Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

جهاز الأمعاء/الكبد الدقيق فيزيولوجيا لتقييم الأدوية الدوائية والسمية

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

لقد كشفنا نظام microphysiological (MPS) مع الأمعاء والكبد organoids لاسيتامينوفين (APAP). توضح هذه المقالة طرق الإنتاج العضوي وتقييمات الملكية الدوائية والسمية APAP في MPS. كما يصف تحليل وظائف الأنسجة اللازمة للتحقق من صحة النتائج.

Abstract

ومن المتوقع أن يكون أداء النظم الدقيقة الفيزيولوجية التي أدخلت مؤخراً التي تزرع العضيات البشرية أفضل من أداء الحيوانات في مرحلة الاختبارات قبل الفحصي لعملية تطوير المخدرات لأنها بشرية وراثياً وتختبأ التفاعل بين الأنسجة. في هذه الدراسة، تم دمج حاجز الأمعاء البشرية (التي تحاكيها ثقافة شارك في زراعة الخلايا كاكو-2 وHT-29) والكبد المكافئ (التي تحاكيها spheroids مصنوعة من خلايا هيباتج متمايزة وخلايا نجمية الكبدية البشرية) في جهاز microfluidic لرقاقة جهازين (2-OC) لتقييم بعض الأسيتامينوفين (APAP) الدوائية (PK) والخصائص السامة. وكان MPS ثلاث جمعيات: الأمعاء فقط 2-OC، الكبد فقط 2-OC، والأمعاء / الكبد 2-OC مع نفس وسائل الإعلام تضخ كلا organoids. بالنسبة لتقييمات PK، قمنا بسد APAP في وسائل الإعلام في نقاط زمنية محددة مسبقاً بعد إدارتها إما فوق الحاجز المعوي (محاكاة الطريق الفموي) أو في وسائل الإعلام (محاكاة الطريق الوريدي)، عند 12 ميكرومتر و2 ميكرومتر على التوالي. تم تحليل عينات الوسائط من خلال عكس مرحلة اللونية السائلة عالية الضغط (HPLC). تم تحليل العضيات من أجل التعبير الجيني، وقيم TEER، للتعبير عن البروتين والنشاط، ثم تم جمعها، وإصلاحها، وتقديمها إلى مجموعة من التقييمات المورفولوجية. كان أداء تقنية MTT جيدًا في تقييم الجدوى العضوية ، ولكن التحليلات عالية المحتوى (HCA) تمكنت من اكتشاف أحداث سامة مبكرة جدًا استجابة لعلاج APAP. لقد تحققنا من أن تدفق الوسائط لا يؤثر بشكل كبير على امتصاص APAP في حين أنه يحسن بشكل كبير وظائف الكبد المكافئة. ويمكن محاكاة امتصاص الأمعاء البشرية APAP والتمثيل الغذائي الكبدي في MPS. إن الارتباط بين بيانات MPS وفي نمّجة السيليكو لديه إمكانات كبيرة لتحسين قابلية التنبؤ بالأساليب المختبرية وتوفير دقة أفضل من النماذج الحيوانية في الدراسات الدوائية السمية.

Introduction

ونظراً للاختلافات الجينية والبروتيومية، فإن النماذج الحيوانية لها قيمة تنبؤية محدودة بالنسبة لعدة نتائج بشرية. وعلاوة على ذلك، فهي تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة ومشكوك فيها أخلاقيا1. MPS هي تقنية جديدة نسبيا تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل السريرية. فهي الأجهزة microfluidic زراعة organoids (المحاكاة الاصطناعية وحدات وظيفية من الأجهزة) في ظل تدفق وسائل الإعلام التي تعزز الاتصالات organoid organoid. Organoids مصنوعة من الخلايا البشرية زيادة صلة الترجمة2،3،4. ومن المتوقع أن MPS لأداء أفضل من الاختبارات الحيوانية لأنها بشرية وراثيا وتكخيص التفاعل بين الأنسجة. عندما تعمل بكامل طاقتها، فإن MPS تقديم نتائج أكثر وضوحا، في سرعة أعلى وأقل التكاليف والمخاطر4. العديد من المجموعات النامية MPS لعدة أغراض, وخاصة نماذج المرض لاختبار فعالية المخدرات.

مستوى التعرض هو واحد من أهم المعلمات لتقييم فعالية الدواء وسميته5،6،7،8،9،10،11،12. MPS يسمح التكامل العضوي الذي يحاكي التعرض النظامي ومن المتوقع أن يكون أداؤه أفضل من ثقافة الأنسجة البشرية التقليدية 2D. هذه التكنولوجيا يمكن أن تحسن بشكل كبير التنبؤ بالمجمع امتصاص الأمعاء والكبد الأيض4.

و MPS دمج نموذج معادل الإنسان من الأمعاء والكبد هو نقطة انطلاق جيدة، معتبرا الدور المركزي لهذين الجهازين في التوافر البيولوجي للأدوية والتعرض الجهازي13,14,15. APAP هو دواء جذاب لدراسة MPS دون مكافئ الكلى لأن استقلابه يتم بشكل رئيسي من قبل الكبد16,17.

و2-OC هو جهاز microfluidic من غرفتين مناسبة لثقافة اثنين من الأنسجة البشرية المختلفة المكافئة / organoids مترابطة بواسطة microchannels16. من أجل محاكاة في المختبر البشري عن طريق الفم / الحقن الوريدي من المخدرات وتقييم آثار عبر الحديث بين الأمعاء والكبد مكافئات على المستحضرات الدوائية APAP، إلى جانب وظيفة organoids ومقومات البقاء، تم تنفيذ ثلاثة جمعيات MPS مختلفة: (1) "الأمعاء 2-OC MPS" تتألف من الأمعاء مكافئ يستند في إدراج ثقافة تحتوي على Caco-2 + HT-29 الخلايا coculture، دمجها في الجهاز 2-OC. (2) "الكبد 2-OC MPS" تتألف من spheroids الكبد مصنوعة من HepaRG + HHSteC (خلايا هيبيت الكبدية الإنسان) متكاملة في الجهاز 2-OC؛ و (3) "الأمعاء / الكبد 2-OC MPS" تتألف من ما يعادل الأمعاء في مقصورة جهاز واحد التواصل مع مكافئ الكبد في الآخر من خلال تدفق وسائل الإعلام من خلال القنوات microfluidic.

تم إجراء جميع المقايسات تحت ثابت (لا تدفق) وديناميكية (مع تدفق) الشروط بسبب تأثير المحفزات الميكانيكية (ضغط، وتمتد، والتشيد) على الخلية قابلية البقاء والوظائف18،19،20. هذه المادة يصف بروتوكول لAP البصرية عن طريق الفم / الحقن وتقليد الإدارة والامتصاص / الأيض والتحليلات السمية في 2 - OC MPS التي تحتوي على الأمعاء البشرية والكبد ما يعادل نماذج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنتاج مكافئات الأنسجة للزراعة في 2-OC

  1. إنتاج مكافئ حاجز الأمعاء الدقيقة
    1. الحفاظ على خلايا Caco-2 وHT-29 باستخدام الأمعاء ما يعادل المتوسطة: DMEM تكمل مع 10٪ FBS، 1٪ البنسلين وstreptomycin، و 1٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية، والتي سميت باسم "DMEM S" في هذه المخطوطة.
    2. إزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع 1X DPBS وإضافة 8 مل من 0.25٪ تريبسين / EDTA لتفكك كاكو-2 الخلايا التي تزرع في قارورة ثقافة الخلية (175 سم2). احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية ووقف رد الفعل عن طريق إضافة على الأقل حجم مزدوج من مثبطات التربسين. تنفيذ نفس الإجراء لخلايا HT-29، وضبط وحدات التخزين الكاشف منذ حاجة إلى كمية أصغر من هذه الخلايا ويتم الاحتفاظ بها في قارورة أصغر (75 سم2).
    3. الطرد المركزي في 250 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة افرنح من كلا الأنابيب، وإعادة تثبيت كريات الخلية في 10 مل من خلايا العد DMEM S. ، وضمان صلاحية الخلية أعلى من 80٪. تكامل Aseptically إدراج ثقافة الخلية في لوحة 24-well شغلها سابقا مع 400 ميكرولتر من DMEM S في بئر في الجانب القاعدي (الذي يمثل مجرى الدم البشري).
    4. شارك في زراعة كاكو-2 و HT-29 الخلايا بنسبة 9:121. استخدام 2.25 × 105 كاكو-2 و 2.5 × 104 HT-29 الخلايا إلى كل ما يعادل الأمعاء في حجم النهائي من 200 ميكرولتر من DMEM S. ضبط أرقام الخلايا وحجم وفقا لعدد المطلوب من organoids. مزيج بعناية.
    5. ماصة 200 μL من حل الخلية في كل جانب إدراج في نوع من نوعها (الذي يمثل الجانب التجويف المعوي الإنسان)، البذر 250،000 الخلايا لكل إدراج. شارك في زراعة الخلايا في إدراج لمدة ثلاثة أسابيع22. تغيير المتوسطة على الأقل ثلاث مرات في الأسبوع، الطامحة من الجانبين على حد سواء apical والبصلة مع ماصة باستور العقيمة، مع الحرص على عدم إلحاق الضرر حاجز الخلية سليمة.
      ملاحظة: المضي قدما في الطموح على الجانب apical، حتى لا تلمس حاجز الخلية (الpirateate بدعم ماصة باستور على حافة من البلاستيك من إدراج الخلية).
    6. تحقق من تشكيل أحادية ضيق من خلال قياس TEER (المقاومة الكهربائية عبر الثانية) كل ثلاثة أيام باستخدام فولتمتر23، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. تنفيذ فارغة، وقياس المقاومة عبر خلية ثقافة إدراج دون خلايا، ولكن مع نفس المتوسطة الخلية وعلى نفس لوحة الخلية.
      2. حساب مقاومة الأنسجة عن طريق طرح المقاومة فارغة من مقاومة مكافئ الأنسجة، وضرب من قبل مساحة السطح الفعالة للغشاء مرشح (0.6 سم2). A جيدة مقاومة حاجز الأمعاء في مجموعة من 150 إلى 400 Ω •سم2.
        ملاحظة: بعد 21 يوما يجب أن تكون الخلايا متمايزة تماما، وتشكل الحاجز المعوي، وبالتالي فإن مكافئات الأمعاء جاهزة لدمجها في MPS.
  2. الكبد يعادل الإنتاج
    1. الحفاظ على خلايا HepaRG باستخدام الوسط المكافئ للكبد، وهو متوسطة E وليام تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية، 2 M L-الجلوتامين، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل ستربتوميسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين البشري و 5 × 10-5 M هيدروكورتيزون، و يدعى "وليامز E S" في هذه المخطوطة. تجديد وسائل الإعلام HepaRG كل 2-3 أيام والحفاظ على ثقافة الخلية لمدة أسبوعين لبدء التمايز في الكبد وcholangiocytes.
    2. بعد الأسبوعين الأولين، إضافة 2٪ DMSO إلى المتوسط HepaRG لمدة أسبوعين إضافية لإكمال تمايز الخلية24،25. Grow HHSTeC في وسائط الخلايا النجمية (SteC CM) ، باستخدام قارورة ثقافة الخلية المغلفة بـ Poly-L-lysine ، وتغيير الوسائط كل يومين أو ثلاثة أيام.
    3. إزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع 1X DPBS وإضافة 8 مل من 0.05٪ تريبسين / EDTA، لتفكك خلايا HepaRG التي تزرع في قارورة ثقافة الخلية (175 سم2). احتضان لمدة 5 إلى 10 دقيقة في 37 درجة مئوية ووقف رد الفعل عن طريق إضافة ما لا يقل عن ضعف حجم مثبطات التربسين. أداء الشيء نفسه لHHSTeC، وتكييف حجم الكاشف منذ هناك حاجة إلى كمية أصغر من هذه الخلايا، ويمكن الحفاظ عليها في قارورة أصغر (75 سم2).
    4. الطرد المركزي على حد سواء في 250 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة فائقة وإعادة تعليق كريات الخلية في وليامز E S المتوسطة. عد الخلايا، وضمان صلاحية الخلية أعلى من 80٪.
    5. توليد spheroids الكبد الجمع بين خلايا HepaRG وHHSTeC بنسبة 24:1، على التوالي، في وليامز E S المتوسطة16. إضافة 4.8 × 104 هيبارج متمايزة و 0.2 × 104 HHSTeC لتكوين كل 50000 خلية الكبد، في حجم 80 μL. ضبط أرقام الخلايا وحجم وفقا لعدد المطلوب من spheroids. مزيج بعناية.
    6. باستخدام ماصة متعددة القنوات، الاستغناء 80 ميكرولتر من تجمع الخلايا مجتمعة في كل بئر من 384 الألواح الدقيقة spheroid، والتي لديها جولة هندسة قاع جيد.
      ملاحظة: بعد أربعة أيام، يتم تشكيل طاردات من حوالي 300 ميكرومتر.
    7. باستخدام نصائح واسعة تتحمل، نقل spheroids الكبد إلى فائقة منخفضة مرفق 6 لوحات جيدا، والذي يسمح المطلوبة "واحدا تلو الآخر" العد.

2. التكامل من الأمعاء والكبد مكافئات في 2-OC MPS

  1. الأمعاء 2-OC MPS الجمعية لامتصاص فحص
    1. ماصة 500 ميكرولتر من DMEM S في مقصورة أكبر من 2-OC و 300 ميكرولتر في أصغر واحد. pirate وسائل الإعلام البصين وapical من كل ما يعادل حاجز معوي في لوحات 24 جيدا. باستخدام ملقط معقمة، دمج إدراج واحد لكل 2-OC الدائرة، وتحديدا في المقصورة أكبر. تطبيق 200 μL من الأمعاء المتوسطة في الجانب apical.
      ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات عند دمج organoids في MPS.
    2. قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم، والتي يجب أن تكون متصلة بإمدادات الهواء المضغوط. تعيين المعلمات: ضغط، تقريبا، ±300 شريط وتواتر ضخ 0.3 هرتز. بدء تدفق 24 ساعة قبل إدارة المادة اختبار. في اليوم التالي، قم بإجراء علاج APAP.
  2. الكبد 2-OC الجمعية MPS ل فحص التمثيل الغذائي
    1. Pipette 650 μL من وليامز E S في المقصورة الكبيرة و 350 ميكرولتر في المقصورة الأصغر ، والتي سوف تتلقى الزفيرويدات. في ال [ا-رت-6- لور], عدّ ال [سهيرويدسّسّيّرّسّيّر]. كل مكافئ الكبد يتكون من عشرين spheroids26. دمج 20 مكافئ الكبد لكل دائرة، وذلك باستخدام نصائح واسعة تتحمل، والذي يسمح لنقل organoids فقط، في المقصورة الأصغر من 2-OC.
    2. قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم، والتي يجب أن تكون متصلة بإمدادات الهواء المضغوط. تعيين المعلمات: ضغط، تقريبا، ±300 شريط وتواتر ضخ 0.3 هرتز. بدء تدفق 24 ساعة قبل إدارة المادة اختبار. في اليوم التالي، قم بإجراء علاج APAP.
  3. الأمعاء / الكبد 2-OC الجمعية MPS لامتصاص والاستقلاب
    1. الجمع بين وسائل الإعلام اثنين (الأمعاء والكبد) في نسبة 1:4، وهو ما يعني 200 ميكرولتر من DMEM S في الجانب apical الأمعاء و 800 μL من وليامز E S في الجانب القاعدي. دمج الأمعاء والكبد مكافئات, في وقت واحد, في 2-OC.
    2. قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم، والتي يجب أن تكون متصلة بإمدادات الهواء المضغوط. تعيين المعلمات: ضغط، تقريبا، ±300 شريط وتواتر ضخ 0.3 هرتز. بدء تدفق 24 ساعة قبل إدارة المادة اختبار. في اليوم التالي، قم بإجراء علاج APAP.
      ملاحظة: بالنسبة لجميع التجارب، قم بإجراء كل نقطة زمنية في ثلاث ية، مما يعني ثلاث دوائر منفصلة 2-OC (أي أجهزة 1/2 2-OC). الحجم الكلي لكل دائرة 2-OC هو 1 مل.

3. إعداد الأسيتامينوفين (APAP)

  1. إعداد حل الأسهم APAP، حل APAP في الإيثانول المطلق. في يوم التجربة، تمييع APAP في الوسط المعني (حل APAP)، إلى تركيز 12 ميكرومترًا لـ "الإدارة الفموية" و2 ميكرومتر لـ "الإدارة الوريدية".
  2. تأكد من أن التركيز النهائي من الإيثانول في التحكم في السيارة والحل العلاج هو 0.5٪ لكلا الإدارتين. للسيطرة الإيجابية (100 mM APAP)، وتركيز الإيثانول هو 2٪.

4- إدارة المواد الاختبارية وأخذ عينات من وسائط الإعلام

  1. APAP "عن طريق الفم" الإدارة وأخذ عينات وسائل الإعلام
    1. التعرق وسائل الإعلام القاعدي و apical من كل ما يعادل حاجز معوي في 2-OC. pipette 500 μL من المتوسط المناسب الثقافة في المقصورة الكبيرة في الجانب الباسطوي العضوي و 300 ميكرولتر في المقصورة الصغيرة.
    2. تحقق من وجود فقاعات والمضي قدما مع حاجز معوي العلاج المكافئ مع مادة اختبار في الجانب apical، محاكاة الإدارة عن طريق الفم. محاكاة APAP "عن طريق الفم" الإدارة بإضافة 200 ميكرولتر من 12 μM حل APAP على الجانب apical من إدراج ثقافة الأمعاء، والذي يمثل الأمعاء "الجانب التجويف"(الشكل 1B). قم بتوصيل MPS بوحدة التحكم.
    3. جمع الحجم الكلي من apical ومن الجوانب البصين في النقاط الزمنية التالية: 0 h, 5 دقيقة, 15 دقيقة, 30 دقيقة, 1 ساعة, 3 ح, 6 h, 12 h, و 24 h15,27. تنفيذ جميع التجارب في ثلاث ية، في ظروف ثابتة وديناميكية، وجمع كل عينة، من كل ثلاثية، في microtube منفصلة. تحليل العينات باستخدام HPLC / الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: عينات منفصلة من apical و basolateral.
  2. APAP "عن طريق الوريد" الإدارة وأخذ عينات وسائل الإعلام
    1. محاكاة "الوريد" الطريق عن طريق إدارة 2 μM حل APAP مباشرة في مقصورة الكبد. استلهم جميع المحتوى المتوسط 2-OC. Pipette 650 μL من وليامز E S التي تحتوي على مادة الاختبار في المقصورة الكبيرة و 350 ميكرولتر من نفس الوسائط في المقصورة الأصغر التي تحتوي على 20 spheroids. جمع جميع وحدات التخزين في النقاط الزمنية التالية: 0 ح، 30 دقيقة، 1 ح، 2 ح، 3 ح، 6 ح، 12 ح، و 24 ح27،28.
    2. إجراء جميع التجارب في ثلاث ية، في ظروف ثابتة وديناميكية. جمع كل عينة، من كل ثلاثية، في microtube منفصلة. تحليل العينات باستخدام HPLC / الأشعة فوق البنفسجية.

5. الأجهزة والظروف الكروماتوغرافية

  1. تحليل HPLC
    1. تعيين كافة المعلمات ذات الصلة لتحليل HPLC وفقا للجدول 1.
    2. تصفية المرحلة المتنقلة من خلال مرشح غشاء 0.45 ميكرومتر تحت فراغ. تصفية العينات من خلال 0.22 ميكرومتر المسام حجم الفهداح PVDF حقنة (قطرها 13 مم) وتخزينها في قارورة. بدء القياس.
  2. حلول المخزون ومعايير المعايرة وعينات مراقبة الجودة (QC)
    1. إعداد 10 mM من حلول الأسهم APAP في خلات الأمونيوم العازلة (100 mM، pH 6.8) والمزيد من التخفيف مع DMEM S وS ويليامز E وسائل الإعلام خلية المخفف مع المخزن المؤقت خلات الأمونيوم (1:1، الخامس / الخامس) لتحقيق حلول العمل تتراوح بين 0.25 إلى 100.00 μM.
    2. وتشمل مجموعة من عينات المعايرة في ثلاث 333 وكذلك عينات مراقبة الجودة على أربعة مستويات في ثلاث 33. إعداد هذه المعايير عن طريق التخفيف المسلسل.
    3. إنشاء منحنيات معايرة من مناطق الذروة APAP مقابل التركيزات القياسية الاسمية APAP. تحديد الانحدار الخطي المناسب لكل منحنى معايرة. تقييم جودة النماذج المختلفة للمعايرة عن طريق الفحص البصري ومعامل الارتباط والدقة داخل وفيما بين المدى وقيم الدقة.
    4. حقن عينات فارغة من DMEM S وS Williams E وسائل الإعلام المخفف في خلات الأمونيوم العازلة (1:1، v/v) في sextuplicate. إعداد ثلاثية من عينات مراقبة الجودة في DMEM S وS وليامز E وسائل الإعلام المخففة مع المخزن المؤقت خلات الأمونيوم (1:1، v/v) لتركيزات APAP من 0.50 (LOQ)، 4.50، 45.00 و 90.00 μM.
    5. تأكد من إعداد عينات مراقبة الجودة من محلول جديد للأسهم، يختلف عن ذلك المستخدم لإنشاء منحنى قياسي. استخدام عينات مراقبة الجودة للتحقيق في الاختلافات داخل وفيما بين.
  3. إجراءات المصادقة
    1. تنفيذ التحقق من صحة الأسلوب الحيوي في مجال الصحة بعد الإجراءات التي تم الإبلاغ عنهاسابقاً 29,30. تنفيذ مسارات الكروماتوغرافية في خمس أو ست مناسبات منفصلة، والنظر وليامز E S وDM S وسائل الإعلام ثقافة الخلية، على التوالي.
    2. تأكد من أن نقاط المعايرة التي تتراوح بين 0.25 و 100.00 μM من APAP، في وسائط ثقافة الخلايا DMEM S أو Williams E S المخففة في حاجز خلات الأمونيوم (1:1، v/v)، يتم رسمها استنادًا إلى مناطق الذروة في APAP (المحور ص) مقابل التركيزات الاسمية ذات الصلة (المحور x). قارن بين منحدرات منحنيات المعايرة القياسية هذه مع منحدرات منحنى المعايرة المعدة في مخزن خلات الأمونيوم. تأكد من أن جميع منحنيات المعايرة لها قيمة ارتباط لا تقل عن 0.998.
    3. تحديد الدقة والدقة (داخل و intra-تشغيل) للاندار في مصفوفة بديلة باستخدام تكرارات في أربعة مستويات مختلفة LLOQ، منخفضة، متوسطة، وعالية الجودة في خمسة أو ستة أيام مختلفة. تنفيذ قياسات الدقة والدقة داخل المدى في نفس اليوم في وسائط ثقافة الخلايا DMEM S أو Williams E S المخففة في مخزن خلات الأمونيوم (1:1، v/v) الذي يحتوي على 0.50 و4.50 و45.00 و90.00 ميكرومتر APAP تركيزات (ن = 3).
    4. تقييم كل مجموعة من عينات مراقبة الجودة التي تحتوي على تركيزات APAP من منحنيات المعايرة التي تم الحصول عليها مؤخرًا. اختبار الانتقائية من المقايسات من درجة فصل مجمع الفائدة والذرى الكروماتوغرافية الأخرى المحتملة الناجمة عن المكونات التداخل.
  4. الحد الأدنى من القياس الكمي (LLOQ) والحد من الكشف (LOD)
    1. تحديد الحد الأدنى من القياس الكمي (LLOQ) استناداً إلى الانحراف المعياري للإستجابة ونهج الميل. حساب باستخدام الصيغة 10α / S، حيث α هو الانحراف المعياري من تقاطع y و S هو ميل خط مستقيم تم الحصول عليها عن طريق رسم منحنيات المعايرة29،30. تقدير حد الكشف (LOD) مع الأخذ في الاعتبار 3.3 مرات الانحراف المعياري للفراغ ، مقسوما على منحدر منحنى المعايرة29،30.

6. الأنسجة مكافئات البقاء / وظائف

  1. MTT
    1. إجراء مقايسة MTT لتقييم قابلية البقاء في جميع الأوقات في كل من المقايسة MPS. كما التحكم السلبي، واستخدام وسائل الإعلام خلية زائد السيارة. كما السيطرة الإيجابية، وعلاج organoids مع APAP 100 mM و 1٪ صوديوم مخففة في وسط الخلية.
    2. نقل 20 spheroids من كل تكرار لآبار فردية في لوحة 96 جيدا، وتدرج ثقافة الخلية، التي تحتوي على مكافئات الأمعاء، إلى 24 لوحات خلايا جيدا، ووضع ما يعادل الأمعاء واحدة في البئر. اغسل مكافئات الأنسجة ثلاث مرات مع 1x DPBS.
    3. إضافة 300 μL من 1 ملغ / مل MTT الحل، المخفف في متوسطة الخلية المعنية، في بئر. احتضان لوحات لمدة 3 ساعة في ظروف ثقافة الخلية القياسية.
    4. إزالة حل MTT من كل جيدا بعناية عن طريق الأنابيب. استخراج MTT formazan من الأمعاء والكبد مكافئات باستخدام 200 ميكرولتر من ايزوبروبانول في كل ليلة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: قم بختم الغطاء لمنع التبخر.
    5. نقل 200 ميكرولتر من كل عظمى إلى كل منهما مسبقا تحديد جيدا في 96 جيدا لوحة اختبار الصغرى. استخدام الايزوبروبانول كفراغ.
    6. قراءة امتصاص formazan في قارئ لوحة في 570 نانومتر. حساب القدرة النسبية للخلايا على تقليل MTT (%) باستخدام متوسط الكثافة البصرية لكل نقطة زمنية ، مقارنة مع التحكم السلبي ، تعتبر 100 ٪ خلية البقاء.
  2. الكيمياء السيتوكيمية/علم الأنسجة
    1. إصلاح الأمعاء والكبد مكافئات, لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة, باستخدام 4% (ث/ الخامس) شبهformaldehyde في 0.1 M الفوسفات المالحة العازلة, درجة الحرارة 7.4. غسل organoids 5 مرات في المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في كل مرة. وصمة عار الأمعاء والكبد مكافئات مع tetramethylrhodamine isothiocyanate-phalloidin أو اليكسا فلور 647 phalloidin، 1:50 في برنامج تلفزيوني31.
    2. نقلها إلى أوك تجميد المتوسطة لبضع دقائق للتأقلم في RT قبل نقلها إلى النيتروجين السائل حتى تجميد كامل. تنفيذ عمليات اكشنات الكبد spheroids حول 10-12 μm سميكة، وذلك باستخدام cryostat.
    3. جبل أقسام الأنسجة في تصاعد المتوسطة مع DAPI. فحصها عن طريق المجهر الفلورية confocal.
    4. تجميد organoids بعد التثبيت لأداء الهماوكسيلين وeosin تلطيخ وفقا للبروتوكولات المعمول بها. قم بتركيب الشرائح مع متوسطة التركيب بعد تقطيع الأنسجة كما هو موضح أعلاه والتقط صورًا نسيجية باستخدام المجهر البصري.
  3. تحليل المحتوى العالي
    1. الميتوكوندريا وتلطيخ نووي للخلايا
      1. إعادة تكوين مسحوق مزال في DMSO لجعل 1 mm الميتوكوندريا تلطيخ الأسهم حل (على سبيل المثال، MitoTracker عميق الأحمر FM). مخزن ali ونقلت حل الأسهم في -20 درجة مئوية محمية من الضوء. تمييع 1 mm الميتوكوندريا تلطيخ الأسهم حل التركيز النهائي (200 nM) في قبل الدفء (37 درجة مئوية) الأنسجة المتوسطة دون مصل.
      2. إزالة وسائط ثقافة الخلية. إضافة حل تلطيخ الميتوكوندريا لتغطية تماما العينة واحتضان الخلايا لمدة 15-45 دقيقة في 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2.
      3. إزالة بعناية الميتوكوندريا تلطيخ حل العمل واستبدالها مع 2-4٪ paraformaldehyde التثبيت في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      4. شطف الخلايا الثابتة بلطف مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. كرر عملية الغسيل مرتين.
      5. إعداد 10 ملغ / مل (16.23 M) الحمض النووي تلطيخ محلول الأسهم عن طريق حل 100 ملغ من Hoechst صبغة 33342 في 10 مل من الماء فائقة السخاء.
        ملاحظة: يجب أن يكون حل المخزون على سعر أو تخزين محمي من الضوء عند -20 درجة مئوية.
      6. إعداد 0.2-2.0 ميكروغرام / مل الحمض النووي تلطيخ حل العمل في برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا المثبت مع حمض نووي تلطيخ حل العمل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. إزالة الحمض النووي تلطيخ حل العمل وشطف الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات. يجب أن تبقى الخلايا في برنامج تلفزيوني عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
    2. تحليل التلطّخات النووية والميتوكوندريا
      1. تحليل الخلايا باستخدام المجهر الفلوري مع مجموعات مرشح مناسبة لطخة الحمض النووي (λEx / λEm: 361/497 نانومتر) و stain الميتوكوندريا (λEx / λEm: 644/665 نانومتر). العثور على الخلايا عن طريق الحمض النووي إيجابية تلطيخ وقياس عدد الخلايا. كمي شدة الفلورية البقع الميتوكوندريا في الميتوكوندريا.
  4. قياسات مورفوميتري (حسابات السفئيات) في ImageJ
    1. تصدير عالية المحتوى تحليل (HCA) الصور كالملفات *.flex من برنامج كولومبوس. استيراد ملفات .flex كتدرج رمادي في ImageJ باستخدام المساعد تنسيقاتBio-Formats 32: ملف > استيراد > تنسيقات حيوية.
    2. في نافذة خيارات الاستيراد، حدد عرض Hyperstack وقم بتمكين قنوات الانقسام ضمن تقسيم إلى نوافذ منفصلة. سيسمح هذا الخيار بالوصول إلى كافة الملفات في قناة معينة (مثل DAPI و mitotracker وما إلى ذلك). لا تحدد استخدام المكدس الظاهري ضمن إدارة الذاكرة.
      ملاحظة: يفضل استخدام قناة DAPI كـ "غبار" في الصور حيث يتم تقليل الاستزراع في الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية (على سبيل المثال، 405 نانومتر).
    3. ضبط حجم البكسل(تحليل > تعيين مقياس) إذا لم يتم تحميله وفقًا للقيم المضمنة في الملف .flex. تطبيق مرشح طمس غاوسي لإزالة فائض من الضوضاء وتجنب المخالفات في كفاف الشكل. عملية > مرشحات > غاوسي طمس. قيمة عالية من سيغما (نصف قطرها) بين 2.0 و 3.0 مثالية لمعظم الحالات. إذا كان المكدس يحتوي على عدة صور، تطبيق على كافة منها (حدد نعم في إطار "عملية المكدس").
    4. إنشاء صورة ثنائية لفصل الخلفية والأجهزة (الكائنات) باستخدام عتبة. انقر فوق صورة > ضبط > الحد الأدنى. استخدام قناع أحمر لضبط القيم وفقا لشدة الصورة ، لتناسب شكل organoid ، والحفاظ على مورفولوجيا سليمة. تعطيل الخلفية الداكنة إذا كانت الصورة تحتوي على خلفية بيضاء. انقر فوق تطبيق.
    5. في إطار تحويل المكدس إلى ثنائي اختر الأسلوب Threshold. عادة ، الافتراضي أو المثلث المفضل في هذا النوع من معالجة الصور. الحفاظ على الخلفية كما الظلام. حدد حساب الحد الأقصى لكل صورة إذا كان هناك عدة صور في المكدس.
    6. حدد عملية > ثنائي > ثقوب التعبئة. اختياريا، إزالة الثقوب من الخلفية. في عملية > ثنائي > الخيارق، حدد خلفية سوداء وتنفيذ ثقوب التعبئة مرة أخرى. تعطيل خيار خلفية أسود قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    7. كائنات منفصلة. بالنسبة للعضيات، فإن طريقة مستجمعات المياه هي خيار جيد. انقر فوق عملية > ثنائي > مستجمعات المياه. تنفيذ تحليل الشكل.
      1. حدد تحليل > تعيين القياسات. تتوفر العديد من الخيارات (التفاصيل في https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). بالنسبة للعضيات، حدد المنطقة، متوسط القيمة الرمادية، الحد الأدنى & الحد الأقصى من قيمة الرمادي و واصفات الشكل. اختياريًا، حدد تسمية العرض لتحديد الكائنات في الصورة وعلامة علمية. انقر فوق موافق.
      2. حدد التحليل > تحليل الجسيمات. اختر حدود الحجم و دائرية. الاحتفاظ 0-اللانهاية و 0.00-1.00، على التوالي لقياس جميع الكائنات في الصورة. في إظهار، اختر المخططات التفصيلية بحيث يتم تحديد الكائنات. تمكين نتائج العرض لنتائج الإخراج؛ استبعاد على الحواف لاستبعاد الكائنات التي تم لمسها الحدود؛ وتشمل الثقوب حتى الثقوب الداخلية في نهاية المطاف في الكائنات تعتبر جزءا من الشكل الرئيسي.
    8. كرر تحليل الشكل لكل مكدس صور وسيتم إلحاق النتائج في جدول واحد. تصدير جدول نتائج في ملف > حفظ باسم... كملف القيم المفصولة بفاصلة (.csv).
  5. في الوقت الحقيقي PCR
    1. استخراج الحمض النووي الريبي من مكافئات الأنسجة باستخدام محلول أحادي الطور من الفينول وisothiocyanate guanidine، اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    2. تنفيذ التوليف cDNA عن طريق النسخ العكسي من 1 – 2 ميكروغرام من مجموع RNA.
    3. تضخيم جميع الأهداف باستخدام التمهيديات الخاصة بالجينات(الجدول 5)لإجراء عملية PCR الكمية في الوقت الحقيقي. كل qRT-PCR يحتوي على 30 نانوغرام من الحمض النووي الريبي العكسي و 100 nM من كل التمهيدي.
    4. اتبع شروط PCR: 50 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (دورة 1)؛ 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (دورة 1)؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 59 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (35 - 40 دورة).
  6. CYP الفحص
    1. اتبع القسم 2.2 للكبد 2-OC الجمعية. المجموعات التجريبية هي لا خلية التحكم، APAP 2 μM العلاجات ل 12 ساعة، 24 ساعة، والتحكم في السيارة. اتبع القسمين 3.3 و 4.2 لإعداد ومعالجة APAP 2 μM.
      ملاحظة: لضمان أن جميع العينات سوف تكون جاهزة في نفس الوقت لCYP اختبار, بدء العلاج 12 ح 12 ساعات بعد بدء العلاج 24 ح. علاج التحكم في عدم وجود خلية من النشاط CYP مع 0.5٪ من محلول الإيثانول، فضلا عن التحكم في السيارة.
    2. ذوبان 3 mM الركيزة حل مضيئة في درجة حرارة الغرفة وجعل تخفيف 1:1000 في وليام E S. حماية من الضوء.
    3. جمع spheroids ونقل كل مجموعة تجريبية إلى بئر من لوحة 96-جيدا. إزالة المتوسطة، وغسل مرتين مع 100 ميكرولتر من 1X DPBS وإضافة 80 ميكرولتر من 3 ميكرومتر محلول الركيزة في البئر. حافظ على التحكم بدون خلية في وسط ويليام إي إس حفظ جيدا دون spheroids أو حل الركيزة لعنصر تحكم في الخلفية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،محمية من الضوء.
    4. اكويليراتي lyophilized كاشف الكشف Luciferin (LDR) باستخدام العازلة إعادة تشكيل مع esterase. مزيج عن طريق دوامة أو عكس. قم بتخزين وحدة التخزين المخصصة في درجة حرارة الغرفة حتى الخطوة التالية.
      ملاحظة: يمكن تخزين LDR المعاد تشكيلها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أو عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع دون فقدان النشاط. للتخزين على المدى الطويل، يُخزن عند -20 درجة مئوية.
    5. نقل 25 ميكرولتر من spheroids سليمة 'سوبرنات في ثلاثة آبار مختلفة من الأبيض شفاف 96 جيدا microplate، بعد الحضانة. إضافة 25 μL من LDR في البئر والتجانس.
    6. احتضان لوحة بيضاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. قراءة الإنارة على مضيئة. لا تستخدمي مقياس الفلور.
    7. حساب الإشارات الصافية عن طريق طرح قيم الإضاءة الخلفية (التحكم بدون خلية) من قيم اختبار المعالجة المركبة وغير المعالجة (التحكم في السيارة). حساب النسبة المئوية لتغير نشاط CYP3A4 بقسمة القيم المعالجة الصافية على القيم غير المعالجة الصافية والضرب على 100.
  7. النشاف الغربي
    1. نقل spheroids الكبد إلى 1.5 مل تحديد microtube. قم بإزالة الوسط واغسل مرتين مع 100 ميكرولتر من 1x DPBS.
    2. Lysate spheroids الكبد في 100 ميكرولتر من الخلايا تحلل RIPA العازلة في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية، و 11000 دورة في الدقيقة. نقل supernatant إلى آخر تحديد 1.5 مل microtube.
    3. كمّيّة المبلغة البروتين ينال من خلال برادفورد طريقة. تحميل ما بين 10 و 50 ميكروغرام من البروتين من الخلية كميا lysate لكل بئر من جل البولي أكرريلاميد التدرج 3-15٪ وتنفيذ SDS-PAGE.
    4. نقل البروتين المحملة من هلام إلى 0.22 μm PVDF غشاء من خلال معدات النظام شبه الجاف. استخدم محلول نقل من 50 mM تريس-HCl و 192 mM جليكين. تعيين المعلمات المعدات وفقا لعدد من المواد الهلامية التي سيتم نقلها (1 إلى 2 في وقت).
    5. منع التفاعلات غير محددة على غشاء PVDF مع محلول الحليب الخالي من الدسم 3-5٪ في العازلة TBS-T: تريس المخزنة سالين (50 mM تريس pH 7.6، 150 mM كلوريد الصوديوم) تكملها 0.1٪ من Tween 20. الحفاظ على الغشاء تحت اهتزاز مستمر بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. غسل مع TBS-T تحت اهتزاز مستمر بلطف لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
    7. تمييع الالبومين و vinculin الأجسام المضادة الأولية إلى 1:1000 و 1:2000 على التوالي على TBS-T. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، تحت اهتزاز مستمر بلطف.
      ملاحظة: اتبع دائما تعليمات الشركة المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة.
    8. إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل غشاء 3 مرات (الخطوة 6.7.6). تخفيف ECL المضادة للماوس IgG الأجسام المضادة الثانوية إلى 1:5000 على TBS-T. احتضان الغشاء مع جسم مضاد ثانوي تحت اهتزاز مستمر بلطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    9. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل الغشاء (الخطوة 6.7.6). إجراء الكشف عن البروتين باستخدام ECL الغربية النشاف الركيزة. عرض الأفلام autoradiographic لمدة 30 s إلى 30 دقيقة. إجراء الكشف المناعي في ثلاثية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لإجراء اختبارات PK APAP في 2-OC MPS، فإن الخطوة الأولى هي تصنيع الأمعاء البشرية والكبد مكافئات (organoids). وهي مدمجة في جهاز microfluidic 2-OC(الشكل 1A)24 ساعة قبل البدء في اختبار PK APAP. في اليوم التالي، يتم تغيير الوسيط، ويتم عرض النموذج إلى APAP. يوضح الشكل 1 مكافئات الأمعاء والكبد الموضوعة داخل الجهاز 2-OC (الشكل 1B) و دورة وقت تجربة APAP PK (الشكل 1C). قمنا بإجراء فحص MTT ، قياسات TEER ، HCA ، PCR في الوقت الحقيقي ، النشاف الغربي ، الأنسجة ، والمجهر الفلوري confocal في الثقافة 2D والأجهزة ثلاثية الأبعاد للتحقق من صلاحية الأنسجة واكتشاف التأثيرات السامة المحتملة APAP. في صور المجهر الفلوري confocal، وقدم العينات مكافئ الأمعاء الملطخة مع DAPI وPhalloidin (للنيات و actin على التوالي) كحاجز متجاورة لغير المعالجة (الشكل 2A) و 12 ميكرومتر APAP العينات المعالجة (الشكل 2B). كما رأينا في الشكل 2C، وأظهرت MTT اختبار مستويات قابلية الخلية النسبية فوق 70 ٪ ، مما يدل على عدم وجود آثار السامة للخلايا ذات الصلة ردا على التعرض APAP في 12 μM تركيز33،34،35،36،37. تسبب التحكم الإيجابي (100 mM) في موت الخلايا الكبير (البقاء على قيد الحياة أقل من 5٪). تم التحقق من قابلية الكاكو-2/HT-29 البقاء والتمايز السليم وكذلك سلامة الحاجز المكافئ للأمعاء من خلال تطور TEER خلال فترة التمايز (الشكل 2D). لم تسبب APAP أي تغيير في قيم TEER كما هو مبين في الشكل 2E. تم تحليل التعبير عن ناقلات الجلوكوز النشطة مقرونة بالصوديوم SLC5A1 ، ومتعددة الأدوية المقاومة الناقل MDR1 و ATPase الصوديوم البوتاسيوم ، للتحقق من تأثير العلاج APAP على تشكيل حواجز الخلايا والوظائف القاعدية. كما هو موضح في الشكل 2F-H,كل من غير المعالجة وAPAP المعالجة الأمعاء معادلات أظهرت تعبيرا مماثلا من SLC5A1 وNaKATPase. وقد شهد تناوله عن طريق الفم من 12 μM APAP الناجم عن زيادة في مستويات MDR1 مرنا في الأمعاء ما يعادل بعد 24 ح (الشكل 2H). كما قمنا بإجراء HCA من التغيرات الظاهرية الخلية من قبل خليط صبغة الفلوروفور للنيوية والمحتوى الشامل الميتوكوندريا. وكانت الضوابط الإيجابية 100 M APAP و 1٪ NA.

بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتحليل ما إذا كان 12 μM APAP يمكن أن تحفز السمية الخلوية إلى 2D Caco-2/HT-29 شارك في الثقافة. وتؤكد صور الخلايا المعوية المكتسبة باستخدام المجهر المفلور الموضح في الشكل 2I بيانات MTT، التي أثبتت أن 12 ميكرومتر APAP لم تسبب سمية خلايا كبيرة في مكافئات الأمعاء Caco-2/HT-29.

تم تقييم القدرة على البقاء القاعدية للخلايا والبطلانية الخلوية استجابة لـ 2 ميكرومتر APAP بواسطة مقايس MTT والتحليلات المورفولوجية بواسطة المجهر الفلوري confocal، وH & E الأنسجة، ومقايسات HCA. كما هو مبين في الشكل 3A، لم يتمكن اختبار MTT من تحديد أي سمية للخلايا ذات الصلة استجابة لعلاج APA 2 ميكرومتر في العينات المأخوذة من مجموعة Liver 2-OC في ظل ظروف ثابتة وديناميكية على حد سواء. انخفضت صلاحية الخلية ولكنها بقيت أكثر من 80٪ لكل من 12 ساعة و 24 ساعة نقاط الوقت33،34،35،36،37. تسببت علاجات التحكم الإيجابية (APAP 100 mM و 1٪ NaOH) في تلف الأنسجة بشكل كبير (القدرة على البقاء أقل من 10٪). تشير الصور النقوش المجهرية إلى عدم وجود مركز في الكبد في حالات العلاج القاعدية أو APAP ، ولا يوجد دليل على معدلات وفيات كبيرة (الشكل 3B-C). ومع ذلك، عندما قمنا بتحليل التغيرات الظاهرية الخلوية المتعددة بعد السيارة أو 2 ميكروم APAP الإدارة في 2D HepaRG/HHSteC coculture من خلال مقايسة HCA، وذلك باستخدام 100 mM APAP (C+) كتحكم إيجابي، على نحو متناقض مع نتائج مقايسة MTT، أظهرت الخلايا الكبدية استجابات السامة للخلايا في وقت مبكر إلى 2 μ APMAP العلاج (الشكل 3D). بعد 24 ساعة، كان هناك انخفاض في عدد الخلايا، في المنطقة النووية وزيادة في كتلة الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام كوكتيل صبغة الفلوروهور التي تحتوي على Hoechst 33342 و MitoTracker ديب الأحمر لطخة spheroids 3D الكبدية(الشكل 3J). وقد استخدمت فيجي البرمجيات لتقييم التجانس هندسة كروية 3D بين العديد من كرويات (الشكل 3E-I). الرسم هو مبين في الشكل 3E يظهر التشابه بين الكبد spheroids المساحة الإجمالية. نسبة العرض إلى الارتفاع(الشكل 3F)حوالي 1 يعني غياب التحيز أثناء عملية الحلويات من spheroids. كما أشار التقييم إلى أن غالبية الـ spheroids كانت تقريبًا(الشكل 3G). تم تقييم محيط المورفولوجيا وتوزيع الخلايا عن طريق التعميم (الشكل 3I) وحساب الصلابة(الشكل 3H)، على التوالي. وخلصنا إلى أن منهجية الحلويات في الكبد spheroids ولدت organoids مع محيط سلس، متوافقة مع النمو كروية، لا التحيزات، أو نخر خلال العملية.

كما هو موضح في الشكل 4A-B، أظهر spheroids الكبد مستوى عال نسبيا من الزلال وGST التعبير مرنا على التوالي ، مما يدل على وظيفة القاعدية المناسبة. ومع ذلك, 2 μM APAP العلاج ل 24 ح تسبب انخفاضا في الزلال ومستويات التعبير MRNA GST, مما يشير إلى ضعف spheroids الكبد وظيفيا في 24 نقطة ساعة من العلاج APAP.

إن الكشف عن مستويات التعبير CYP3A4 و UGT1A1 mRNA يوضح قدرة الكبد الأيضية. وكان مستوى CYP3A4 mRNA القاعدية(الشكل 4C)متسقا مع التقارير السابقة6. تسبب العلاج APAP اتجاهًا لانخفاض في كل من CYP3A4 mRNA وتعبير UGT1A1 استجابة لعلاج APAP(الشكل 4C-D)مرة أخرى تؤكد فرضية ضعف التواء الكبد وظيفيًا عند نقطة وقت 24 ساعة من علاج APAP.

بالإضافة إلى ذلك، أجريت تجارب من النشاف الغربي وفي المختبر نشاط الأنزيمية من أجل تحليل التعبير بروتين الزلال، وكذلك، CYP 3A4 النشاط في مكافئات الكبد في القاعدية وفي شروط العلاج APAP. وجدنا أن 2 μM APAP العلاج التي أجريت في الكبد 2-OC MPS, تسبب في انخفاض في الكبد ما يعادل مجموع التعبير الألبومين في 12 ح و 24 ح نقطة زمنية في كل ثابت(الشكل 4E)وديناميكية(الشكل 4F)الشروط. من ناحية أخرى، الكبد معادلات العينات من الظروف الديناميكية أظهرت اتجاها لتقديم مستويات أعلى من التعبير البروتين من الألبومين بالمقارنة مع الظروف الثابتة (الشكل 4G). CYP 3A4 في المختبر المختبرية في ما يعادل الكبد من الكبد 2-OC MPS أظهرت أن 2 μM APAP العلاج ل 12 ح أو 24 ح كان قادرا على إحداث ضعف قوي وكبير من CYP 3A4 النشاط في كل من الظروف الثابتة والديناميكية(الشكل 4H-I). أكثر إثارة للاهتمام, وقد تسبب وجود تدفق وسائل الإعلام (دينامية) تحسنا كبيرا في الكبد مكافئات CYP 3A4 مستويات النشاط بالمقارنة مع الظروف التي تم الاحتفاظ بها في الكبد معادلات في غياب المتوسط المتداولة (ظروف ثابتة) (الشكل 4J).

للعثور على الحالة التحليلية الأكثر حساسية فيما يتعلق بتحليل HPLC، تم فحص العديد من المعلمات بما في ذلك تكوين المرحلة المتنقلة ونوع وتركيز المواد المضافة. ووجد أن الأسيتونيتريل أعطى أفضل دقة الكروماتوغرام والوقت المناسب للاحتفاظ من الميثانول. تم الحصول على فصل سريع وقابلة للتكرار APAP باستخدام عمود المرحلة المعكوسة C18. كانت قيمة وقت الاحتفاظ APAP (Rt) 9.27 ± 0.19 دقيقة. ويشار إلى الانتقائية لAPAP من خلال شكل ودقة متناظرة من الذروة، وكذلك من عدم وجود قمم التداخل من وسائل الإعلام ثقافة خلية DMEM ووليامز.

تم استخدام تركيزات APAP القياسية في وسائط ثقافة الخلايا DMEM S وS Williams E S المخففة مع حاجز خلات الأمونيوم (1:1، v/v) التي تتراوح بين 0.25 إلى 100.00 ميكرومتر لبناء منحنيات المعايرة. تم تحديد الخطية للأسلوب عند تسعة مستويات تركيز. وتظهر البيانات في الجدولين 2 والجدول 3. تم وصف العلاقة بين تركيز APAP ومناطق الذروة من خلال معادلات الانحدار الخطي: y = 16106 * x + 3579.8 (R2= 1، في DMEM المتوسطة) و y = 16397 * x + 2475.1 (R2= 1، في وسط ويليامز)، الذي "x" هو التركيز الاسمي APAP في μM و "y" هو منطقة الذروة الكروماتوغرافية APAP في الاتحاد الافريقي. عند الحد الأعلى من القياس الكمي (أي 100.00 ميكرومتر)، كانت نسبة الانحراف وقيم التغير بين المدى أقل من 2.50٪. وكانت الدقة والدقة بالنسبة لتسعة مستويات تركيز، باستثناء 0.50 ميكرومتر (LLOQ)، ضمن نطاق مقبول مع قيم DEV و C.V. أقل من 7.00٪(الجدول 2 والجدول 3).

11 - إن الدقة والدقة في الطريقة التحليلية بين المدى وداخل المدى، عند أربعة تركيزات مختبرة، تقع ضمن المعايير المقبولة عموماً للتحاليل التحليلية الأحيائية. تم تقييم قابلية تكرار الطريقة من خلال تحليل تكرار عينات مراقبة جودة APAP من 0.50 (LLOQ) و 4.50 و 45.00 و 90.00 ميكرومتر. أما متوسط النتائج داخل المدى والشوط الداخلي فيبلغ في الجدول 4. يتم إظهار دقة ودقة الفحص من خلال قيم DEV ≤ 15.00٪ وقيم C.V. ≤ 7.00٪، على التوالي.

تم تحديد اللد على أنها العينة التي كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S/N) أكبر من 3 وتتوافق مع APAP 0.25 ميكرومتر. ومن ناحية أخرى، فإن LLOQ، التي تقدر بـ 0.50 ميكرومتر من APAP، تعرض نسبة S/N تساوي 10. وعلاوة على ذلك، وجدنا قيم الدقة (DEV%) تتراوح في ≤ 19.00٪ من قيم التركيز الاسمية. وقد أظهرت التقلبات داخل وفيما بين المدى من قبل C.V. ≤ 18.77٪، كما هو مبين في الجدول 2، الجدول 3 والجدول 4)29،30.

تم إجراء تحليلات APAP PK في ثلاث جمعيات مختلفة 2-OC MPS: 1) الأمعاء 2-OC، تحتوي على ما يعادل الأمعاء فقط. 2) الكبد 2-OC، التي تحتوي على spheroids الكبد فقط و 3) الأمعاء / الكبد 2-OC مع كل من حاجز الأمعاء والكبد spheroids.

لدراسات الامتصاص، تم محاكاة الطريق عن طريق الفم من قبل إدارة APAP 12 μM على الجانب الأمعاء ما يعادل apical. تم قياس تركيزات APAP بواسطة HPLC/UV، في العينات المتوسطة، التي تم جمعها من جوانب مكافئات الأمعاء البزاسية والبصلية، في ظروف ثابتة وديناميكية على حد سواء. أظهرت حركيات APAP في الوسط التي تم جمعها من الجوانب البائية والبصلة أن نموذج الأمعاء كان قادرًا على استيعاب APAP. كان هناك انخفاض تركيز APAP التدريجي في الجانب apical(الشكل 5A)بالتزامن مع زيادة تركيز APAP في الجانب الأمعاء القاعدية(الشكل 5B). وكان الحد الأقصى للتركيزات (Cماكس) في المتوسط حوالي 2 ميكرومتر لكل من الظروف الثابتة والديناميكية، بعد 12 ساعة من الإدارة (Tmax).

بالنسبة لدراسات التمثيل الغذائي ، تم محاكاة الإدارة الوريدية من خلال تطبيق APAP 2 μM في وسط مقصورة الكبد. أشارت حركية تركيز APAP في الوسائط في ظل ظروف ثابتة وديناميكية على حد سواء إلى أنه فقط في الظروف الديناميكية يمكن اكتشاف الانخفاضات في تركيز APAP ، لتصل إلى 0.87 μM APAP 12 ساعة بعد 2 ميكرومتر APAP الإدارة (T1/2 = 12 ساعة). وأظهرت معادلات الكبد الحد الأدنى من الكفاءة الأيضية في ظل ظروف ثابتة(الشكل 5C). وصل تركيز APAP 1.7 μM 12 ساعة بعد إدارة APAP. تم تنفيذ المتكاملة, النظامية مثل امتصاص APAP وتقييم التمثيل الغذائي في الأمعاء / الكبد 2-OC نموذج. تم إعطاء APAP على الجانب apical من الأمعاء ما يعادلها، محاكاة الطريق عن طريق الفم. تم جمع عينات متوسطة من الجانبين المعوية وكذلك من حجرة الكبد. ويبين الشكل 5D الانحلال التدريجي لتركيز APAP في الجانب apical في كل من الظروف الثابتة والديناميكية.

ويبين الشكل 5E مراحل الامتصاص والتمثيل الغذائي المميزة. كما أثر التدفق في امتصاص الأمعاء. وAP Cماكس في المتوسط تغيرت من 2 μM على "الأمعاء 2-OC"(الشكل 5B)الجمعية إلى 1.7 μM للديناميكية "الأمعاء / الكبد 2-OC" (الشكل 5E). يظهر الشكل 5F مقارنة مباشرة بين التركيز - الوقت لمحة من APAP في لدينا دينامية "الأمعاء / الكبد 2-OC" نظام microphysiological (منحنى أحمر ومحور y) وملف تمثيلي تم الحصول عليها في البشر بعد جرعة واحدة عن طريق الفم من 1000 ملغ (منحنى أسود ومحور y).

Figure 1
الشكل 1: تجميع الخطوة التخطيطية لدراسات PK في MPS 2-OC. أ)الرسم التخطيطي لـ MPS 2 OC، مع إظهار مكافئات الأنسجة البشرية المعوية وال الكبدية في المنظر من الأسفل إلى الأعلى. B) صورة 2-OC MPS مع مكافئات الأمعاء والكبد مدمجة في الجهاز في عرض من أسفل إلى أعلى، مع صور المجهر البصرية التمثيلية. ج) الجدول الزمني لإعداد مكافئات الأنسجة، ومعالجة APAP، ومراحل المجموعات المتوسطة الثقافة للتصنيع العضوي، والتقييمات الدوائية والسمية. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التقييم السمية والقابلية للتطبيق من الأمعاء المكافئة. أ) ممثل الصور المجهرية الفلورية المناسخة للخلايا غير المعالجة Caco-2/HT-29 الملطخة بنوى الخلية وصبغة الفلورسنت من خيوط أكتين (DAPI و Phalloidin على التوالي)؛ 63x التكبير، التكبير 2.6. ب) ممثل الصور المجهرية الفلورية confocal من الخلايا Caco-2/HT-29 تعامل مع APAP 12 ميكرومتر لمدة 24 ساعة، ملطخة النوى وصبغة الفلورسنت actin خيوط (DAPI وPhalloidin على التوالي)؛ 63x التكبير، التكبير 2.6. C) الأمعاء يعادل تقييم الجدوى من قبل MTT المقايسة في كل من الظروف الثابتة والديناميكية. القيم الممثلة بالأعمدة في الرسم البياني هي النسبة المئوية المحسوبة بالنسبة إلى التحكم في السيارة (نقطة الوقت المسماة 0) * P<0.05 0 مقابل المعالجة. د) تطور TEER خلال 21 يوما من التمايز. *P<0.05 يوم واحد مقابل أيام أخرى. E)قيم TEER بعد إدارة APAP في الأمعاء 2-OC MPS تحت ظروف ديناميكية. التعبير الجيني في الأمعاء مكافئات. تم التحقق من إمكانية امتصاص حاجز الأمعاء والآثار المحتملة لـ APAP 12 ميكرومتر لـ 24 ساعة تحت حالة ديناميكية بواسطة SLC5A1 (F) ، Na-K-ATPase (G) وMDR1 (H)التعبير. تمثل القيم متوسط ± SEM لثلاث تجارب مستقلة. يتم التعبير عن النتيجة كنسبة إلى التدبير المنزلي GAPDH. *P<0.05 مركبة مقابل APAP. ط) أوبريت المستندة إلى صورة HCA التي يؤديها كولومبوس® 2.4.0. البرمجيات. صور تمثيلية من الأمعاء 2D المشتركة في ثقافة في نقاط زمنية مختلفة بعد 12 μM APAP العلاج. وكانت الضوابط السلبية متوسطة (0 ساعة) أو مركبة (0.5٪ الإيثانول). الضوابط الإيجابية هو مبين هنا APAP 100 mM. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التقييم السمية والقابلية للتطبيق في الكبد. أ)الكبد يعادل تقييم الجدوى من قبل MTT المقايسة في كل من الظروف الثابتة والديناميكية. القيم الممثلة بالأعمدة في الرسم البياني هي النسبة المئوية المحسوبة بالنسبة إلى التحكم في السيارة (نقطة الوقت المسماة كـ 0) *P<0.05 0 مقابل المعالجة. ب) الممثلون الصور confocal التي تم التقاطها من السيارة و 2 μM APAP 24 ح الكبد المعالجة spheroids من قسم داخلي. ج) الممثلين H & E (الهماتوسلين و إيوسين تلطيخ) الصور التي تم التقاطها من السيارة و 2 μM APAP 24 ح المعالجة الكبد spheroids من قسم داخلي. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. D) صور تمثيلية لثقافة الكبد المشتركة 2D في نقاط زمنية مختلفة بعد 2 μM APAP العلاج. وقد تم النظر في هذه التحليلات في العينات المعالجة بالمركبات وبـ 2 ميكرومتر APAP. ويشمل خليط صبغة الفلوروفور Hoechst للتلوين النووي والميتوراكر الأحمر العميق لالطمس كتلة الميتوكوندريا. وكانت الضوابط السلبية متوسطة (0 ساعة) أو مركبة (0.5٪ الإيثانول). وكانت الضوابط الإيجابية 100 MM APAP. وأجريت قياسات لصور السفيريين الكاملة التي تم التقاطها باستخدام برامجيات فيجي. E)توزيعات التردد للمنطقة F)نسبة العرض إلى الارتفاع، G)استدارة، H) صلابة، أنا) دائرية. N = 85. * p < 0,05. J) صور تمثيلية من 3D spheroids الكبد المكتسبة من قبل أوبريت باستخدام الهدف LWD 10x. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صلاحية الكبد/وظائفه والتأثيرات المحتملة لـ 2 ميكرومتر APAP في ظل ظروف ثابتة وديناميكية فوقه تم التحقق منها من خلال التعبير الجيني والبروتيني والنشاط الأنزيمي. A)الألبومين الجينات التعبير. B) GSTA2 التعبير الجيني. تم التحقق من قدرة الكبد على تنفيذ المرحلة الأولى والثانية الأيض والآثار المحتملة ل 2 ميكرومتر APAP ل 24 ساعة تحت حالة ديناميكية أكثر من ذلك من خلال التعبير الجيني من CYP3A4 (C)و UGT1A1 (D) على التوالي. E) مجموع التعبير البروتين الألبومين تحت شرط ثابت. F) مجموع التعبير البروتين الألبومين في ظل ظروف ديناميكية. حاله. ز) رسم بياني مقارن يوضح الفرق في التعبير الإجمالي للألبان في مكافئات الكبد المزروعة والمعالَجة في ظل ظروف ثابتة أو ديناميكية. H) CYP 3A4 في النشاط الانزيمي في المختبر في ظل ظروف ثابتة. I) CYP 3A4 في النشاط الانزيمي في المختبر في ظل ظروف ديناميكية. ي) الرسم البياني المقارن الذي يوضح الفرق في نشاط CYP 3A4 في مكافئات الكبد المزروعة والمعالَجة في ظروف ثابتة أو ديناميكية. تمثل القيم متوسط ± SEM لثلاث تجارب مستقلة. يتم التعبير عن بيانات التعبير الجيني كنسبة إلى التدبير المنزلي GAPDH. يتم التعبير عن بيانات التعبير البروتين كنسبة إلى بروتين فينكولين. *P< 0.05 مركبة مقابل علاج APAP. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليلات من المستحضرات الصيدلانية APAP في 2-OC MPS. ملف امتصاص APAP بعد 12 μM APAP الإدارة في الجانب apical من الأمعاء 2-OC MPS إعداد. تم إجراء حاجز الأمعاء من تربية بشرية من خطوط الخلايا Caco-2/HT-29 (A) تركيزات APAP ثابتة وديناميكية في الوسط من الجانب الضمي (تمثل الجانب التجويف المعوي). (B) تركيزات APAP ثابتة وديناميكية في الوسط من الجانب القاعدي (يمثل الجانب البشري مجرى الدم المعوي). *P<0.05 ثابتة مقابل شروط ديناميكية. C)ملف التمثيل الغذائي APAP في الكبد 2-OC MPS بواسطة الكبد الكبدة/HHSTeC spheroids الكبد. مقارنة الظروف الثابتة والديناميكية بعد إدارة APAP 2 μM في الوسط. * P< 0.05 0h مقابل 6 ساعة، 12 ساعة، و 24 h APAP العلاج. APAP امتصاص والتمثيل الغذائي بعد 12 μM الإدارة على الجانب الحاجز المعوي apical من الأمعاء / الكبد 2-OC MPS إعداد. هذا يحاكي الطريق الشفوي. تم إجراء حاجز الأمعاء من خطوط الخلايا Caco-2/HT-29 والكبد المعادل مصنوعة من spheroids من خطوط خلايا HepaRG/HHSTeC. (D) الأمعاء / الكبد 2-OC APAP التركيزات في الجانب apical من الحاجز المعوي في ظل ظروف ثابتة وديناميكية. (E) الأمعاء / الكبد 2-OC APAP التركيزات في المتوسط تحت ظروف ثابتة وديناميكية. *P<0.05 ثابتة مقابل شروط ديناميكية. (F) مقارنة بين التركيز - الوقت لمحة من APAP في نظامنا microphysiological (منحنى أحمر ومحور y) وملف تمثيلي تم الحصول عليها في البشر بعد جرعة واحدة عن طريق الفم من 1000 ملغ (منحنى أسود ومحور y). تم استخراج البيانات من قطع الأراضي باستخدام WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نظام HPLC ووترز التحالف 2695 (ميلفورد، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)، مجهزة مضخة رباعية، مدير عينة و degasser
كاشف المياه 2996 الأشعة فوق البنفسجية فيس مجموعة في 210-400 نانومتر مجموعة
التحكم في النظام، وحيازة البيانات، ومعالجتها المياه تمكين 2002 برنامج كروماتوغرافيا
العمود عكس المرحلة لونا C18
(150 × 4.6 مم من حيث التولّر؛ حجم الجسيمات 5 مم)
فينومينيكس
عمود حراسة عكس المرحلة لونا C18 (4 × 3 مم)
فينومينيكس
مرحلة المحمول المذيب A- الأسيتونيتريل
المذيب B- 0.10 M خلات الأمونيوم، الأسي 6.8
ظروف متساوي الراسك الوقت ألف (%) باء (%)
(دقيقة)
15 5 95
تدفق 1.0 مل / دقيقة
حجم الحقن 25 ميكرولتر
درجه الحراره 25 درجة مئوية
APAP الكشف UV @ 243 و 254 نانومتر
وقت التشغيل 15 دقيقة

الجدول 1: الشروط والبارامترات التي ستستخدم في تحليلات HPLC-UV لAPAP في المصفوفات المتوسطة الثقافة.

التركيز الاسمي تركيز APAP المحسوب (μM) المتوسط (μM) S.D.b السيره الذاتيه. ديف
(μM) (ثلاثية من كل تركيز) (μM) (%) (%)
عدد المقايسة 1 2 3 4 5 6
0.25 (اللد) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46.05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6.65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0.09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0.03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

الجدول 2: التباين بين المدى - الدقة والدقة وخطي عينات المنحنى القياسية المعدة في خليط من متوسط DMEM مع 0.10 M الأمونيوم خلات العازلة (1:1، v/v) من ستة مقايسات منفصلة. (أ)
(أ) تم تركيب منحنى خطي للبيانات للاستجابة (APAP) مقابل التركيز النظري كما هو موضح في التجريبية. تم اشتقاق التركيز المحسوب من قراءة الاستجابة لكل عينة قياسية مقابل منحنى المعايرة. كل إدخال (مقايسة 1-6) يتوافق مع متوسط قيمة تحليل ثلاثية.
(ب) SD = الانحراف المعياري.
(ج) C.V. (معامل التباين. الدقة).
(د) الدقة (DEV %) = انحراف التركيز المحسوب عن القيمة الاسمية.
وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019).

التركيز الاسمي تركيز APAP المحسوب (μM) متوسط S.D.b السيره الذاتيه. ديف
(μM) (ثلاثية من كل تركيز) (μM) (μM) (%) (%)
عدد المقايسة 1 2 3 4 5
0.25 (اللد) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26.03
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14.97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6.85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1.56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0.01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0.05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

الجدول 3: التباين بين المدى – الدقة والدقة وخطي عينات المنحنى القياسية المعدة في خليط من وسط وليامز مع 0.10 M الأمونيوم خلات العازلة (1:1، الخامس / الخامس) من ستة مقايسات منفصلة. (أ)
(أ) تم تركيب منحنى خطي للبيانات للاستجابة (APAP) مقابل التركيز النظري كما هو موضح في التجريبية. وقد استمد التركيز المحسوب من قراءة الاستجابة لكل عينة قياسية مقابل منحنى المعايرة. كل إدخال (مقايسة 1-5) يتوافق مع متوسط قيمة تحليل ثلاثية.
(ب) SD = الانحراف المعياري.
(ج) C.V. (معامل التباين. الدقة).
(د) الدقة (DEV %) = انحراف التركيز المحسوب عن القيمة الاسمية.
وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019).

وليامز متوسطة التركيز الاسمي قياس التركيز س. د. السيره الذاتيه. ديف
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
تشغيل داخل (n = 3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1.77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8.37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8.57
تشغيل بين (n = 15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14.97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2.99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5.88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5.31
متوسط DMEM التركيز الاسمي قياس التركيز س. د. السيره الذاتيه. ديف
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
تشغيل داخل (n = 3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6.35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1.69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4.00
تشغيل بين (n = 12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7.75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

الجدول 4: الدقة والدقة داخل المدى والمدى البيني لAPAP في عينات مراقبة الجودة. (أ)
(أ) يتم عرض البيانات كمتوسطات. SD (الانحراف المعياري). C.V. (معامل الاختلاف الدقة) والدقة (انحراف النسبة المئوية. DEV%).
وقد تم تعديل هذا الرقم من مارين وآخرون. امتصاص الأسيتامينوفين والتمثيل الغذائي في الجهاز الأمعاء / الكبد microphysiological. كيم بيول التفاعل. 299, 59-76 (2019).

التمهيدي (5'→ 3')
الانسجه الجينات الي الامام عكس
الامعاء SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgACGGT
NA-K-ATPase ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCAGAGTCC
MDR1 TggATgTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTTgg
الكبد الزلال TgCAAggCTgATAAggAg TTTAGAGAggggTgTggCTTTACAC
GSTA2 CtgAggAACAAgATgCCAAgC AgCAgagggaggcTggAAATAAg
CPY3A4 ggAAggTggACCCAGAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCGCAGAGAC ggTCCTTgtgAggCTgg

الجدول 5: التمهيديات QPCR في الوقت الحقيقي لتقييم النسخ الجيني على مستوى مرنا في الثقافات 2-OC للأنسجة الأمعاء والكبد

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن التقييم الدقيق والموثوق للخصائص الدوائية للأدوية الجديدة التحقيقية أمر بالغ الأهمية للحد من المخاطر في خطوات التطوير التالية. MPS هي تقنية جديدة نسبيا ، التي تهدف إلى تحسين القدرة التنبؤية وتقليل التكاليف والوقت الذي يقضيه مع الاختبارات قبل الإكلينيكية. وتتقدم مجموعتنا في تقييم الخصائص الدوائية والسمية التي تشتد الحاجة إليها لتحسين استخدام الرصاص. عملنا مع جهاز microfluidic 2-OC، الذي يحتوي على غرفتين، مما يسمح بتكامل جهازين organoids. تم اختيار APAP لأنه يحتوي على الكثير من البيانات البشرية عالية الجودة ، ويتم استقلابه في الغالب من قبل الكبد ، ويعرض أيضًا خصائص سم الكبد. ويهدف بروتوكول الدراسة إلى محاكاة بعض خطوات المرحلة البشرية الأولى من التجربة السريرية، حيث يتم إعطاء الدواء شفويا للمتطوعين، ويتم سحب عينات الدم الدورية لتقييم تركيز الأدوية لمعرفة الخصائص الدوائية والمعلمات الكيميائية الحيوية والسريرية التي يتم جمعها لتقييم السلامة والقدرة على التحمل. لذلك، عندما يتطور MPS بما فيه الكفاية لتوفير تنبؤات موثوقة، فإنه سوف يقلل بشكل كبير من خطر الفشل في المرحلة الأولى من التجربة. من خلال إضافة نماذج المرض في المستقبل ، يمكن أن ينطبق نفس الافتراض على المرحلتين الثانية والثالثة التجارب السريرية.

تم إجراء جميع الدراسات في ثلاثة نماذج: الأمعاء 2-OC (APAP الإدارة عن طريق الفم), الكبد 2-OC (إعطاء الوريد), والأمعاء / الكبد 2-OC (الإدارة عن طريق الفم). عزل النموذج الأول امتصاص، والثاني الأيض، والثالث دمج كليهما. أنتجنا أول organoids وأدرجت في الجهاز microfluidic، الثانية تدار APAP وجمع عينات وسائل الإعلام، وآخر إجراء مجموعة من الاختبارات لتقييم صلاحية الخلية ووظيفته والأثر السمية للتعرض APAP. بالنسبة للدراسات الدوائية، قمنا بتطوير و التحقق من صحة طريقة الكروماتوغرافية للحصول على تقدير الكم APAP في الوسط. وقد امتثل التحقق من الصحة مع المبدأ التوجيهي بشأن التحقق من صحة الطريقة البيولوجية التحليلية فيما يتعلق بالأسلوب المحدد، والخطي، وحد القياس الكمي (LOQ)، وحد الكشف (LOD)، وتأثير المصفوفة، والدقة، والدقة، على النحو المبين في ادارة الاغذية والعقاقير29،30. تم تحديد خصوصية مع عينات بيولوجية فارغة، مجمعة، والفردية من مصدرين مختلفين. تم تنفيذ الطريقة بشكل مقبول أثناء التحليل ، وأكدت البيانات قدرة مرحلة متنقلة بسيطة على فصل APAP وتحديدها كميًا.

تم تقييم صلاحية / وظيفية من الأمعاء والكبد organoids بواسطة تقنيات مختلفة. بالنسبة إلى ما يعادل الأمعاء، لم يكشف المجهر الفلوري confocal (الشكل 2A-B) ، مقايسة MTT (الشكل 2C) تقييم التعبير الجيني(الشكل 2D-F) أو تجربة HCA ، أي سمية 24 ساعة بعد التعرض APAP. وبالمثل، لم MTT لم الكشف عن الشتائم السامة التي تسببها APAP في مكافئات الكبد(الشكل 3A). ومع ذلك ، فإن تقنية HCA أضافت إمكانية الكشف عن الأحداث السامة المبكرة جدًا (24 ساعة بعد التعرض لـ APAP) لخلايا الكبد ، من خلال ملاحظة تغيرات فيض الخلايا ، مع بعض القرائن الميكانيكية(الشكل 3D). من ناحية أخرى، تبين أن المجهر الفلوري confocal(الشكل 3B)وعلم الأنسجة(الشكل 3C)أن تكون أداة مكملة مفيدة في التحقيق في حالة صلاحية ما يعادل الأنسجة البشرية. بالنسبة لخلايا الكبد ، كان الاستخدام المتزامن لتقنيات مختلفة مفيدًا للغاية. لم يكن اختبار MTT ، كما ذكر من قبل ، قادرًا على اكتشاف السمية الخلوية APAP التي تم اكتشافها بواسطة HCA 24 h بعد التعرض لAPAP. قيمت تحليلات التعبير الجيني وظيفة الأمعاء(الشكل 2D-F)وعضوية الكبد(الشكل 4A-D)في كل من القاعدية و 24 ساعة بعد العلاج APAP. في ظل الظروف القاعدية، كانت هناك مستويات طبيعية من علامات الأمعاء والكبد محددة، مما يشير إلى وظيفة مناسبة. بعد 24 ساعة من التعرض APAP، كان هناك downregulation من الألبومين، GST مستويات مرنا، والميل إلى الحد من التعبير الجيني CYP3A4 في الأنسجة المكافئة للكبد، مما يدل على APAP السمية الخلوية في وقت مبكر. وتأكيداً لهذه النتائج، أظهرت تجارب النشاف الغربية أن الانخفاض في التعبير الجيني كان مصحوباً أيضاً بانخفاض قوي في تعبير بروتين الألبومين الكلي للكبد استجابة للعلاج من APAP(الشكل 4E-F)،مما يؤكد الإهانات السامة المفروضة على أنسجة الكبد من خلال التعرض لAPAP. وبناء على ذلك، أظهرت تجارب النشاط الانزيمي في المختبر انخفاضا قويا والتدريجيا في مستويات النشاط CYP 3A4 الناجمة عن العلاج APAP، في مكافئات الكبد(الشكل 4H-I).

تم إجراء إحصاءات مورفومترية من الأعضاء على صورة J (الشكل 3E-I). يكشف المنطقة عن مدى قرب حجم 2D من جميع الأعضاء التي تم تحليلها ، والتي يمكن استخدامها كلتوحيد في هذا البروتوكول بحيث يمكن إنتاج نتيجة غير متحيزة. تكشف "واصفات الشكل" عن إحصاءات تتوافق بدقة مع مورفولوجيا الشكل. نسبة العرض إلى الارتفاع هي مؤشر يستخدم المحور الرئيسي والثانوي، لذا فإن النتائج حول 1 لا تشير إلى أي تحيز (أي نمو تفضيلي) أثناء التكوين العضوي. قيم الدورة (4 ×[منطقة]/ (π × [المحور الرئيسي]2))حساسة جداً للنمو التفضيلي، والتي سوف تكشف كمحور رئيسي. الصلابة ([المنطقة]/ ([المنطقة المحدبة])) ضرورية في إظهار التشكل الإجمالي لأنها لا تتأثر بالمخالفات في الحدود لأنها تستخدم منطقة محدبة (=مغلف). التوزيعات التي تركزت حول 1.0 تشير إلى النمو الكروي المفترض. وعلى العكس من ذلك، فإن التعميم (4× π [المنطقة]/[محيط]2)حساس جداً لمحيط معقد، لذلك فإن "التجاويف" أو "الجيوب" ستؤثر على هذا المؤشر. وهكذا، دائرية حول 1 أيضا يؤكد النمو الكروي المفترض، متوافق مع وظيفة الجهاز العضوي السليم.

وأظهرت النتائج التحليلية أن MPS يمكن أن تحاكي امتصاص APAP وخصائص الأيض، سواء معزولة أو متكاملة في منحنى مماثل لتلك التي أنتجت في الجسم الحي(الشكل 5F) دون مرحلة إفراز. وامتصاص APAP كان مماثلا بعد تناوله عن طريق الفم لكل من الأمعاء MPS أو الأمعاء / الكبد نماذج MPS، في ظل ظروف ثابتة وديناميكية على حد سواء(الشكل 5A-B، الشكل 5D-E). في كلا, كان هناك تركيز APAP انخفاض في الجانب apical بالتزامن مع زيادته في الجانب القاعدي, مع عدم وجود فرق كبير للظروف الثابتة والديناميكية. في المقابل، اختلف الأيض الكبدي APAP في ظل هذه الظروف. ويبدو أن وسائل الإعلام المتداولة في MPS لتحسين القدرة الأيضية organoid(الشكل 5C والشكل 5E). كان هناك اضمحلال APAP كبيرة لا ينظر دون تدفق. ومن المثير للاهتمام، فيالمختبر، CYP3A4 تجارب النشاط تؤكد فرضية أن وجود تدفق في النظام يزيد من وظيفة مكافئات الكبد البشري. كما هو مبين في الرسم البياني في الشكل 4J، كان نشاط CYP 3A4 أعلى بكثير في مكافئات الكبد التي يتم الاحتفاظ بها تحت التدفق في كل من ظروف العلاج القاعدية وAPAP. وبالمثل، أظهرت مكافئات الكبد التي تبقى تحت التدفق (الديناميكي) ميلاً إلى زيادة تعبير البروتين من الألبومين بالمقارنة مع تلك التي تبقى بدون تدفق (ثابت) سواء عند خط الأساس أو في الشروط المعالجة APAP (الشكل 4G).

بالمقارنة مع التركيز مرة بعد إدارة عن طريق الفم من APAP إلى البشر، لدينا نظام microphysiological يظهر أكبر بكثيرt 1/2 (نصف العمر الوقت) (الشكل 5F). يحدث هذا ، كما ذكرنا من قبل ، لأنه في حين أن لدينا نظام عضوي مع مكافئات الأمعاء والكبد التي يمكن أن تمتص الدواء واستقلابه ، لا يوجد ما يعادل الكلى لإفراز APAP وabolites من مقصورة البلازما38. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر النظام الدقيق الفسيولوجي Cماكس (ذروة تركيز البلازما) وأكبر tmax (الوقت للوصول إلى Cmax) من ما يلاحظ عادة بالنسبة للبشر (الشكل 5F). هذا هو نتيجة للاختلافات في حجم التجارب في المختبر وفي الجسم الحي. عموما، هناك ثلاثة اختلافات رئيسية بين التركيز-الوقت الملف الشخصي التي تم الحصول عليها باستخدام نظام microphysiological وملامح الحصول عليها بعد تناوله عن طريق الفم من APAP إلى البشر: أكبر t1/2،أصغر Cماكس وأكبر tماكس (الشكل 5F). في حين أن أكبر ر1/2 ويرجع ذلك إلى عدم وجود ما يعادل الكلى لاخراج APAP والايض من مكافئ البلازما, أصغردرجة مئوية ماكس وأكبر رهي عواقب على نطاق صغير من التجربة بالمقارنة مع جسم الإنسان. لا تزال أفضل استراتيجيات القياس لبناء وتشغيل النظم الدقيقة الفيزيولوجية مجالاً نشطاً للبحث ومن غير المرجح أن يكون النهج الوحيد هو الأمثل لجميع الأنظمة39. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام النمذجة الرياضية أو التعلم الآلي لتطبيق التصحيحات أو تعلم رسم الخرائط من النطاق الصغير إلى النطاق الكامل من أجل استقراء البيانات في المختبر التي تم الحصول عليها مع النظم الدقيقة فيزيائية إلى السلوك في الجسم الحي لوحظ في البشر40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتور كريستي غوجين- غيلوزو، والدكتور فيليب جريبون في الوحدة 522 INSERM، والدكتور كريستيان تريبو في الوحدة 271 INSERM لاستخدام المواد البيولوجية (خلايا هيبا RG) وإتاحتها لنا من أجل إجراء البحث الأكاديمي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Tags

الكيمياء، الإصدار 166، نظام فيزيولوجيا دقيقة، أسيتامينوفين، ADMETox، العضاويدات
جهاز الأمعاء/الكبد الدقيق فيزيولوجيا لتقييم الأدوية الدوائية والسمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter