığı gibi, bir çift besleme grubunun izokalorik deneysel kontrol olarak istihdamının doğru karşılaştırmalar yapılması için önemli olan hiperphagic fare modelinin (örn. ob/ob, db/db, Sim1+/-) etkilerini incelemek için önemlidir. Ayrıca hipofhagic fenotip (örneğin, melanin içeren hormon KO fareler)27ile bir fare modeli test ederken dikkatli planlama gerektirir.
IF çalışmaları için göz önünde bulundurulması gereken önemli bir faktör, farelerdeki çeşitli fizyolojik ve davranışsal parametreleri etkileyen konut sıcaklığıdır. Özellikle, soğuk maruz kalma (4-6 °C) önemli ölçüde çekirdek vücut Sıcaklığı28korumak için enerji alımını artırır. Buna karşılık, ısı kazancının ısı kaybı ile dengelendiği termonötr koşullarda (30 °C) gıda tüketimindeki azalma lar belirgin bir şekilde8'eindirilir. Metabolik sonuçlara göre, soğuk maruziyet, termonötr durum tarafından engellenen yağ termogenezine neden olur. Bu nedenle, konut sıcaklığının IF'nin metabolik fenotiplerini ve uygun beslenmeyi etkilemesi beklenmektedir:izokalorik IF elde etmek için oruç oranı.
Nitekim, daha önce izokalorik 2:1 IF termonötr koşullarda elde edilebilir gösterilmiştir, IF ve AL grupları arasında gıda alımında farklılıklar olmadan diyet kaynaklı obezite ve metabolik disfonksiyon gelişmiş metabolik sağlık yol8. Ancak soğuk maruziyet altındaki farelerde hiperfhagic fenotip göstereceği için soğuk sıcaklıklarda 2:1 oranı ile izokalorik IF elde edilemeyebilir, bu da IF grubunda yetersiz beslenmeye yol açar. Soğuk maruziyet ve IF obezite ile mücadeleye yardımcı benzer metabolik sonuçlar ve mekanizmalar (yani, yağ termogenez ve geliştirilmiş glikoz homeostazı) görüntülediğinden, metabolik etkiyi en üst düzeye çıkarmak için bu iki müdahaleyi birleştirme ilgi vardır. Bu nedenle, bunu doğru bir şekilde test etmek için, if deneyi çalıştırmadan önce besleme analizinin yapılmasını ve soğuk maruziyet altında çift besleme kontrol grubunun kullanılması önerilir.
IF çalışmalarının sonuçlarını potansiyel olarak etkileyebilecek diğer faktörler arasında konut yoğunluğu yer almaktadır. Daha yoğun ev farelerde azaltılmış gıda tüketimi gösterdi önceki çalışmaya benzer29, beş bir kafes fareler iki bir kafes (yayınlanmamış sonuçlar) bu önemli ölçüde daha az gıda tüketilen. Buna ek olarak, beş farebarındıran bir kafesin içindeki sıcaklık 1-2 °C daha yüksek olduğundan, gövde yoğunluğunun ortamsıcaklığını önemli ölçüde etkilediği gösterilmiştir. Bu çalışma, konut yoğunluğunun gıda alımını önemli ölçüde etkilemediği sonucuna varılsa da (5 hafta boyunca incelendiğinde), 12-16 hafta süren bir IF çalışmasında, kafesin içindeki sıcaklık konut yoğunluğundan etkilenen gıda alımını ve enerji metabolizmasını etkilemeye devam edebilir. Birlikte, bir kafeste barındırılen farelerin aynı sayıda tutmak ve bir çalışma boyunca kafes başına sayısını değiştirmeyi en aza indirmek önemlidir.
Özetle, bu rapor farelerde izocaloric 2:1 IF test etmek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol gösterir. Mevcut çalışma diyet kaynaklı obezite ve metabolik disfonksiyon IF metabolik yararları üzerinde duruldu rağmen, kolayca kardiyovasküler gibi diğer koşullara karşı izokalorik IF koruyucu ve terapötik etkilerini araştırmak için adapte edilebilir ve nörolojik hastalıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
K.-H.K Kanada Hibe-in-Aid (G-18-0022213), J. P. Bickell Vakfı ve University of Ottawa Heart Institute Start-up fonu kalp ve inme vakfı tarafından desteklendi; H.-K.S. Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (PJT-162083), Reuben ve Helene Dennis Scholar ve Sun Life Financial New Investigator Award for Diabetes Research from Banting & Best Diabetes Centre (BBDC) ve Natural Sciences'ın bağışları ile desteklendi. ve Kanada Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. Ottawa Üniversitesi Kardiyoloji Araştırma Fonu'ndan bir burs la desteklenmiştir. J.H.L. NSERC Doktora Bursu ve Ontario Lisansüstü Bursu ile desteklenmiştir. Y.O., UOHI Lisansüstü Ödülü ve Kraliçe Elizabeth II Bilim ve Teknoloji Yüksek Lisans Bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
References
- Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
- Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
- Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
- Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
- Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
- Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
- Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
- Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
- Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
- Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
- Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
- Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
- Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
- Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
- Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
- Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
- Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
- Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).
