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Chemistry

दवा फार्माकोकाइनेटिक और विष विज्ञानी मूल्यांकन के लिए एक आंत/जिगर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

हमने आंत और लिवर ऑर्गेनॉइड के साथ एसिटामिनोफेन (एपीएपी) के लिए एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) को उजागर किया। यह लेख सांसदों में ऑर्गेनॉइड उत्पादन और एपीएपी फार्माकोकाइनेटिक और विषाक्त संपत्ति आकलन के तरीकों का वर्णन करता है। यह परिणामों को मान्य करने के लिए आवश्यक ऊतक कार्यक्षमता विश्लेषण का भी वर्णन करता है।

Abstract

हाल ही में शुरू की गई माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) मानव ऑर्गेनॉइड की खेती करने से दवा विकास प्रक्रिया के प्रीक्लिनिकल परीक्षण चरण में जानवरों की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करने की उम्मीद है क्योंकि वे आनुवंशिक रूप से मानव हैं और ऊतकों के बीच परस्पर क्रिया को फिर से लागू करते हैं । इस अध्ययन में, मानव आंतों की बाधा (Caco-2 और एचटी-29 कोशिकाओं की सह-संस्कृति द्वारा अनुकरणीय) और यकृत समकक्ष (विभेदित हेपार्ग कोशिकाओं और मानव हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं से बने स्फेरॉइड द्वारा अनुकरणीय) को कुछ एसिटामिनोफेन (एपीएपी) फार्माकॉइनेटिक (पीके) और वैज्ञानिक गुणों का आकलन करने के लिए दो-अंग चिप (2-ओसी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में एकीकृत किया गया था। सांसदों तीन विधानसभाओं था: आंत केवल 2-ओसी, जिगर केवल 2-ओसी, और आंत/जिगर 2-ओसी एक ही मीडिया के साथ दोनों ऑर्गेनॉइड perfusing । पीके आकलन के लिए, हमने इसे या तो आंतों की बाधा (मौखिक मार्ग की नकल) या मीडिया (नसों में मार्ग की नकल) पर क्रमशः 12 माइक्रोन और 2 माइक्रोनएम पर प्रशासित करने के बाद पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर मीडिया में एपीएपी को खुराक दी। मीडिया के नमूनों का विश्लेषण उत्क्रमित चरण के उच्च दबाव वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा किया गया । जीन अभिव्यक्ति के लिए, टीईईआर मूल्यों के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि के लिए, और फिर एकत्र, तय, और रूपात्मक मूल्यांकनों के एक सेट को प्रस्तुत किया गया। एमटीटी तकनीक ने ऑर्गेनॉइड व्यवहार्यता का आकलन करने में अच्छा प्रदर्शन किया, लेकिन उच्च सामग्री विश्लेषण (एचसीए) एपीएपी उपचार के जवाब में बहुत जल्दी विषाक्त घटनाओं का पता लगाने में सक्षम थे। हमने सत्यापित किया कि मीडिया प्रवाह एपीएपी अवशोषण को काफी प्रभावित नहीं करता है जबकि यह यकृत समकक्ष कार्यक्षमता में काफी सुधार करता है। एपीएपी मानव आंतों के अवशोषण और हेपेटिक चयापचय को सांसदों में अनुकरण किया जा सकता है। एमपीएस डेटा और सिलिको मॉडलिंग के बीच सहयोग में इन विट्रो विधियों की पूर्वानुमेयता में सुधार करने और फार्माकोकाइनेटिक और विष विज्ञानी अध्ययनों में पशु मॉडल की तुलना में बेहतर सटीकता प्रदान करने की काफी क्षमता है।

Introduction

जीनोमिक और प्रोटेओमिक मतभेदों के कारण, पशु मॉडल में कई मानव परिणामों के लिए सीमित भविष्य कहनेवाला मूल्य होता है। इसके अलावा, वे समय लेने वाली, महंगी और नैतिकता की दृष्टि से संदिग्ध1हैं । सांसदों एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है कि भविष्य कहनेवाला शक्ति में सुधार लाने और लागत और पूर्व नैदानिक परीक्षणों के साथ बिताए समय को कम करने के उद्देश्य है । वे मीडिया प्रवाह के तहत ऑर्गेनॉइड (अंगों की कृत्रिम मिमेटिक्स कार्यात्मक इकाइयों) की खेती करने वाले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण हैं जो ऑर्गेनॉइड-ऑर्गेनॉइड संचार को बढ़ावा देते हैं। मानव कोशिकाओं से बने ऑर्गेनॉइड अनुवादात्मक प्रासंगिकता को बढ़ाते हैं2,3,4. सांसदों को पशु परीक्षणों से बेहतर प्रदर्शन करने की उम्मीद है क्योंकि वे आनुवंशिक रूप से मानव हैं और ऊतकों के बीच परस्पर क्रिया को फिर से शुरू करते हैं । जब पूरी तरह से कार्यात्मक, सांसदों अधिक सार्थक परिणाम प्रदान करेगा, उच्च गति और कम लागत और जोखिम4पर । कई समूहों के कई प्रयोजनों के लिए सांसदों को विकसित कर रहे हैं, विशेष रूप से रोग मॉडल दवा की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए ।

दवा की प्रभावकारिता और विषाक्तता 5 , 6 , 6 , 8 ,9,10,11,12के मूल्यांकन के लिए एक्सपोजर स्तर सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों मेंसेएक है । एमपीएस ऑर्गेनॉइड एकीकरण की अनुमति देता है जो प्रणालीगत एक्सपोजर का अनुकरण करता है और पारंपरिक 2डी मानव ऊतक संस्कृति की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करने की उम्मीद है। इस तकनीक से आंतों के अवशोषण और यकृत चयापचय4की भविष्यवाणी में काफी सुधार हो सकता है ।

आंत और यकृत के मानव समकक्ष मॉडल को एकीकृत करने वाला सांसद दवा जैव उपलब्धता और प्रणालीगत एक्सपोजर13, 14, 15में इन दोनों अंगों की केंद्रीय भूमिका को ध्यान मेंरखतेहुएएक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। एपीएपी बिना किडनी के बिना किसी एमपीएस का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक दवा है क्योंकि इसका मेटाबोलाइजेशन मुख्य रूप से लिवर16,17द्वारा किया जाता है ।

2-ओसी एक दो-कक्ष माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस है जो माइक्रोचैनल16से जुड़े दो अलग-अलग मानव समकक्ष ऊतकों/ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के लिए उपयुक्त है। एक दवा के इन विट्रो मानव मौखिक/नसों में प्रशासन का अनुकरण करने और एपीएपी फार्माकोकिनेटिक्स पर आंत और यकृत समकक्ष के बीच क्रॉस-टॉक के प्रभावों का आकलन करने के लिए, ऑर्गेनॉइड कार्यक्षमता और व्यवहार्यता के अलावा, तीन अलग-अलग सांसदों की विधानसभाओं का प्रदर्शन किया गया: (1) एक "आंत 2-ओसी एमपीएस" जिसमें एक संस्कृति सम्मिलित एक संस्कृति में आधारित आंत के समकक्ष शामिल थे, जिसमें 2-ओसी डिवाइस में एकीकृत कैको-2 + एचटी-29 कोशिकाएं coculture होती हैं; (2) एक "जिगर 2-ओसी सांसदों" हेपआरजी + HHSteC (मानव हेपेटिक स्टेलेट सेल) 2-ओसी डिवाइस में एकीकृत से बने जिगर स्फेरॉइड के शामिल; और (3) एक "आंत/जिगर 2-ओसी सांसदों" एक उपकरण डिब्बे में आंत समकक्ष के शामिल microfluidic चैनलों के माध्यम से मीडिया प्रवाह द्वारा दूसरे में जिगर समकक्ष के साथ संवाद ।

कोशिका व्यवहार्यता और कार्यक्षमताओं18, 19,20पर यांत्रिक उत्तेजनाओं (संपीड़न, खींच, और कतरनी) के प्रभाव के कारण स्थिर (कोई प्रवाह नहीं) और गतिशील (प्रवाह के साथ) स्थितियों के तहत सभी परख किए गए थे। वर्तमान लेख APAP मौखिक/नसों में प्रशासन अनुकरण और संबंधित अवशोषण/चयापचय और विषाक्त विश्लेषण के लिए 2-ओसी मानव आंत और जिगर समकक्ष मॉडल युक्त सांसदों में प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।

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Protocol

1. 2-ओसी में खेती के लिए ऊतक समकक्ष का उत्पादन

  1. छोटी आंत बाधा समकक्ष उत्पादन
    1. आंत समकक्ष माध्यम का उपयोग करके कैको-2 और एचटी-29 कोशिकाओं को बनाए रखें: डीएमईएम 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक है, जिसे इस पांडुलिपि में "डीएमईएम एस" के नाम से नामित किया गया है।
    2. माध्यम निकालें, 1x डीपीबीएस के साथ दो बार धोएं और सेल कल्चर फ्लास्क (175 सेमी 2) में उगाई जाने वाली कैको-2 कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन/ईडीटीए के8मिलियन एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और कम से कम ट्राइप्सिन अवरोधक की दोगुनी मात्रा जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें। एचटी-29 कोशिकाओं के लिए एक ही प्रक्रिया का प्रदर्शन करें, अभिकर् प के संस्करणों को समायोजित करें क्योंकि इन कोशिकाओं की थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है और उन्हें छोटे फ्लास्क (75 सेमी2)में बनाए रखा जाता है।
    3. 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, दोनों ट्यूबों से सुपरनैंट को हटा दें, और डीएमईएम एस काउंट कोशिकाओं के 10 एमएल में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें, 80% से अधिक सेल व्यवहार्यता का आश्वासन दें। Aseptically एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में सेल संस्कृति आवेषण पहले बेसोलाटेरल पक्ष में अच्छी तरह से डीएमईएम एस के ४०० μL से भरा (जो मानव खून का प्रतिनिधित्व करता है) ।
    4. 9:121के अनुपात में Caco-2 और एचटी-29 कोशिकाओं की सह-खेती । डीएमईएम एस के 200 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में प्रत्येक आंत के समकक्ष 2.25 x 105 कैको-2 और 2.5 x 104 एचटी-29 कोशिकाओं का उपयोग करें ऑर्गेनॉइड की वांछित संख्या के अनुसार सेल नंबर और वॉल्यूम को समायोजित करें। सावधानी से मिलाएं।
    5. प्रत्येक डालने के एपिकल साइड (जो मानव आंतों के ल्यूमेन पक्ष का प्रतिनिधित्व करता है) में सेल समाधान के पिपेट 200 माइक्रोन, प्रति डालने 250,000 कोशिकाओं को सीडिंग करते हैं। तीन सप्ताह22के लिए आवेषण में कोशिकाओं को सह-खेती । सप्ताह में कम से कम तीन बार माध्यम बदलें, इसे बाँझ पाश्चर पिपेट के साथ एपिकल और बेसोलेटरल दोनों पक्षों से प्राप्त करें, इस बात का ध्यान रखें कि बरकरार सेल बैरियर को नुकसान न पहुंचाएं।
      नोट: एपिकल साइड पर आकांक्षा के साथ आगे बढ़ें, ताकि सेल बैरियर को स्पर्श न करें (सेल डालने के प्लास्टिक रिम पर पाश्चर पिपेट का समर्थन करके एस्पिरेट करें)।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, वोल्टमीटर23का उपयोग करके हर तीन दिन में टीयर (ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस) को मापकर तंग मोनोलेयर गठन की जांच करें।
      1. एक खाली प्रदर्शन, कोशिकाओं के बिना एक सेल संस्कृति डालने भर में प्रतिरोध को मापने, लेकिन एक ही सेल माध्यम के साथ और एक ही सेल प्लेट पर ।
      2. ऊतक-समकक्ष प्रतिरोध से खाली प्रतिरोध को घटाकर ऊतक प्रतिरोध की गणना करें, और फिल्टर झिल्ली (0.6 सेमी2)के प्रभावी सतह क्षेत्र से गुणा करें। एक अच्छी आंत बाधा प्रतिरोध 150 से 400 Ω∙ सेमी2की सीमा में है।
        नोट: 21 दिनों के बाद कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग किया जाना चाहिए और आंतों की बाधा का गठन किया जाना चाहिए, इसलिए आंत के समकक्ष सांसदों में एकीकृत होने के लिए तैयार हैं।
  2. जिगर समकक्ष उत्पादन
    1. लिवर समकक्ष माध्यम का उपयोग करके हेपआरजी कोशिकाओं को बनाए रखें, जो विलियम के मध्यम ई 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 m L-ग्लूटामाइन, १०० इकाइयों/mL पेनिसिलिन, १०० μg/mL streptomycin, 5 μg/mL मानव इंसुलिन और 5 x10-5 M हाइड्रोकॉर्टिसोन के साथ पूरक है, और इस पांडुलिपि में "विलियंस ई एस" नाम है । हर 2-3 दिनों में हेपआर्ग मीडिया को नवीनीकृत करें और हेपेटोसाइट्स और कोलंगियोसाइट्स में भेदभाव शुरू करने के लिए दो सप्ताह तक सेल संस्कृति बनाए रखें।
    2. पहले दो हफ्तों के बाद, सेल भेदभाव 24, 25 को पूरा करने के लिए अतिरिक्त दो सप्ताह के लिए हेपार्ग के माध्यम में2%डीएमएसओ जोड़ें। स्टेलाट सेल मीडिया (SteC सीएम) में HHSTeC बढ़ो, पॉली-एल-lysine-लेपित सेल संस्कृति फ्लास्क का उपयोग कर, हर दो या तीन दिनों में मीडिया बदल रहा है ।
    3. माध्यम निकालें, 1x डीपीबीएस के साथ दो बार धोएं और सेल कल्चर फ्लास्क (175 सेमी2)में उगाई जाने वाली हेपैर्ग कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन/ईडीटीए के 8 मिलियन एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और ट्राइप्सिन अवरोधक की मात्रा को कम से कम दोगुना जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें। एचएचएसटीसी के लिए समान प्रदर्शन करें, अभिकर् ताप की मात्रा को अनुकूल बनाएं क्योंकि इन कोशिकाओं की थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है और उन्हें छोटे फ्लास्क (75 सेमी2)में बनाए रखा जा सकता है।
    4. 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर दोनों अपकेंद्रित्र, सुपरनैंट को हटा दें और विलियम्स ई एस माध्यम में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं की गणना करें, 80% से अधिक सेल व्यवहार्यता का आश्वासन देती हैं।
    5. विलियम्स ई एस माध्यम16में क्रमशः 24:1 के अनुपात में हेपआरजी और एचएचएसटीसी कोशिकाओं के संयोजन से जिगर के गोलाकार उत्पन्न करें। 80 माइक्रोल की मात्रा में 50,000 कोशिकाओं के प्रत्येक यकृत स्पेरोइड की रचना करने के लिए 4.8 x 104 विभेदित हेपार्ग और 0.2 x 104 एचएचएसटीसी जोड़ें। सेल संख्या और मात्रा को 80 माइक्रोन की मात्रा में समायोजित करें। सावधानी से मिलाएं।
    6. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, 384 स्फेरोइड माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में संयुक्त सेल पूल के 80 माइक्रोल को वितरित करें, जिसमें अच्छी तरह से नीचे ज्यामिति है।
      नोट: चार दिनों के बाद, लगभग 300 माइक्रोन के गोलाकार बनते हैं।
    7. चौड़े बोर युक्तियों का उपयोग करके, यकृत स्फेरॉइड को अल्ट्रा-कम-अटैचमेंट 6 अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करें, जो आवश्यक "एक-एक करके" गिनती की अनुमति देता है।

2. एक 2-ओसी सांसदों में आंत और जिगर समकक्ष का एकीकरण

  1. आंत 2-ओसी सांसदों अवशोषण परख के लिए विधानसभा
    1. 2-ओसी के बड़े डिब्बे में डीएमईएम एस के पिपेट 500 माइक्रोन और छोटे में 300 माइक्रोल। 24 अच्छी तरह से प्लेटों में प्रत्येक आंतों की बाधा समकक्ष के बेसोअटरियल और एपिकल मीडिया को एस्पिरेट करें। बाँझ संदंश का उपयोग करना, विशेष रूप से बड़े डिब्बे में प्रति 2-ओसी सर्किट में एक डालें एकीकृत करें। एपिकल साइड में आंत मीडियम का 200 माइक्रोल लगाएं।
      नोट: सांसदों में ऑर्गेनॉइड को एकीकृत करते समय बुलबुले के गठन से बचें।
    2. एमपीएस को नियंत्रण इकाई से कनेक्ट करें, जिसे दबाव वाली हवा की आपूर्ति से जोड़ा जाना चाहिए। मापदंडों को निर्धारित करें: लगभग, ±300 बार और 0.3 हर्ट्ज की पंपिंग आवृत्ति का दबाव। परीक्षण पदार्थ प्रशासन से पहले प्रवाह 24 घंटे शुरू करें। अगले दिन, एपीएपी उपचार करें।
  2. जिगर 2-ओसी सांसदों चयापचय परख के लिए विधानसभा
    1. बड़े डिब्बे में विलियम्स ई एस के पिपेट 650 माइक्रोन और छोटे डिब्बे में 350 माइक्रोन, जो स्फेरॉइड प्राप्त करेंगे। अल्ट्रा-लो-अटैचमेंट 6 वेल प्लेट्स में वाइड-बोर टिप्स का इस्तेमाल करते हुए स्पेरोइड्स गिनें। प्रत्येक यकृत के समतुल्य बीस स्फेरॉइड26से बना है । वाइड-बोर टिप्स का उपयोग करके, प्रति सर्किट बीस यकृत समकक्षों को एकीकृत करें, जो केवल ऑर्गेनॉइड के हस्तांतरण को 2-ओसी के छोटे डिब्बे में अनुमति देता है।
    2. एमपीएस को नियंत्रण इकाई से कनेक्ट करें, जिसे दबाव वाली हवा की आपूर्ति से जोड़ा जाना चाहिए। मापदंडों को निर्धारित करें: लगभग, ±300 बार और 0.3 हर्ट्ज की पंपिंग आवृत्ति का दबाव। परीक्षण पदार्थ प्रशासन से पहले प्रवाह 24 घंटे शुरू करें। अगले दिन, एपीएपी उपचार करें।
  3. आंत/जिगर 2-ओसी सांसदों अवशोषण और चयापचय परख के लिए विधानसभा
    1. दो मीडिया (आंत और जिगर) को 1:4 अनुपात में मिलाएं, जिसका अर्थ है आंत एपिकल साइड में डीएमईएम एस के 200 माइक्रोन और बेसोटेरल साइड में विलियम्स ई एस के 800 माइक्रोन। आंत और जिगर के समकक्ष को एकीकृत करें, साथ ही, 2-ओसी में।
    2. एमपीएस को नियंत्रण इकाई से कनेक्ट करें, जिसे दबाव वाली हवा की आपूर्ति से जोड़ा जाना चाहिए। मापदंडों को निर्धारित करें: लगभग, ±300 बार और 0.3 हर्ट्ज की पंपिंग आवृत्ति का दबाव। परीक्षण पदार्थ प्रशासन से पहले प्रवाह 24 घंटे शुरू करें। अगले दिन, एपीएपी उपचार करें।
      नोट: सभी प्रयोगों के लिए, ट्रिपलिकेट में हर बार बिंदु प्रदर्शन करते हैं, जिसका अर्थ है तीन अलग 2-ओसी सर्किट (यानी, 1 और 1/2 2-ओसी डिवाइस)। प्रत्येक 2-ओसी सर्किट की कुल मात्रा 1 एमसीएल है।

3. एसीटामिनोफेन (एपीएपी) तैयारी

  1. एपीएपी स्टॉक समाधान तैयार करें, पूर्ण इथेनॉल में एपीएपी को भंग करें। प्रयोग के दिन, संबंधित माध्यम (एपीएपी समाधान) में एपीएपी को पतला करें, "मौखिक प्रशासन" के लिए 12 माइक्रोन की एकाग्रता और "नसों में प्रशासन" के लिए 2 माइक्रोनएम।
  2. सुनिश्चित करें कि वाहन नियंत्रण और उपचार समाधान में इथेनॉल की अंतिम एकाग्रता दोनों प्रशासनों के लिए 0.5% है। सकारात्मक नियंत्रण (100 mM APAP) के लिए, इथेनॉल एकाग्रता 2% है।

4. परीक्षण पदार्थ प्रशासन और मीडिया नमूना

  1. APAP "मौखिक" प्रशासन और मीडिया नमूना
    1. 2-ओसी में प्रत्येक आंतों की बाधा के बराबर बेसोलेटरल और एपिकल मीडिया को एस्पिरेट करें। पिपेट 500 माइक्रोन उपयुक्त संस्कृति माध्यम के ऑर्गेनॉइड बेसोलाटेरल साइड में बड़े डिब्बे में और 300 माइक्रोन को छोटे डिब्बे में।
    2. बुलबुले की जांच करें और मौखिक प्रशासन की नकल करते हुए, एपिकल साइड में परीक्षण पदार्थ के साथ आंतों की बाधा समकक्ष उपचार के साथ आगे बढ़ें। आंतों की संस्कृति आवेषण के एपिकल साइड पर 12 माइक्रोन एपीएपी समाधान के 200 माइक्रोन जोड़कर एपीएपी "मौखिक" प्रशासन का अनुकरण करें, जो आंतों के "ल्यूमेन साइड"(चित्रा 1B)का प्रतिनिधित्व करता है। एमपीएस को कंट्रोल यूनिट से कनेक्ट करें।
    3. निम्नलिखित समय बिंदुओं पर एपिकल और बेसोटेरल पक्षों से कुल मात्रा एकत्र करें: 0 एच, 5 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट, 1 घंटे, 3 एच, 6 एच, 12 घंटे, और 24 एच15,27। त्रिपालेट में सभी प्रयोगों को करें, स्थिर और गतिशील परिस्थितियों में, और प्रत्येक नमूना, प्रत्येक ट्रिपलिकेट के, एक अलग माइक्रोट्यूब में एकत्र करें। एचपीएलसी/यूवी का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें।
      नोट: अलग एपिकल और बेसोटेरल नमूने।
  2. APAP "नसों में" प्रशासन और मीडिया नमूना
    1. जिगर के डिब्बे में सीधे 2 μM APAP समाधान प्रशासन द्वारा "नसों में" मार्ग का अनुकरण करें। सभी 2-ओसी मध्यम सामग्री को एस्पिरेट करें। विलियम्स ई एस के पिपेट 650 माइक्रोन जिसमें परीक्षण पदार्थ बड़े डिब्बे में होता है और एक ही मीडिया के 350 माइक्रोन छोटे डिब्बे में होते हैं जिसमें 20 स्फेरोइड होते हैं। निम्नलिखित समय बिंदुओं पर सभी वॉल्यूम एकत्र करें: 0 एच, 30 मिनट, 1 एच, 2 एच, 3 एच, 6 एच, 12 एच, और24 एच 27,28।
    2. स्थिर और गतिशील परिस्थितियों में, ट्रिपलिटेट में सभी प्रयोगों को करें। प्रत्येक नमूना, प्रत्येक ट्रिपलिकेट के, एक अलग माइक्रोट्यूब में ले लीजिए। एचपीएलसी/यूवी का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें।

5. इंस्ट्रूमेंटेशन और क्रोमेग्राफिक स्थितियां

  1. एचपीएलसी विश्लेषण
    1. तालिका 1के अनुसार एचपीएलसी विश्लेषण के लिए सभी प्रासंगिक मापदंडों को निर्धारित करें।
    2. वैक्यूम के तहत 0.45 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से मोबाइल चरण को फ़िल्टर करें। नमूनों को 0.22 माइक्रोन पोर आकार पीवीडीएफ सिरिंज फिल्टर (व्यास 13 मिमी) के माध्यम से फ़िल्टर करें और उन्हें एक शीशी में स्टोर करें। माप शुरू करें।
  2. स्टॉक समाधान, अंशांकन मानक, और गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमूने
    1. अमोनियम एसीटेट बफर (100 mm, पीएच 6.8) में एपीएपी स्टॉक समाधान के 10 mm तैयार करें और डीएमईएम एस और विलियम्स ई एस सेल कल्चर मीडिया के साथ अमोनियम एसीटेट बफर (1:1, v/v) के साथ पतला करने के लिए 0.25 से 100.00 एमμ तक के कामकाजी समाधानों को प्राप्त करने के लिए आगे पतला करें।
    2. ट्रिपलीकेट में अंशांकन नमूनों का एक सेट शामिल करें और साथ ही त्रिपालेट में चार स्तरों पर गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों को शामिल करें। सीरियल कमजोर पड़ने से इन मानकों को तैयार करें।
    3. एपीएपी पीक क्षेत्रों बनाम एपीएपी नाममात्र मानक सांद्रता के अंशांकन घटता बनाएं। प्रत्येक अंशांकन वक्र के लिए रैखिक प्रतिगमन फिट निर्धारित करें। दृश्य निरीक्षण, सहसंबंध गुणांक, अंतर और अंतर-भाग सटीकता और सटीक मूल्यों द्वारा विभिन्न अंशांकन मॉडल की अच्छाई-फिट का मूल्यांकन करें।
    4. DMEM एस और विलियंस ई एस मीडिया के खाली नमूने इंजेक्ट अमोनियम एसीटेट बफर में पतला (1:1, v/v) sextuplicate में । डीएमईएम एस और विलियम्स ई एस मीडिया में गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों के ट्रिपलिकेट तैयार करें, जो 0.50 (LOQ), 4.50, 45.00 और 90.00 माइक्रोन एम के एपीएपी सांद्रता के लिए अमोनियम एसीटेट बफर (1:1, v/v) के साथ पतला है।
    5. सुनिश्चित करें कि गुणवत्ता नियंत्रण नमूने एक नए स्टॉक समाधान से तैयार किए जाते हैं, जो मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अलग होते हैं। अंतर और अंतर-भागे विविधताओं की जांच करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों का उपयोग करें।
  3. सत्यापन प्रक्रियाएं
    1. 29,30पहले बताई गईप्रक्रियाओं के बाद बायोएनालिटिकल विधि सत्यापन करें । क्रमशः विलियम्स ई एस और डीएमईएम एस सेल कल्चर मीडिया को ध्यान में रखते हुए, पांच या छह अलग-अलग अवसरों पर क्रोमेग्राफिक चलाता है।
    2. सुनिश्चित करें कि डीएमईएम एस या विलियम्स ई एस सेल कल्चर मीडिया में एपीएपी के 0.25 से 100.00 माइक्रोन तक के अंशांकन बिंदुओं को अमोनियम एसीटेट बफर (1:1, वी/वी) में पतला किया जाता है, संबंधित नाममात्र सांद्रता (एक्स एक्सिस) के खिलाफ एपीएपी (एक्सिस वाई) के चरम क्षेत्रों के आधार पर प्लॉट किए जाते हैं। इन मानक अंशांकन घटता की ढलानों की तुलना अमोनियम एसीटेट बफर में तैयार अंशांकन वक्र की ढलानों के साथ करें। सुनिश्चित करें कि सभी अंशांकन घटता कम से कम 0.998 का एक सहसंबंध मूल्य है।
    3. पांच या छह अलग-अलग दिनों में चार अलग-अलग स्तरों LLOQ, निम्न, मध्य और उच्च गुणवत्ता वाले नियंत्रण पर प्रतिकृति का उपयोग करके सरोगेट मैट्रिक्स में एनालाइट के लिए सटीकता और सटीकता (इंट्रा और इंटर-रन) निर्धारित करें। डीएमईएम एस या विलियम्स ई एस सेल कल्चर मीडिया में एक ही दिन में अंतर-भागे सटीकता और सटीकता माप का प्रदर्शन करें, जिसमें 0.50, 4.50, 45.00 और 90.00 माइक्रोन एपीएपी सांद्रता (एन= 3) शामिल है।
    4. हाल ही में प्राप्त अंशांकन घटता से APAP सांद्रता युक्त गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों के प्रत्येक सेट का मूल्यांकन करें । ब्याज के यौगिक और संभावित अन्य क्रोमेग्राफिक चोटियों के पृथक्करण की डिग्री के द्वारा परख की चयनशीलता का परीक्षण करें।
  4. मात्राकरण (LLOQ) की कम सीमा और पता लगाने की सीमा (LOD)
    1. प्रतिक्रिया और ढलान दृष्टिकोण के मानक विचलन के आधार पर मात्राकरण (LLOQ) की निचली सीमा निर्धारित करें। फॉर्मूला 10α/S का उपयोग करके गणना करें, जहां α वाई-इंटरसेप्ट का मानक विचलन है और एस अंशांकन घटता29,30की साजिश रचने से प्राप्त सीधी रेखा की ढलान है। अंशांकन वक्र29,30की ढलान से विभाजित रिक्त स्थान के मानक विचलन को ध्यान में रखते हुए पता लगाने की सीमा (LOD) का अनुमान लगाएं।

6. ऊतक समकक्ष व्यवहार्यता/

  1. एमटीटी
    1. सांसदों परख के सभी समय बिंदुओं में ऑर्गेनॉइड व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक एमटीटी परख करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, सेल मीडिया प्लस वाहन का उपयोग करें। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 100 mM APAP और 1% NaOH सेल माध्यम में पतला के साथ ऑर्गेनॉइड का इलाज करें।
    2. एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में व्यक्तिगत कुओं के लिए प्रत्येक दोहराने के 20 गोलाकार स्थानांतरित करें, और सेल संस्कृति आवेषण, आंत समकक्ष युक्त, 24 अच्छी तरह से सेल प्लेटों के लिए, एक आंत के बराबर अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से रखकर। ऊतक समकक्ष को 1x डीपीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    3. एक 1 मिलीग्राम/एमएल एमटीटी समाधान के ३०० μL जोड़ें, संबंधित सेल माध्यम में पतला, प्रति अच्छी तरह से । मानक सेल संस्कृति की स्थिति में 3 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    4. एमटीटी समाधान को प्रत्येक अच्छी तरह से ध्यान से पाइपिंग करके निकालें। आंत और जिगर के समकक्ष से एमटीटी formazan निकालें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के प्रति अच्छी तरह से आइसोप्रोपैनॉल के 200 माइक्रोन का उपयोग कर।
      नोट: वाष्पीकरण को रोकने के लिए ढक्कन सील करें।
    5. 96 अच्छी तरह से माइक्रो टेस्ट प्लेट में संबंधित पूर्व-पहचाने गए अच्छी तरह से प्रत्येक सुपरनैंट के 200 माइक्रोल को स्थानांतरित करें। आइसोप्रोपनॉल को ब्लैंक के रूप में इस्तेमाल करें।
    6. 570 एनएम पर एक प्लेट रीडर में formazan अवशोषण पढ़ें। एमटीटी (%) नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में हर बार बिंदु के औसत ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग करना, 100% सेल व्यवहार्यता के रूप में माना जाता है।
  2. साइटोकेमिस्ट्री/हिस्टोलॉजी
    1. आंत और जिगर के समकक्ष को ठीक करें, कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए, 0.1 एम फॉस्फेट-नमकीन बफर, पीएच 7.4 में 4% (w/v) पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करके। पीबीएस बफर में ऑर्गेनॉइड को हर बार 10 मिनट के लिए 5 बार धोएं। आंतों और जिगर के समकक्ष टेट्रामेथाइलरोडामाइन आइसोथिओसाइनेट-फिलोइडिन या एलेक्सा फ्लोर 647 फालोडिन, पीबीएस31में 1:50 के साथ दाग दें।
    2. उन्हें पूरी ठंड तक तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले आरटी में acclimate करने के लिए कुछ मिनट के लिए अक्टूबर ठंड माध्यम में स्थानांतरित करें । क्रायोस्टेट का उपयोग करके, लगभग 10-12 माइक्रोन मोटी लिवर स्फेरॉइड क्रायोसेक्शन करें।
    3. दापी के साथ बढ़ते माध्यम में ऊतकों वर्गों माउंट। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा उनकी जांच करें।
    4. स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन धुंधला करने के लिए निर्धारण के बाद ऑर्गेनॉइड को फ्रीज करें। ऊपर वर्णित ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के बाद बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट और एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हिस्टोलॉजिकल छवियों ले ।
  3. उच्च सामग्री विश्लेषण
    1. कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु धुंधला
      1. 1 एमएम माइटोकॉन्ड्रियल स्टेनिंग स्टॉक सॉल्यूशन (जैसे, मिटोट्रैकर डीप रेड एफएम) बनाने के लिए डीएमएसओ में लियोफिलाइज्ड पाउडर का पुनर्गठन करें। प्रकाश से सुरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोटेड स्टॉक समाधान स्टोर करें। सीरम के बिना प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) ऊतक संस्कृति माध्यम में अंतिम एकाग्रता (200 एनएम) के लिए 1 m m माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला स्टॉक समाधान को पतला करें।
      2. सेल कल्चर मीडिया को हटा दें। 5% सीओ2के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-45 मिनट के लिए नमूना और इनक्यूबेट कोशिकाओं को पूरी तरह से कवर करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला समाधान जोड़ें।
      3. माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला काम समाधान को ध्यान से हटा दें और इसे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 2-4% पैराफॉर्मलडिहाइड फिक्सेटिव के साथ बदलें।
      4. तय कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धीरे से कुल्ला। धोने की प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
      5. अल्ट्रापुरे पानी के 10 एमएल में 100 मिलीग्राम होचस्ट 33342 डाई को घोलकर 10 मिलीग्राम/एमएल (16.23 मीटर) न्यूक्लिक एसिड स्टेनिंग स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें।
        नोट: स्टॉक समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित और संग्रहीत किया जाना चाहिए।
      6. पीबीएस में 0.2-2.0 μg/mL न्यूक्लिक एसिड स्टेनिंग वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए न्यूक्लिक एसिड धुंधला काम समाधान के साथ उतारना चाहते कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ।
      7. न्यूक्लिक एसिड धुंधला काम समाधान निकालें और कोशिकाओं को धीरे से 5 मिनट के लिए PBS के साथ तीन बार कुल्ला । कोशिकाओं को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए, प्रकाश से संरक्षित।
    2. माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु धुंधला विश्लेषण
      1. न्यूक्लिक एसिड दाग (λEx/λEm: 361/497 एनएम) और माइटोकॉन्ड्रियल दाग (λEx/λEm: 644/665 एनएम) के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं का विश्लेषण करें । न्यूक्लिक एसिड पॉजिटिव धुंधला और कोशिका संख्या की मात्रा से कोशिकाओं का पता लगाएं। माइटोकॉन्ड्रिया में माइटोकॉन्ड्रियल दाग फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  4. इमेजजे में मॉर्फोमेट्रिक माप (गोलाकार गणना)
    1. कोलंबस सॉफ्टवेयर से *.फ्लेक्स फ़ाइलों के रूप में निर्यात उच्च सामग्री विश्लेषण (एचसीए) छवियां। बायो-फॉर्मेट प्लगइन32: फाइल एंड जीटी इम्पोर्ट एंड जीटी और बायो-फॉर्मेटका उपयोग कर इमेजजे में ग्रेस्केल के रूप में फ्लैक्स फाइल करें ।
    2. आयात विकल्प विंडो में, हाइपरस्टैक देखने का चयन करें और स्प्लिट चैनलों को अलग-अलग खिड़कियों में विभाजित करने में सक्षम करें। यह विकल्प किसी विशेष चैनल (जैसे, डीएपीआई, माइटोट्रैकर आदि) में सभी फाइलों की पहुंच की अनुमति देगा। मेमोरी प्रबंधन के तहत उपयोग आभासी स्टैक का चयन न करें।
      नोट: छवियों में "धूल" के रूप में DAPI चैनल का उपयोग करना बेहतर है क्योंकि संस्कृति माध्यम यूवी तरंगदैर्ध्य (उदाहरण के लिए, 405 एनएम) में कम हो जाता है।
    3. पिक्सेल आकार(विश्लेषण और जीटी; सेट स्केल) कोसमायोजित करें यदि इसे .flex फ़ाइल में एम्बेडेड मूल्यों के अनुसार लोड नहीं किया गया था। शोर की अधिकता को दूर करने और आकार समोच्च में अनियमितताओं से बचने के लिए एक गॉसियन धुंधला फिल्टर लागू करें। प्रक्रिया और जीटी; फिल्टर और जीटी; गॉसियन धुंधला। 2.0 और 3.0 के बीच सिग्मा (त्रिज्या) का एक उच्च मूल्य अधिकांश मामलों के लिए आदर्श है। यदि स्टैक में कई छवियां हैं, तो उन सभी पर लागू करें (प्रक्रिया स्टैक विंडो में हाँ का चयन करें)।
    4. एक सीमा का उपयोग करके पृष्ठभूमि और ऑर्गेनॉइड (वस्तुओं) को अलग करने के लिए बाइनरी छवि उत्पन्न करें। क्लिक करें इमेज एंड जीटी; एडजस्ट करें और थ्रेसहोल्ड। छवि की तीव्रता के अनुसार मूल्यों को समायोजित करने के लिए लाल मुखौटा का उपयोग करें, ऑर्गेनॉइड आकार फिट करने के लिए, आकृति विज्ञान को बरकरार रखते हुए। यदि छवि की एक सफेद पृष्ठभूमि है तो डार्क बैकग्राउंड को अक्षम करें। आवेदन परक्लिक करें ।
    5. कन्वर्ट स्टैक में बाइनरी विंडो में, थ्रेसहोल्ड विधि चुनें। आमतौर पर, इस तरह की छवि प्रसंस्करण में डिफ़ॉल्ट या त्रिकोण पसंद किया जाता है। पृष्ठभूमि को अंधेरेके रूप में रखें । स्टैक में कई छवियां हों, तो प्रत्येक छवि के लिए सीमा की गणना करें।
    6. प्रक्रिया का चयन करें और जीटी; बाइनरी और जीटी; फिल होल। वैकल्पिक रूप से, पृष्ठभूमि से छेद निकालें। प्रक्रिया और जीटी में, बाइनरी और जीटी और विकल्पएस, ब्लैक बैकग्राउंड का चयन करें और फिर से फिल होल निष्पादित करें। अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले ब्लैक बैकग्राउंड विकल्प को अक्षम करें।
    7. अलग-अलग ऑब्जेक्ट्स। ऑर्गेनॉइड के लिए वाटरशेड मेथड एक अच्छा विकल्प है। क्लिक करें प्रक्रिया और जीटी; बाइनरी और जीटी; वाटरशेड। आकार विश्लेषण निष्पादित करें।
      1. विश्लेषण और जीटी सेट माप काचयन करें । कई विकल्प उपलब्ध हैं (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html में विवरण)। ऑर्गेनॉइड के लिए, क्षेत्रका चयन करें, मीन ग्रे मूल्य, न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मूल्य और आकार वर्णनकर्ता। वैकल्पिक रूप से, छवि और वैज्ञानिक नोटेशन में वस्तुओं की पहचान करने के लिए डिस्प्ले लेबल का चयन करें। ठीक क्लिककरें ।
      2. विश्लेषण का चयन करें और कणों का विश्लेषण करें। आकार और गोलाकारता सीमा चुनें। छवि में सभी वस्तुओं को मापने के लिए क्रमशः 0-अनंत और 0.00-1.00 रखें। शोमें, रूपरेखा चुनें ताकि वस्तुओं की पहचान की जाएगी। आउटपुट परिणामों के लिए प्रदर्शन परिणामों को सक्षम करें; सीमाओं को छूने वाले वस्तुओं को बाहर करने के लिए किनारों पर बाहर; छेद शामिल करें तो वस्तुओं में अंतिम आंतरिक छेद मुख्य आकार के हिस्से के रूप में माना जाता है।
    8. हर छवि ढेर के लिए आकार विश्लेषण दोहराएं और परिणाम एक ही तालिका में संलग्न किए जाएंगे। कॉमा अलग मान (.csv) फ़ाइल के रूप में फाइल में निर्यात परिणाम तालिका और सहेजें...
  5. रियल टाइम पीसीआर
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए फिनोल और ग्वानिडीन आइसोथियोसाइनेट के मोनोफेसिक समाधान का उपयोग करके ऊतक समकक्ष से आरएनए निकालें।
    2. कुल आरएनए के 1 - 2 माइक्रोन के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा सीडीएनए संश्लेषण करें।
    3. वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर करने के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमर(तालिका 5)का उपयोग करके सभी लक्ष्यों को बढ़ाना। प्रत्येक क्यूआरटी-पीसीआर में रिवर्स-लिखित आरएनए की 30 एनजी और प्रत्येक प्राइमर के 100 एनएम शामिल हैं।
    4. पीसीआर शर्तों का पालन करें: 3 मिनट (1 चक्र) के लिए 50 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट (1 चक्र) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 59 डिग्री सेल्सियस और 45 सेकंड (35 - 40 चक्र) के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
  6. सीईपी परख
    1. जिगर 2-ओसी विधानसभा के लिए धारा 2.2 का पालन करें। प्रायोगिक समूह नो-सेल नियंत्रण, एपीएपी 2 माइक्रोनएम उपचार 12 एच, 24 एच और वाहन नियंत्रण के लिए हैं। एपीएपी 2 माइक्रोनएम तैयारी और उपचार के लिए अनुभाग 3.3 और 4.2 का पालन करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी नमूने सीवाईपी परख के लिए एक ही समय में तैयार होंगे, 24 घंटे उपचार शुरू करने के 12 घंटे बाद 12 घंटे का उपचार शुरू करें। 0.5% इथेनॉल समाधान के साथ सीआईपी गतिविधि के नो-सेल नियंत्रण के साथ-साथ वाहन नियंत्रण का इलाज करें।
    2. गल 3 m luminogenic कमरे के तापमान पर स्टॉक समाधान सब्सट्रेट और विलियम ई एस प्रकाश से रक्षा में एक 1:1000 कमजोर पड़ने बनाते हैं ।
    3. गोलाकार ले लीजिए और प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह को 96-अच्छी प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें। माध्यम निकालें, 1x डीपीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं और प्रति अच्छी तरह से 3 माइक्रोन सब्सट्रेट समाधान के 80 माइक्रोन जोड़ें। विलियम के ई एस मीडियम में नो-सेल कंट्रोल रखें । पृष्ठभूमि नियंत्रण के लिए गोलाकार या सब्सट्रेट समाधान के बिना एक अच्छी तरह से बचाएं। 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित।
    4. एस्टेरेस के साथ पुनर्गठन बफर का उपयोग करके लिओफिलाइज्ड लूसिफ़ेरिन डिटेक्शन रिएजेंट (एलडीआर) को इक्विलिब्रेट करें। घूमता या उलटा करके मिलाएं। अगले चरण तक कमरे के तापमान पर विनियोजित मात्रा स्टोर करें।
      नोट: पुनर्गठित एलडीआर को 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर या 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गतिविधि के नुकसान के बिना संग्रहीत किया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, एक सफेद अपारदर्शी ९६-वेल माइक्रोप्लेट के तीन विभिन्न कुओं में बरकरार स्फेरॉइड के सुपरनेट के 25 माइक्रोनल को स्थानांतरित करें । प्रति अच्छी तरह से एलडीआर के 25 माइक्रोन जोड़ें और समरूप।
    6. कमरे के तापमान पर सफेद प्लेट को 20 मिनट तक इनक्यूबेट करें। एक ल्यूमिनोमीटर पर ल्यूमिनेसेंस पढ़ें। फ्लोरोमीटर का इस्तेमाल न करें।
    7. परीक्षण यौगिक-उपचारित और अनुपचारित (वाहन नियंत्रण) मूल्यों से पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस मूल्यों (नो-सेल नियंत्रण) को घटाकर शुद्ध संकेतों की गणना करें। शुद्ध अनुपचारित मूल्यों द्वारा शुद्ध इलाज मूल्यों को विभाजित करके और 100 से गुणा करके CYP3A4 गतिविधि के प्रतिशत परिवर्तन की गणना करें।
  7. पश्चिमी धब्बा
    1. लिवर स्फेरॉइड को पहचाने गए 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें। माध्यम निकालें और 1x डीपीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं।
    2. लिवर को 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल लाइसिस रिपा बफर के 100 माइक्रोन में लिस्लेट करें। 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस, और 11000 आरपीएम के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनेट को दूसरे पहचाने गए 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. ब्रैडफोर्ड विधि के माध्यम से प्राप्त प्रोटीन की मात्रा की मात्रा निर्धारित करें। निर्धारित कोशिका से प्रोटीन के 10 और 50 माइक्रोन के बीच लोड एक ढाल पॉलीएक्रीलामाइड जेल 3-15% के प्रति अच्छी तरह से lysate और एक एसडीएस-पेज प्रदर्शन करते हैं।
    4. लोडेड प्रोटीन को जेल से सेमी-ड्राई सिस्टम उपकरण के माध्यम से 0.22 माइक्रोन पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें। 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल और 192 एमएम ग्लाइसिन के ट्रांसफरेंस सॉल्यूशन का इस्तेमाल करें। स्थानांतरित किए जाने वाले जैल की संख्या के अनुसार उपकरण पैरामीटर सेट करें (एक समय में 1 से 2)।
    5. टीबीएस-टी बफर में 3-5% स्किम मिल्क सॉल्यूशन के साथ पीवीडीएफ झिल्ली पर गैर-विशिष्ट बातचीत को अवरुद्ध करें: ट्रिस-बफर खारा (50 m M Tris पीएच 7.6, 150 m सोडियम क्लोराइड) ट्वीन 20 के 0.1% के साथ पूरक। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धीरे से लगातार मिलाते हुए झिल्ली के तहत झिल्ली रखें।
    6. कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट के लिए धीरे लगातार मिलाते हुए के तहत टीबीएस-टी के साथ धोएं । इस वाशिंग स्टेप को दो बार दोहराएं।
    7. टीबीएस-टी पर क्रमशः 1:1000 और 1:2000 के लिए पतला एल्बुमिन और विनक्यूलिन प्राथमिक एंटीबॉडी। धीरे-धीरे लगातार झटकों के तहत, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
      नोट: एंटीबॉडी को पतला करने के लिए हमेशा निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    8. प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें और झिल्ली को 3 बार धोएं (चरण 6.7.6)। टीबीएस-टी पर 1:5000 को तनु ईसीएल एंटी-माउस आईजीजी सेकेंडरी एंटीबॉडी। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए धीरे लगातार मिलाते हुए के तहत एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली इनक्यूबेट।
    9. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और झिल्ली (चरण 6.7.6) धोएं। ईसीएल वेस्टर्न ब्लॉटिंग सब्सट्रेट का उपयोग करके प्रोटीन का पता लगाइए। 30 s से 30 मिनट के लिए ऑटोरेडियोग्राफिक फिल्मों का पर्दाफाश करें। ट्रिपलिटेरेट में इम्यूनोब्लोटिंग डिटेक्शन करें।

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Representative Results

2-ओसी सांसदों में पीके एपीएपी परीक्षण करने के लिए, पहला कदम मानव आंत और यकृत समकक्ष (ऑर्गेनॉइड) का निर्माण करना है। वे पीके APAP परख शुरू करने से पहले 2-ओसी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस(चित्रा 1A)24 घंटे में एकीकृत कर रहे हैं । अगले दिन, माध्यम बदल जाता है, और मॉडल APAP के संपर्क में आता है। चित्रा 1 आंत और जिगर के समकक्ष 2-ओसी डिवाइस(चित्रा 1B)और APAP पीके प्रयोग समय पाठ्यक्रम(चित्रा 1C)के अंदर रखा दिखाता है । हमने ऊतक की व्यवहार्यता की जांच करने और संभावित एपीएपी विषाक्त प्रभावों का पता लगाने के लिए 2डी संस्कृति और 3डी ऑर्गेनॉइड में एक एमटीटी परख, टीयर माप, एचसीए, वास्तविक समय पीसीआर, पश्चिमी ब्लॉटिंग, हिस्टोरोलॉजी, और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में, DAPI और Phalloidin के साथ दाग आंत समकक्ष नमूनों (क्रमशः नाभिक और actin के लिए) गैर इलाज(चित्रा 2A)और 12 μM APAP इलाज नमूनों(चित्रा 2B)के लिए एक समीपस्थ बाधा के रूप में प्रस्तुत किया गया । जैसा कि चित्र 2 सीमें देखा गया है, एमटीटी परख ने सापेक्ष कोशिका व्यवहार्यता स्तर को 70% से ऊपर दिखाया, जो 12 माइक्रोन एकाग्रता33, 34,35, 36,37 पर एपीएपी एक्सपोजर के जवाब में प्रासंगिक साइटोटॉक्सिक प्रभावों के अभाव का संकेतदेताहै। सकारात्मक नियंत्रण (100 mm) ने महत्वपूर्ण सेल डेथ (5% से नीचे जीवित रहने) को प्रेरित किया। Caco-2/HT-29 व्यवहार्यता और उचित भेदभाव के साथ ही आंत समकक्ष बाधा अखंडता भेदभाव अवधि(चित्रा 2 डी)के दौरान TEER विकास द्वारा सत्यापित किया गया । एपीएपी ने टीईईआर मूल्यों में कोई परिवर्तन नहीं किया जैसा कि चित्र 2Eमें दिखाया गया है । सेल बाधाओं के गठन और बेसल कार्यक्षमता पर एपीएपी उपचार प्रभाव को सत्यापित करने के लिए सक्रिय सोडियम-युग्मित ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर SLC5A1, मल्टीड्रग प्रतिरोध ट्रांसपोर्टर MDR1 और सोडियम-पोटेशियम ATPase की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया। जैसा कि चित्रा 2एफ-एचमें प्रदर्शित किया गया है, गैर-इलाज और एपीएपी इलाज आंत समकक्ष दोनों ने SLC5A1 और NaKATPase की समान अभिव्यक्ति दिखाई है। 12 माइक्रोन एपीएपी के मौखिक प्रशासन ने 24 घंटे(चित्रा 2H)के बाद आंतों के समकक्ष में एमडीआर1 एमआरएनए के स्तर में वृद्धि को चिह्नित किया। हमने नाभिक और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान सामग्री के लिए फ्लोरोफोर डाई मिश्रण द्वारा सेल फेनोटाइपिक परिवर्तनों के एचसीए का भी प्रदर्शन किया। सकारात्मक नियंत्रण 100 mM APAP और 1% NaOH थे।

इसके अतिरिक्त, हमने विश्लेषण किया कि क्या 12 माइक्रोन एपीएपी साइटोटेक्सीसिटी को 2डी कैको-2/एचटी-29 सह-संस्कृति के लिए प्रेरित कर सकता है। चित्रा 2 में दिखाए गए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त आंतों की कोशिकाओं की छवियां एमटीटी डेटा की पुष्टि करती हैं, जिसने यह दर्शाया है कि 12 माइक्रोनएम एपीएपी ने कैको-2/एचटी-29 आंतों के समकक्ष में महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिकिटी का कारण नहीं 100 वां।

2 माइक्रोन एएम एपीएपी के जवाब में हेपेटिक गोलाकार बेसल व्यवहार्यता और साइटोटॉक्सीसिटी का मूल्यांकन एमटीटी परख और रूपात्मक विश्लेषण द्वारा कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, एच एंड ई हिस्टोरोलॉजी और एचसीए परख द्वारा किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 एमें दिखाया गया है, एमटीटी परख स्थिर और गतिशील दोनों स्थितियों के तहत लिवर 2-ओसी असेंबली से लिए गए नमूनों में 2 माइक्रोन एपीए उपचार के जवाब में किसी भी प्रासंगिक साइटोटॉक्सिकिटी की पहचान करने में असमर्थ थी। सेल व्यवहार्यता में कमी आई लेकिन 12 घंटे और 24 घंटे समय - अंक 33 , 34 ,35,36,37दोनों के लिए80%से अधिक रही. सकारात्मक नियंत्रण उपचार (100 mM APAP और 1% NaOH) महत्वपूर्ण ऊतक क्षति (10% से नीचे व्यवहार्यता) प्रेरित किया। सूक्ष्म कॉन्फोकल छवियां बेसल या एपीएपी उपचार दोनों स्थितियों में यकृत स्फेरॉइड में एक परिगलित केंद्र की अनुपस्थिति का संकेत देती हैं, और महत्वपूर्ण मृत्यु दर(चित्र 3बी-सी)का कोई सबूत नहीं है। हालांकि, जब हमने एचसीए परख के माध्यम से 2D हेपार्ग/एचएचएसटीसी कोरकल्चर में वाहन या 2 μM APAP प्रशासन के बाद कई सेलुलर फेनोटाइपिक परिवर्तनों का विश्लेषण किया, तो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 100 mM APAP (सी +) का उपयोग करके, एमटीटी परख के परिणामों के विरोधाभासी, हेपेटिक कोशिकाओं ने 2 μMAP उपचार(चित्रा 3 3 डी)के लिए प्रारंभिक साइटॉक्सिक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं की संख्या में कमी, परमाणु क्षेत्र में और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान में वृद्धि हुई। इसके अतिरिक्त, एक फ्लोरोफोर डाई कॉकटेल जिसमें होचस्ट 33342 और मिटोट्रैकर डीप रेड का उपयोग 3 डी हेपेटिक स्पोरॉइड(चित्रा 3जे)को दागने के लिए किया गया था। फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कई गोलाकारों(चित्रा3ई-आई)के बीच 3 डी गोलाकार वास्तुकला एकरूपता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। चित्रा 3E में दिखाया गया ग्राफिक जिगर के कुल क्षेत्र के बीच समानता दिखाता है। आस्पेक्टरेशियो (चित्रा 3F)लगभग 1 का अर्थ है स्फेरॉइड की मिष्ठान्न प्रक्रिया के दौरान पूर्वाग्रह का अभाव। मूल्यांकन में यह भी संकेत दिया गया कि अधिकांश स्फेरॉइड मोटे तौर पर गोल थे(चित्रा 3जी)। आकृति विज्ञान परिधि और सेल वितरण का मूल्यांकन क्रमशः परिपत्रता(चित्रा 3I)और दृढ़ता गणना(चित्रा 3H)द्वारा किया गया था। हमने निष्कर्ष निकाला कि जिगर के स्फेरॉइड को मिष्ठान्न करने की पद्धति ने इस प्रक्रिया के दौरान गोलाकार विकास, कोई पूर्वाग्रह या परिगलन के साथ संगत, एक चिकनी परिधि के साथ ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किया था।

जैसा कि चित्र 4ए-बीमें प्रदर्शित किया गया है, यकृत स्फेरॉइड ने क्रमशः एल्बुमिन और जीएसटी एमआरएनए अभिव्यक्ति के सापेक्ष बेसल उच्च स्तर को दिखाया, जो उचित बेसल कार्यक्षमता का संकेत देता है। फिर भी, 24 घंटे के लिए 2 μM APAP उपचार एल्बुमिन और जीएसटी mRNA अभिव्यक्ति के स्तर में कमी प्रेरित, जिगर की हानि का सुझाव कार्यात्मक APAP उपचार के 24 घंटे के समय बिंदु पर ।

CYP3A4 और UGT1A1 mRNA अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने जिगर समकक्ष चयापचय क्षमता को दर्शाता है । CYP3A4 mRNA बेसल स्तर(चित्रा 4 सी)पिछली रिपोर्टों के अनुरूप था6. एपीएपी उपचार ने एपीएपी उपचार(चित्रा 4सी-डी)के जवाब में CYP3A4 mRNA और UGT1A1 अभिव्यक्ति दोनों में कमी के लिए एक प्रवृत्ति को प्रेरित किया, जो एक बार फिर से एपीएपी उपचार के 24 घंटे के समय बिंदु पर कार्यात्मक रूप से जिगर स्फेरॉइड की हानि की परिकल्पना की पुष्टि करता है।

इसके अतिरिक्त, एल्बुमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के साथ-साथ बेसल और एपीएपी उपचार स्थितियों में जिगर समकक्ष में CYP 3A4 गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग और इन विट्रो एंजाइमेटिक गतिविधि के प्रयोग किए गए थे। हमने पाया कि लिवर 2-ओसी एमपीएस में किए गए 2 μM APAP उपचार ने 12 घंटे और 24 घंटे के समय-अंक पर जिगर के समकक्ष कुल एल्बुमिन अभिव्यक्ति में कमी को प्रेरित किया, दोनों स्थिर(चित्रा 4E)और गतिशील(चित्रा 4F)की स्थिति में। दूसरी ओर, गतिशील परिस्थितियों से जिगर समकक्ष नमूनों ने स्थिर स्थितियों(चित्रा 4G)की तुलना में एल्बुमिन की प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को पेश करने के लिए एक प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया। CYP 3A4 इन विट्रो परख जिगर 2-OC सांसदों से जिगर समकक्ष पर प्रदर्शन से पता चला है कि 12 घंटे या 24 घंटे के लिए 2 μM APAP उपचार दोनों स्थिर और गतिशील स्थितियों(चित्रा 4एच-I)पर CYP 3A4 गतिविधि की एक मजबूत और महत्वपूर्ण हानि प्रेरित करने में सक्षम था । अधिक दिलचस्प, मीडिया प्रवाह (गतिशील) की उपस्थिति ने उन स्थितियों की तुलना में यकृत समकक्ष CYP 3A4 गतिविधि के स्तर में महत्वपूर्ण सुधार को प्रेरित किया है, जिनमें लिवर समकक्ष परिसंचारी माध्यम (स्थिर स्थितियों)(चित्रा 4J)के अभाव में रखे गए थे।

एचपीएलसी विश्लेषण के बारे में सबसे संवेदनशील विश्लेषणात्मक स्थिति खोजने के लिए, मोबाइल चरण की संरचना, एडिटिव्स के प्रकार और एकाग्रता सहित कई मापदंडों की जांच की गई। यह पाया गया कि एसीटोनीट्रिल ने मेथनॉल की तुलना में बेहतर क्रोमेटोग्राम संकल्प और उचित प्रतिधारण समय दिया। C18 उत्क्रमित चरण कॉलम का उपयोग करके एपीएपी का तेज और प्रजनन योग्य पृथक्करण प्राप्त किया गया था। एपीएपी रिटेंशन टाइम (आरटी) वैल्यू 9.27 ± 0.19 मिनट थी। APAP के लिए चयनशीलता चोटी के आकार और सममित संकल्प के साथ-साथ डीएमईएम और विलियम्स सेल कल्चर मीडिया से हस्तक्षेप करने वाली चोटियों की कमी से इंगित की जाती है।

डीएमईएम एस और विलियम्स ई एस सेल कल्चर मीडिया में एपीएपी मानक सांद्रता 0.25 से 100.00 माइक्रोन तक अमोनियम एसीटेट बफर (1:1, v/v) के साथ पतला अंशांकन घटता बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। विधि की रैखिकता नौ एकाग्रता स्तरों पर निर्धारित की गई थी। आंकड़े तालिका 2 और तालिका 3में दिखाए गए हैं। एपीएपी एकाग्रता और व्यस्ततम क्षेत्रों के बीच संबंध रैखिक प्रतिगमन समीकरणों द्वारा वर्णित किया गया था: वाई = 16106 * x + 3579.8 (आर2= 1, डीएमईएम माध्यम में) और वाई = 16397 * x + 2475.1 (आर2= 1, विलियम्स माध्यम में), जिसमें "एक्स" μM में एपीएपी नाममात्र एकाग्रता है और "वाई" एयूए में एपीएपी का क्रोमेटोग्राम पीक क्षेत्र है। मात्राकरण (यानी, 100.00 माइक्रोन) की ऊपरी सीमा पर, प्रतिशत विचलन और अंतर-भाग परिवर्तनशीलता मूल्य 2.50% से कम थे। सटीकता और नौ एकाग्रता के स्तर के लिए सटीकता, ०.५० μM (LLOQ) को छोड़कर, देव और C.V. मूल्यों के साथ एक स्वीकार्य सीमा के भीतर थे ७.००% से कम(तालिका 2 और तालिका 3)।

विश्लेषणात्मक विधि अंतर और अंतर-भाग सटीकता और परिशुद्धता, चार परीक्षण सांद्रता पर, बायोएनालिटिकल परख के लिए आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं मापदंड के भीतर गिर गया। विधि की प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन 0.50 (LLOQ), 4.50, 45.00 और 90.00 माइक्रोनएम के एपीएपी गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों की प्रतिकृति का विश्लेषण करके किया गया था। टेबल 4में इंट्रा-रन और इंटर-रन औसत परिणाम की सूचना दी गई है । परख की सटीकता और परिशुद्धता देव मूल्यों द्वारा 15.00% ≤ और सीवी मूल्यों द्वारा क्रमशः 7.00% ≤ प्रदर्शित की जाती है।

LOD नमूना जिसका संकेत करने वाली शोर अनुपात (एस/एन) सिर्फ 3 से अधिक था और एक ०.२५ μM APAP के लिए पत्राचार के रूप में निर्धारित किया गया था । दूसरी ओर, 0.50 माइक्रोनएम एपीएपी नमूनों के साथ अनुमानित LLOQ ने एस/एन अनुपात को 10 के बराबर प्रदर्शित किया। इसके अलावा, हमें सटीकता मूल्य (देव%) नाममात्र एकाग्रता मूल्यों ≤ 19.00% के भीतर लेकर। अंतर और अंतर-रन वेरिबिलिटीज का प्रदर्शन सीएसवी ≤ ने 18.77% किया, जैसा कि तालिका 2, तालिका 3 और तालिका 4)29,30में दिखाया गया है।

एपीएपी पीके विश्लेषण तीन अलग-अलग 2-ओसी एमपीएस विधानसभाओं में किए गए थे: 1) आंत 2-ओसी, जिसमें आंत के बराबर ही होता है; 2) लिवर 2-ओसी, जिसमें लिवर स्फेरॉइड ही और 3) आंत/लिवर 2-ओसी दोनों आंतों की बाधा और लिवर स्पेरोइड्स के साथ होता है ।

अवशोषण अध्ययन के लिए, मौखिक मार्ग आंत समकक्ष एपिकल साइड पर 12 माइक्रोनएम एपीएपी के प्रशासन द्वारा नकल की गई थी। एपीएपी सांद्रता एचपीएलसी/यूवी द्वारा मापा गया था, मध्यम नमूनों में, स्थिर और गतिशील दोनों स्थितियों में एपिकल और बेसोटेरल आंतों के समकक्ष पक्षों से एकत्र किया गया था । एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों से एकत्र किए गए माध्यम में एपीएपी काइनेटिक्स ने प्रदर्शन किया कि आंत मॉडल एपीएपी को अवशोषित करने में सक्षम था। आंतों के बेसोटेरल साइड(चित्रा 5बी) में एपीएपी एकाग्रता वृद्धि के साथ-साथ एपीएपी की ओर(चित्रा 5 ए)में एक प्रगतिशील एपीएपी एकाग्रता में कमी आई थी। माध्यम में अधिकतम सांद्रता (Cmax) प्रशासन (Tmax) के 12 घंटे के बाद, स्थिर और गतिशील दोनों स्थितियों के लिए लगभग 2 माइक्रोन था।

चयापचय अध्ययन के लिए, नसों में प्रशासन जिगर के डिब्बे के माध्यम में 2 μM APAP के आवेदन से नकल की गई थी । दोनों स्थिर और गतिशील स्थितियों के तहत मीडिया में APAP एकाग्रता काइनेटिक्स संकेत दिया है कि केवल गतिशील परिस्थितियों में APAP एकाग्रता में कमी का पता लगाया जा सकता है, 0.87 μM APAP 12 घंटे तक पहुंचने के बाद 2 μM APAP प्रशासन (T1/2 = 12 h) । यकृत समकक्षों ने स्थिर परिस्थितियों(चित्र 5सी)के तहत न्यूनतम मेटाबोलिक दक्षता दिखाई। एपीएपी प्रशासन के बाद एपीएपी एकाग्रता 1.7 माइक्रोन 12 घंटे तक पहुंच गई। एपीएसपी अवशोषण और चयापचय मूल्यांकन की तरह एकीकृत, प्रणालीगत आंत/जिगर 2-ओसी मॉडल में किया गया था । एपीएपी को मौखिक मार्ग की नकल करते हुए आंत के समकक्ष के एपिकल साइड पर प्रशासित किया गया था। दोनों आंतों के दोनों पक्षों से और लिवर के डिब्बे से भी मध्यम नमूने एकत्र किए गए । चित्रा 5D स्थिर और गतिशील दोनों स्थितियों में एपीएपी एकाग्रता के प्रगतिशील क्षय को दर्शाता है।

चित्रा 5E विशिष्ट अवशोषण और चयापचय चरणों को दर्शाता है। आंतों के अवशोषण में भी प्रवाह प्रभावित हुआ। माध्यम में APAP Cmax गतिशील "आंत/जिगर 2-ओसी"(चित्रा 5E)विधानसभा पर 2 μM से गतिशील "आंत/जिगर 2-OC"(चित्रा 5E)के लिए 1.7 माइक्रोनएम के लिए बदल गया । चित्रा 5F हमारे गतिशील "आंत/जिगर 2-ओसी" माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (लाल वक्र और वाई एक्सिस) और 1000 मिलीग्राम (ब्लैक कर्व और वाई एक्सिस) की एक मौखिक खुराक के बाद मनुष्यों में प्राप्त एक प्रतिनिधि प्रोफ़ाइल में एपीएपी की एकाग्रता-समय प्रोफ़ाइल के बीच सीधी तुलना दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: 2-ओसी सांसदों में पीके अध्ययन के लिए योजनाबद्ध कदम संकलन। A)2-ओसी सांसदों की योजनाबद्ध ड्राइंग, नीचे-अप दृश्य में आंतों और हेपेटिक मानव ऊतक समकक्ष दिखा । B)2-ओसी सांसदों की तस्वीर आंतों और जिगर समकक्ष के साथ नीचे देखने में डिवाइस में एकीकृत, प्रतिनिधि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ । C)टिश्यू समकक्ष तैयारी की टाइमलाइन, एपीएपी उपचार, और ऑर्गेनॉइड विनिर्माण के लिए संस्कृति मध्यम संग्रह चरण, और फार्माकोकाइनेटिक और विषाक्तता आकलन। इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आंत के समकक्ष की व्यवहार्यता और विष विज्ञानी मूल्यांकन। A)गैर-उपचारित कैको-2/एचटी-29 कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां क्रमशः कोशिका नाभिक और ऐक्टिन फिलामेंट्स फ्लोरोसेंट डाई (DAPI और Phalloidin) से सना हुआ है; 63x आवर्धन, ज़ूम 2.6। B)कैको-2/एचटी-29 कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां 24 घंटे के लिए 12 माइक्रोन एम एपीएपी के साथ इलाज की गई, नाभिक और ऐक्टिन फिलामेंट्स फ्लोरोसेंट डाई (क्रमशः DAPI और Phalloidin) से सना हुआ; 63x आवर्धन, ज़ूम 2.6। C)आंत दोनों स्थिर और गतिशील स्थितियों में एमटीटी परख द्वारा व्यवहार्यता मूल्यांकन समकक्ष । ग्राफ में सलाखों द्वारा प्रतिनिधित्व मूल्यों प्रतिशत वाहन नियंत्रण के सापेक्ष गणना कर रहे है (समय बिंदु 0 के रूप में नाम) * पी एंड एलटी; ०.०५ 0 बनाम उपचार । D)भेदभाव के 21 दिनों के दौरान TEER विकास । * पी एंड एलटी; 0.05 दिन 1 बनाम अन्य दिन। ई)गतिशील परिस्थितियों में आंत 2-ओसी सांसदों में APAP प्रशासन के बाद TEER मूल्यों । आंतों के समकक्ष में जीन अभिव्यक्ति। आंत बाधा की अवशोषण क्षमता और गतिशील स्थिति के तहत 24 घंटे के लिए 12 माइक्रोनएम एपीएपी के संभावित प्रभावों को SLC5A1(एफ),ना-के-ATPase(जी)और एमडीआर1(एच)अभिव्यक्ति द्वारा सत्यापित किया गया था। मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। परिणाम हाउसकीपिंग GAPDH के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है । * पीएंड एलटी;0.05 वाहन बनाम एपीएपी। I)ओपेरेटा छवि आधारित एचसीए कोलंबस® 2.4.0 द्वारा प्रदर्शन किया। सॉफ़्टवेयर। 12 माइक्रोनएम एपीएपी उपचार के बाद विभिन्न समय बिंदुओं में 2डी आंत सह-संस्कृति की प्रतिनिधि छवियां। नकारात्मक नियंत्रण मध्यम (0 घंटे) या वाहन (0.5% इथेनॉल) थे। यहां दिखाए गए सकारात्मक नियंत्रण 100 mM APAP है। इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: जिगर समकक्ष की व्यवहार्यता और विषाक्तता मूल्यांकन। A) एमटीटी परख द्वारा स्थिर और गतिशील दोनों स्थितियों में जिगर समकक्ष व्यवहार्यता मूल्यांकन। ग्राफ में सलाखों द्वारा प्रतिनिधित्व मूल्यों का प्रतिशत वाहन नियंत्रण (समय बिंदु 0 के रूप में नामित) * पी एंड एलटी; 0.05 0 बनाम उपचार के सापेक्ष गणना की जाती है। B)वाहन से कैप्चर की गई प्रतिनिधियों की छवियां और 2 माइक्रोनएम एपीएपी 24 एच एक आंतरिक खंड से जिगर के गूढ़ का इलाज किया जाता है। C)प्रतिनिधि एच एंड ई (हेमटॉक्सीलिन और इओसिन स्टेनिंग) वाहन से कैप्चर की गई छवियां और 2 μM APAP 24 h एक आंतरिक अनुभाग से जिगर के गूढ़ का इलाज किया । स्केल बार = 50 माइक्रोन डी)2 माइक्रोनएम एपीएपी उपचार के बाद विभिन्न समय बिंदुओं में 2डी लिवर सह-संस्कृति की प्रतिनिधि छवियां। इन विश्लेषणों में वाहन के साथ और 2 माइक्रोनएम एपीएपी के साथ उपचार किए गए नमूनों पर विचार किया गया था। फ्लोरोफोर डाई मिश्रण में परमाणु धुंधला करने के लिए होचस्ट और माइटोकॉन्ड्रिया मास स्टेनिंग के लिए मिटोट्रैकर डीप रेड शामिल है। नकारात्मक नियंत्रण मध्यम (0 घंटे) या वाहन (0.5% इथेनॉल) थे। सकारात्मक नियंत्रण 100 mM APAP थे। फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कैप्चर की गई पूरी स्फेरॉइड छवियों के माप किए गए थे। ई) क्षेत्र एफके आवृत्ति वितरण ) आस्पेक्ट रेशियो, जी) गोलाई, एच) दृढ़ता, मैं)परिपत्रता । एन = 85। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0,05। जम्मू)एलडब्ल्यूडी 10x उद्देश्य का उपयोग करके ओपेरेटा द्वारा अधिग्रहीत 3डी लिवर स्पेरोइड्स की प्रतिनिधि छवियां। इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: लिवर व्यवहार्यता/कार्यक्षमता और 2 माइक्रोनएम एपीएपी के संभावित प्रभावों पर स्थिर और गतिशील परिस्थितियों के तहत जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति और एंजाइमेटिक गतिविधि द्वारा सत्यापित किया गया । ए)एल्बुमिन जीन एक्सप्रेशन। B)GSTA2 जीन अभिव्यक्ति। चरण 1 और चरण II मेटाबोलिज्म और 24 घंटे के लिए 2 माइक्रोनएम एपीएपी के संभावित प्रभावों को गतिशील स्थिति के तहत करने की यकृत क्षमता क्रमशः CYP3A4(सी)और UGT1A1(D)की जीन अभिव्यक्ति द्वारा सत्यापित की गई थी। ई) स्टेटिक कंडीशन के तहत टोटल एल्बुमिन प्रोटीन एक्सप्रेशन। एफ) गतिशील परिस्थितियों में कुल एल्बुमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति। हालत। जी)तुलनात्मक ग्राफ जिगर समकक्ष में कुल एल्बुमिन अभिव्यक्ति में अंतर को दर्शाते हुए स्थिर या गतिशील परिस्थितियों में खेती और इलाज किया जाता है। H)CYP 3A4 स्थिर परिस्थितियों में विट्रो एंजाइमेटिक गतिविधि में। I)CYP 3A4 गतिशील परिस्थितियों में विट्रो एंजाइमेटिक गतिविधि में। जम्मू)तुलनात्मक ग्राफ जिगर समकक्ष में CYP 3A4 गतिविधि में अंतर को दर्शाते हुए स्थिर या गतिशील परिस्थितियों में खेती और इलाज किया जाता है। मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। जीन अभिव्यक्ति के आंकड़ों को हाउसकीपिंग गपध के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है । प्रोटीन अभिव्यक्ति के डेटा को विनक्यूलिन प्रोटीन के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है। * पी एंड एलटी; 0.05 वाहन बनाम एपीएपी उपचार। इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: 2-ओसी सांसदों में एपीएपी फार्माकोकिनेटिक्स का विश्लेषण करता है। आंत 2-ओसी सांसदों की तैयारी के एपिकल साइड में 12 माइक्रोनएम एपीएपी प्रशासन के बाद एपीएपी अवशोषण प्रोफ़ाइल। आंतों की बाधा कैको-2/एचटी-29 सेल लाइनों(ए)स्थिर और गतिशील एपीएपी सांद्रता की एक सहसंस्कृति से बनी थी जो एपिकल साइड (मानव आंतों के ल्यूमेन पक्ष का प्रतिनिधित्व करती है)। (ख)बेसोटेरल साइड (मानव आंतों के खून की ओर का प्रतिनिधित्व) से माध्यम में स्थिर और गतिशील एपीएपी सांद्रता। * पी एंड लेफ्टिनेंट;0.05 स्थिर बनाम गतिशील स्थितियां। C)एपएपी मेटाबोलिज्म प्रोफाइल लिवर 2-ओसी एमपीएस में हेपआरजी/एचएचएसटीसी लिवर स्फेरॉइड द्वारा । माध्यम में एक 2 μM APAP प्रशासन के बाद स्थिर और गतिशील स्थितियों की तुलना। * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05 0h बनाम 6 एच, 12 एच, और 24 एच एपीएपी उपचार। आंत/जिगर 2-ओसी सांसदों की तैयारी के आंतों के बैरियर एपिकल साइड पर 12 माइक्रोनिज्म एडमिनिस्ट्रेशन के बाद एपीएपी अवशोषण और मेटाबोलिज्म प्रोफाइल । यह मौखिक मार्ग का अनुकरण करता है। आंतों की बाधा Caco-2/HT-29 सेल लाइनों और जिगर के बराबर हेपार्ग/HHSTeC सेल लाइनों के spheroids से बना था । (घ)आंतों/जिगर 2-ओसी APAP एकाग्रता स्थिर और गतिशील परिस्थितियों में आंतों की बाधा के apical पक्ष में । (ई)आंतों/जिगर 2-ओसी APAP सांद्रता स्थिर और गतिशील परिस्थितियों में माध्यम में । * पी एंड लेफ्टिनेंट;0.05 स्थिर बनाम गतिशील स्थितियां। (च)हमारे माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (रेड कर्व और वाई एक्सिस) में एपीएपी की एकाग्रता-समय प्रोफ़ाइल और 1000 मिलीग्राम (ब्लैक कर्व और वाई एक्सिस) की एक मौखिक खुराक के बाद मनुष्यों में प्राप्त एक प्रतिनिधि प्रोफ़ाइल के बीच तुलना। वेबप्लॉटडीगिटाइजर 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer) का उपयोग करके भूखंडों से डेटा निकाला गया था। इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एचपीएलसी सिस्टम जल एलायंस 2695 (मिलफोर्ड, एमए, यूएसए), क्वाटरर्नी पंप, नमूना प्रबंधक और डेगासर से लैस
वेक्षक पानी 2996 यूवी-विस 210-400 एनएम रेंज में सेट
सिस्टम नियंत्रण, डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण जल सशक्त 2002 क्रोमेटोग्राफी सॉफ्टवेयर
स्तंभ उलट-चरण लूना C18
(150 x 4.6 मिमी आईएमआई; 5 मिमी कण आकार)
फेनोमेनेक्स
गार्ड कॉलम उत्क्रमित चरण लूना C18 (4 x 3 मिमी)
फेनोमेनेक्स
मोबाइल चरण सॉल्वेंट ए- एसीटोनिट्रिल
सॉल्वेंट बी- 0.10 मीटर अमोनियम एसीटेट, पीएच 6.8
आइसोक्रेटिक स्थितियां समय A (%) B (%)
(न्यूनतम)
15 5 95
प्रवाह 1.0 एमएल/मिनट
इंजेक्शन की मात्रा 25 माइक्रोन
तापमान 25 डिग्री सेल्सियस
एपीएपी डिटेक्शन यूवी @ 243 और 254 एनएम
रन टाइम 15 मिनट

तालिका 1: संस्कृति माध्यम मैट्रिस में एपीएपी के एचपीएलसी-यूवी विश्लेषण के लिए शर्तों और मापदंडों का उपयोग किया जाएगा।

नाममात्र एकाग्रता एपीएपी एकाग्रता की गणना (μM) औसत (μM) एस.डी.बी. C.V. देव
(μM) (प्रत्येक एकाग्रता का ट्रिपलिकेट) (μM) (%)c (%)डी
परख संख्या 1 2 3 4 5 6
0.25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46.05
0.50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6.65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0.09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0.03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

तालिका 2: इंटर-रन भिन्नता - छह अलग-अलग परखों से 0.10 मीटर अमोनियम एसीटेट बफर (1:1, v/v) के साथ डीएमईएम माध्यम के मिश्रण में तैयार मानक वक्र नमूनों की सटीकता, सटीकता और रैखिकता। क
क प्रायोगिक में वर्णित सैद्धांतिक एकाग्रता बनाम प्रतिक्रियाकेलिए डेटा पर एक रैखिक वक्र फिट किया गया था। गणना एकाग्रता अंशांकन वक्र के खिलाफ प्रत्येक मानक नमूने के लिए प्रतिक्रिया पढ़ने से ली गई थी। प्रत्येक प्रविष्टि (परख 1-6) ट्रिपलिकेट विश्लेषण के औसत मूल्य से मेल खाती है।
ख एसडी = मानक विचलन।
ग C.V. (भिन्नता का गुणांक।
घ सटीकता (देव%) = नाममात्र मूल्य से गणना एकाग्रता का विचलन।
इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)।

नाममात्र एकाग्रता एपीएपी एकाग्रता की गणना (μM) औसत निकालना एस.डी.बी. C.V. देव
(μM) (प्रत्येक एकाग्रता का ट्रिपलिकेट) (μM) (μM) (%)c (%)डी
परख संख्या 1 2 3 4 5
0.25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26.03
0.50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14.97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6.85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1.56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0.01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0.05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

तालिका 3: इंटर-रन भिन्नता - छह अलग-अलग परख से 0.10 मीटर अमोनियम एसीटेट बफर (1:1, v/v) के साथ विलियम्स माध्यम के मिश्रण में तैयार मानक वक्र नमूनों की सटीकता, सटीकता और रैखिकता। क
क प्रायोगिक में वर्णित सैद्धांतिक एकाग्रता बनाम प्रतिक्रियाकेलिए डेटा पर एक रैखिक वक्र फिट किया गया था। गणना एकाग्रता एक अंशांकन वक्र के खिलाफ प्रत्येक मानक नमूने के लिए प्रतिक्रिया पढ़ने से ली गई थी। प्रत्येक प्रविष्टि (परख 1-5) ट्रिपलिकेट विश्लेषण के औसत मूल्य से मेल खाती है।
ख एसडी = मानक विचलन।
ग C.V. (भिन्नता का गुणांक।
घ सटीकता (देव%) = नाममात्र मूल्य से गणना एकाग्रता का विचलन।
इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)।

विलियम्स मध्यम नाममात्र एकाग्रता मापी गई एकाग्रता एस.डी. C.V. देव
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
इंट्रा-रन (एन = 3) 0.50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1.77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8.37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8.57
इंटर-रन (n=15) 0.50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14.97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2.99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5.88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5.31
डीएमईएम माध्यम नाममात्र एकाग्रता मापी गई एकाग्रता एस.डी. C.V. देव
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
इंट्रा-रन (एन = 3) 0.50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6.35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1.69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4.00
इंटर-रन (n=12) 0.50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7.75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

तालिका 4: गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों में एपीएपी के लिए अंतर-और अंतर-भाग सटीकता और सटीकता। क
क डेटा औसत के रूप में दिखाए जाते हैं। एसडी (मानक विचलन)। C.V. (भिन्नता का गुणांक। सटीकता) और सटीकता (प्रतिशत विचलन। देव%) ।
इस आंकड़े को मारिन एट अल से संशोधित किया गया है। आंत/लिवर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में एसिटामिनोफेन अवशोषण और मेटाबोलिज्म । केम बायोल इंटरैक्ट। 299,59-76 (2019)।

प्राइमर (5' → 3')
टिशू पेपर जीन फ़ारवर्ड उल्टा
आँत SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAGCAACTTTCCCAC CAggCTCCAACACACAGCggT
एनए-के-ATPase ACCgCCCAGAAATCCCAAAAAAC CAgCggTCATCCCAGTCC
एमडीआर1 TggATTTTTTCCGGTTTTggag TgGgggCTGTATATTTgg
कलेजी एल्बुमिन TgCAAggCTgaag TTTAGACAgggTTTTTtggCTTTACAC
जीएसटीए2 CTgagAAAAAGATgCAAGC AgCAgagaagctggAAATAAG
CPY3A4 ggAAggTggACCCAGAAACTGC TTACggTGCCATCCCCCTGAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggagAC ggTCCTTTGAAggCTggag

तालिका 5: आंत और जिगर के ऊतकों के लिए 2-ओसी संस्कृतियों में एमआरएनए स्तर पर जीन प्रतिलेखन का मूल्यांकन करने के लिए वास्तविक समय qPCR प्राइमर

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Discussion

खोजी नई दवाओं के फार्माकोलॉजिक गुणों का सटीक और विश्वसनीय आकलन निम्नलिखित विकास चरणों में जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। सांसदों एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है, कि भविष्य कहनेवाला शक्ति में सुधार लाने और लागत और पूर्व नैदानिक परीक्षणों के साथ बिताए समय को कम करने के उद्देश्य से है । हमारा समूह फार्माकोकाइनेटिक और विषाक्त गुणों के आकलन में आगे बढ़ रहा है जो ज्यादातर लीड अनुकूलन के लिए आवश्यक हैं। हमने 2-ओसी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के साथ काम किया, जिसमें दो कक्ष हैं, जिससे दो ऑर्गेनॉइड के एकीकरण की अनुमति मिलती है। APAP को चुना गया था क्योंकि इसमें बहुत सारे उच्च गुणवत्ता वाले मानव डेटा हैं, ज्यादातर जिगर द्वारा चयापचय किया जाता है, और हेपेटोटॉक्सिक गुणों को भी प्रदर्शित करता है। अध्ययन प्रोटोकॉल मानव चरण मैं नैदानिक परीक्षण के कुछ चरणों का अनुकरण करने के उद्देश्य से, जहां एक दवा स्वयंसेवकों को मौखिक रूप से प्रशासित किया जाता है, और आवधिक रक्त नमूने दवाओं की एकाग्रता का आकलन करने के लिए फार्माकोकाइनेटिक गुणों और जैव रासायनिक और नैदानिक मापदंडों को पता करने के लिए तैयार कर रहे है सुरक्षा और सहनीयता का आकलन करने के लिए एकत्र कर रहे हैं । इसलिए, जब सांसद विश्वसनीय भविष्यवाणियां प्रदान करने के लिए पर्याप्त विकसित होते हैं, तो यह चरण I परीक्षण में विफलता के जोखिम को काफी कम कर देगा। भविष्य में रोग मॉडल जोड़कर, एक ही धारणा संभवतः चरणों द्वितीय और तृतीय नैदानिक परीक्षणों पर लागू होगा ।

सभी अध्ययनों तीन मॉडलों में प्रदर्शन किया गया: आंत 2-ओसी (APAP मौखिक प्रशासन), जिगर 2-ओसी (नसों में प्रशासन), और आंत/ पहला मॉडल अवशोषण को अलग करता है, दूसरा मेटाबॉलिज्म, और तीसरा दोनों को एकीकृत करता है। हमने पहली बार ऑर्गेनॉइड का उत्पादन किया और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में शामिल किया, दूसरा एपीएपी प्रशासित किया और मीडिया के नमूनों को एकत्र किया, और अंतिम रूप से कोशिका व्यवहार्यता और कार्यक्षमता और एपीएपी एक्सपोजर के विषाक्त प्रभाव का आकलन करने के लिए परीक्षणों का एक सेट किया। फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों के लिए, हमने माध्यम में एपीएपी क्वांटिफिकेशन के लिए एक क्रोमेग्राफिक विधि विकसित और मान्य की। सत्यापन विशिष्टता, रैखिकता, मात्राकरण (LOQ), पता लगाने की सीमा (LOD), मैट्रिक्स प्रभाव, परिशुद्धता, और सटीकता के बारे में जैवविशार्त्व विधि सत्यापन पर दिशानिर्देश का पालन किया, के रूप में एफडीए29,30द्वारा उल्लिखित । विशिष्टता दो अलग-अलग स्रोतों से खाली, पूल्ड और व्यक्तिगत जैविक नमूनों के साथ स्थापित की गई थी। विधि विश्लेषण के दौरान स्वीकार्य प्रदर्शन किया, और डेटा एक सरल आइसोक्रेटिक मोबाइल चरण की क्षमता की पुष्टि के लिए अलग और APAP मात्रा ।

आंत और लिवर ऑर्गेनॉइड की व्यवहार्यता/कार्यात्मक रूप से विभिन्न तकनीकों द्वारा मूल्यांकन किया गया था । आंत के समकक्ष के लिए, कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2ए-बी),एमटीटी परख(चित्रा 2 सी),जीन अभिव्यक्ति मूल्यांकन(चित्रा 2डी-एफ)या एचसीए प्रयोग, एपीएपी एक्सपोजर के बाद किसी भी विषाक्तता 24 घंटे का पता नहीं लगाया । इसी तरह, MTT परख विषाक्त जिगर समकक्ष(चित्रा 3A)में APAP द्वारा प्रेरित अपमान का पता नहीं लगाया । हालांकि, एचसीए तकनीक ने कुछ मशीनी सुराग(चित्रा 3 डी)के साथ सेल फेनोटाइपिक परिवर्तनों के अवलोकन से, यकृत कोशिकाओं के लिए बहुत जल्दी विषाक्त घटनाओं (एपीएपी एक्सपोजर के बाद 24 घंटे) का पता लगाने की संभावना को जोड़ा। दूसरी ओर, कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3 बी)और हिस्टोरोलॉजी(चित्रा 3 सी)को मानव ऊतक के समकक्ष की व्यवहार्यता स्थिति की जांच में एक उपयोगी पूरक उपकरण दिखाया गया था। जिगर की कोशिकाओं के लिए, विभिन्न तकनीकों का एक साथ उपयोग बहुत लाभप्रद था। एमटीटी परख, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एपीएपी एक्सपोजर के बाद एचसीए 24 एच द्वारा पता लगाया गया एपीएपी साइटोटॉक्सिकिटी का पता लगाने में सक्षम नहीं था। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एपीएपी उपचार के बाद बेसल और 24 घंटे दोनों में आंत(चित्रा 2डी-एफ)और यकृत ऑर्गेनॉइड(चित्रा 4ए-डी)की कार्यक्षमता का आकलन किया गया । बेसल स्थितियों के तहत, आंतों और जिगर-विशिष्ट मार्कर के सामान्य स्तर थे, जो उचित कार्यक्षमता का सुझाव देते थे। एपीएपी एक्सपोजर के 24 एच के बाद, एल्बुमिन, जीएसटी एमआरएनए के स्तर और यकृत समकक्ष ऊतकों में CYP3A4 जीन अभिव्यक्ति को कम करने की प्रवृत्ति थी, जो एपीएपी अर्ली साइटोटॉक्सिकिटी का संकेत देती है। इन निष्कर्षों की पुष्टि करते हुए, पश्चिमी ब्लॉटिंग प्रयोगों से पता चला है कि जीन अभिव्यक्ति में कमी भी APAP उपचार(चित्रा 4ई-एफ)के जवाब में जिगर कुल एल्बुमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक मजबूत कमी के साथ था, जो APAP के संपर्क में आने से जिगर के ऊतकों पर लगाए गए विषाक्त अपमान की पुष्टि करता है । तदनुसार, इन विट्रो एंजाइमेटिक गतिविधि के प्रयोगों ने लिवर समकक्ष(चित्रा 4एच-1)में एपीएपी उपचार द्वारा प्रेरित CYP 3A4 गतिविधि के स्तर में एक मजबूत और प्रगतिशील कमी दिखाई।

इमेज जे(चित्रा 3ई-I)पर ऑर्गेनॉइड के मॉर्फोमेट्रिकल आंकड़े किए गए थे। क्षेत्र से पता चलता है कि 2डी आकार सभी ऑर्गेनॉइड के विश्लेषण के लिए कितना करीब है, जिसका उपयोग इस प्रोटोकॉल में मानकीकरण के रूप में किया जा सकता है ताकि निष्पक्ष परिणाम का उत्पादन किया जा सके। 'आकार वर्णनकर्ता' आकार आकृति विज्ञान के अनुरूप आंकड़ों को प्रकट करते हैं। आस्पेक्ट रेशियो एक सूचकांक है जो प्रमुख और मामूली धुरी का उपयोग करता है, इसलिए 1 के आसपास परिणाम ऑर्गेनॉइड गठन के दौरान कोई पूर्वाग्रह (यानी तरजीही विकास) का संकेत नहीं देते हैं। गोलाई के मूल्य (4 × [क्षेत्र]/(π × [प्रमुख धुरी]2))एक तरजीही विकास के प्रति बहुत संवेदनशील हैं, जो एक प्रमुख धुरी के रूप में प्रकट किया जाएगा । दृढ़ता ([क्षेत्र]/(उत्तल क्षेत्र])) सकल आकृति विज्ञान दिखाने में आवश्यक है क्योंकि यह सीमाओं में अनियमितताओं से प्रभावित नहीं है क्योंकि यह उत्तल क्षेत्र (= लिफाफा) का उपयोग करता है । 1.0 के आसपास केंद्रित वितरण ख्यात गोलाकार विकास का संकेत देता है। इसके विपरीत, परिपत्रता (4× π [क्षेत्र]/[परिधि]2)एक जटिल परिधि के प्रति बहुत संवेदनशील है, इसलिए "गुहा" या "जेब" इस सूचकांक को प्रभावित करेगा। इस प्रकार, 1 के आसपास परिपत्रता भी ख्यात गोलाकार विकास की पुष्टि करती है, जो उचित ऑर्गेनॉइड कार्यक्षमता के अनुरूप है।

विश्लेषणात्मक परिणामों से पता चला है कि सांसद उत्सर्जन चरण के बिना वीवो(चित्रा 5F)में उत्पादित एक वक्र के बराबर एक वक्र में अलग या एकीकृत दोनों एपीपी अवशोषण और चयापचय गुणों का अनुकरण कर सकते हैं। APAP अवशोषण दोनों आंत सांसदों या आंत/जिगर सांसदों मॉडल के लिए मौखिक प्रशासन के बाद समान था, दोनों स्थिर और गतिशील स्थितियों के तहत(चित्रा 5ए-बी, चित्रा 5डी-ई)। दोनों में, स्थिर और गतिशील स्थितियों के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं होने के साथ, बेसोलेटरल साइड में इसकी वृद्धि के लिए एपिकल साइड में एक एपीएपी एकाग्रता कम हो जाती थी। इसके विपरीत, एपीएपी हेपेटिक चयापचय इन स्थितियों में भिन्न था। एमपीएस में परिसंचारी मीडिया ऑर्गेनॉइड मेटाबोलिक क्षमता(चित्रा 5C और चित्रा 5E)में सुधार करने के लिए लग रहा था । प्रवाह के बिना नहीं देखा गया एक महत्वपूर्ण एपीएपी क्षय अंडरफ्लो था। दिलचस्प बात यह है कि इनविट्रो, CYP3A4 गतिविधि प्रयोग इस परिकल्पना को पुष्ट करते हैं कि सिस्टम में प्रवाह की उपस्थिति मानव यकृत समकक्ष की कार्यक्षमता को बढ़ाती है। जैसा कि चित्रा 4Jमें ग्राफ में दिखाया गया है, CYP 3A4 की गतिविधि बेसल और एपीएपी उपचार दोनों स्थितियों में प्रवाह के तहत बनाए गए यकृत समकक्ष में काफी अधिक थी। इसी तरह, प्रवाह (गतिशील) के तहत रखा जिगर समकक्ष दोनों बेसलाइन पर या APAP इलाज शर्तों(चित्रा 4G)में प्रवाह (स्थिर) के बिना रखा उन लोगों की तुलना में एल्बुमिन की प्रोटीन अभिव्यक्ति बढ़ाने की प्रवृत्ति दिखाई ।

जब मनुष्यों के लिए APAP के मौखिक प्रशासन के बाद एकाग्रता समय प्रोफ़ाइल की तुलना में, हमारे माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम बहुत बड़ा टी1/2 (आधा जीवन समय)(चित्रा 5F)से पता चलता है । ऐसा होता है, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, क्योंकि जब हमारे पास आंत और यकृत समकक्ष के साथ दो-अंग प्रणाली होती है जो दवा को अवशोषित और चयापचय कर सकती है, तो प्लाज्मा डिब्बे38से एपीएपी और इसके मेटाबोलाइट्स को उत्सर्जित करने के बराबर कोई गुर्दा नहीं है। इसके अलावा, माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम छोटे सीमैक्स (पीक प्लाज्मा एकाग्रता) और बड़े टीमैक्स (सीमैक्स तक पहुंचने का समय) दिखाता है जो आमतौर पर मनुष्यों के लिए मनाया जाता है(चित्रा 5F)। यह इन विट्रो के पैमाने में और वीवो प्रयोगों में अंतर का परिणाम है। कुल मिलाकर, मनुष्यों के लिए एपीएपी के मौखिक प्रशासन के बाद प्राप्त माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम और प्रोफाइल का उपयोग करके प्राप्त एकाग्रता-समय प्रोफ़ाइल के बीच तीन मुख्य अंतर हैं: बड़ा टी1/2,छोटा सीमैक्स और बड़ा टीमैक्स (चित्रा 5F)। जबकि बड़ा टी1/2 प्लाज्मा समकक्ष से EXAP और उसके मेटाबोलाइट्स उत्सर्जित करने के बराबर गुर्दे की अनुपस्थिति के कारण है, छोटे सीअधिकतम और बड़े टीअधिकतम मानव शरीर की तुलना में प्रयोग के छोटे पैमाने के परिणाम हैं । माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम के निर्माण और संचालन के लिए सबसे अच्छी स्केलिंग रणनीतियां अभी भी अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र हैं और यह संभावना नहीं है कि सभी प्रणालियों के लिए एक भी दृष्टिकोण इष्टतम है39। इसके अतिरिक्त, गणितीय मॉडलिंग या मशीन लर्निंग का उपयोग सुधार लागू करने या माइक्रो स्केल से मैपिंग को पूर्ण पैमाने पर सीखने के लिए किया जा सकता है ताकि माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम के साथ प्राप्त विट्रो डेटा को मानव40में मनाया जाने वाले विवो व्यवहार में एक्सट्रपलेशन किया जा सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ क्रिस्टी गुगुएन-गुइलोजो, यूनिट ५२२ INSERM में डॉ फिलिप ग्रिपर और जैविक सामग्री (Hepa आरजी कोशिकाओं) के उपयोग के लिए यूनिट २७१ INSERM में डॉ क्रिश्चियन ट्रेपो के लिए धन्यवाद और फिर हमारे लिए उपलब्ध बनाने के लिए अकादमिक अनुसंधान करने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

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