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Chemistry

药物药代动力学和毒理学评估的肠道/肝脏微生理系统

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

我们向对乙酰氨基酚（APAP）暴露了含有肠道和肝脏器官的微生理系统（MPS）。本文介绍了MPS中器官生产和APAP药代动力学和毒理学属性评估的方法。它还描述了验证结果所需的组织功能分析。

Abstract

最近引进的培养人体器官的微生理系统（MPS）在药物开发过程的临床前测试阶段有望比动物表现更好，因为它们是遗传人类，并重述组织之间的相互作用。在这项研究中，将人类肠道屏障（由Caco-2和HT-29细胞的共培养物模拟）和肝脏当量（由分化的肝细胞和人类肝硬质细胞的球类模拟）整合到双器官芯片（2-OC）微流体装置中，以评估一些乙酰氨基酚（APAP）药理动力学（PK）和毒理学特性。MPS有三个组件：肠道只有2-OC，肝脏只有2-OC，和肠/肝脏2-OC与相同的介质细读两个器官。对于 PK 评估，我们在通过肠道屏障（模拟口腔路线）或介质（模拟静脉路线）后，在介质中以预设的时间点对 APAP 进行加注，分别值 12 μM 和 2 μM。通过反相高压液相色谱（HPLC）对介质样品进行分析。对器官分析为基因表达，TEER值，蛋白质表达和活性，然后收集，固定，并提交一组形态学评估。MTT 技术在评估器官生存能力方面表现良好，但高含量分析 （HCA） 能够检测出非常早期的毒性事件，以响应 APAP 治疗。我们验证，介质流没有显著影响APAP吸收，但它显著改善肝脏等效功能。APAP人类肠道吸收和肝代谢可以在MPS中模拟。MPS 数据与硅建模之间的关联在提高体外方法的可预测性方面有很大的潜力，并且比在药代动力学和毒理学研究中的动物模型具有更高的准确性。

Introduction

由于基因组和蛋白质组的差异，动物模型对几种人类结果的预测价值有限。此外，它们既费时又昂贵，而且在道德上也值得怀疑。MPS 是一项相对较新的技术，旨在提高预测能力，减少临床前测试的成本和时间。它们是在媒体流下培养器官（器官的人工模仿功能单元）的微流体装置，促进器官-器官通信。由人类细胞制造的有机体增加转化相关性2，3，4。MPS 预期性能优于动物试验，因为它们是基因人类，并重述组织之间的相互作用。当完全正常运行时，MPS 将提供更有意义的结果，以更高的速度和更低的成本和风险 4。许多团体正在开发MPS，用于多种目的，特别是疾病模型，以测试药物的疗效。

暴露水平是评估药物疗效和毒性的最关键参数之一5，6，7，8，9，10，11，12。MPS 允许有机体整合，模拟全身暴露，预期性能优于传统的 2D 人体组织培养。该技术可显著提高复合肠道吸收和肝代谢的预测。

考虑到这两个器官在药物生物利用度和全身暴露13、14、15等的中心作用，整合肠道和肝脏等量模型的MPS是一个很好的起点。APAP是一种有吸引力的药物，用于研究没有肾脏等价物的MPS，因为它的代谢主要由肝脏16，17完成。

2-OC是一种双室微流体装置，适用于由微通道16连接的两种不同人体等效组织/器官的培养。为了模拟体外人类口服/静脉注射药物，并评估肠道和肝脏等价物之间的交代对APAP药代动力学的影响， 除了器官的功能和生存能力外，还进行了三种不同的MPS组件：（1） 一个"肠2-OC MPS"，由一个肠道等效物组成，其培养物中含有一个包含Caco-2+HT-29细胞共培养的培养物，并集成到2-OC装置中;（2） 由肝球类组成、由 HepaRG + HHSteC （人类肝状斯特拉特细胞） 组成的"肝脏 2-OC MPS"，集成在 2-OC 器件中;和 （3） 由一个设备隔间中的肠道等效物组成的"肠/肝脏 2-OC MPS"，通过介质流经微流体通道与肝脏等效物通信。

由于机械刺激（压缩、拉伸和剪切）对细胞的生存能力和功能18、19、20的影响，所有测定都是在静态（无流动）和动态（带流量）条件下进行的。本文介绍了APAP口服/静脉注射给药模拟的方案，以及含有人类肠道和肝脏等效模型的2-OC MPS中各自的吸收/代谢和毒理学分析。

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Protocol

1. 生产组织等价物，用于2-OC的栽培

  1. 小肠屏障当量生产
    1. 使用肠道等效介质维持 Caco-2 和 HT-29 细胞：DMEM 辅以 10% FBS、1% 青霉素和链霉素，以及 1% 非必需氨基酸，本手稿中称为"DMEM S"。
    2. 取出培养基，用1x DPBS洗涤两次，并加入8 mL的0.25%的尝试素/EDTA，以分离细胞培养瓶中生长的Caco-2细胞（175厘米2）。在37°C下孵育5分钟，通过添加至少双量的三辛抑制剂来停止反应。对HT-29细胞执行相同的程序，调整试剂体积，因为需要少量的这些细胞，并且它们保持在较小的烧瓶中（75 厘米2）。
    3. 在250 x g下 离心5分钟，从两个管中去除上清液，并在10 mL的DMEM S. 计数细胞中重新产生细胞颗粒，确保细胞生存能力高于80%。无菌整合细胞培养插入在24井板以前充满400μL的DMEM S每井在基底侧（代表人类血液）。
    4. 以9：1 21的比例共同培养Caco-2和HT-29细胞。使用 2.25 x 105 Caco-2 和 2.5 x 104 HT-29 细胞到每个肠道当量，最终体积为 200 μL 的 DMEM S. 根据所需的器官数量调整细胞数和体积。仔细混合。
    5. 移液 200 μL 的细胞溶液进入每个插入的 apical 侧 （代表人类肠道流明侧）， 每个插入播种 250，000 个细胞。共同培养插入中的细胞三周22。每周至少更换三次介质，用无菌的巴斯德移液器从脂肪和基础两侧吸气，注意不要损坏完整的细胞屏障。
      注：继续在细胞侧的渴望，以便不接触细胞屏障（通过支撑细胞插入件塑料边缘上的巴斯德移液器吸气）。
    6. 根据制造商的说明，每三天使用电压计23测量 TEER（跨地电阻）来检查紧固的单层形成。
      1. 执行空白，测量无细胞的细胞培养插入的电阻，但使用相同的细胞介质和相同的细胞板。
      2. 通过从组织等效电阻中减去空白电阻来计算组织电阻，并乘以过滤膜的有效表面积（0.6 厘米2）。良好的肠阻屏障阻力在150至400 Ω厘米2。
        注：21天后，细胞必须完全分化，肠道屏障形成，因此肠道等效物可以整合到MPS中。
  2. 肝脏等价物生产
    1. 使用肝脏等效介质维持肝素细胞，这是威廉的中等E辅以10%的胎儿牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素，5微克/mL人胰岛素和5×10-5M 氢皮质松，并在本手稿中命名为"威廉姆斯E S"。每2-3天更新一次肝细胞介质，保持细胞培养两周，以启动肝细胞和胆血管细胞的分化。
    2. 前两周后，在 HepaRG 的培养基中再添加 2% DMSO，再增加两周，以完成细胞分化24，25。使用聚 L-lysine 涂层细胞培养瓶，在斯特拉特细胞培养基 （SteC CM） 中种植 HHSTeC，每两三天更换一次介质。
    3. 取出培养素，用1x DPBS洗涤两次，加入8 mL的0.05%Trypsin/EDTA，分离细胞培养瓶中生长的肝细胞（175厘米2）。在37°C下孵育5至10分钟，通过添加至少两倍的三辛抑制剂体积来停止反应。对HHSTeC执行相同的操作，调整试剂体积，因为需要少量的这些细胞，它们可以保持在较小的烧瓶（75厘米2）中。
    4. 在 250 x g 下 离心 5 分钟，取出上一代，并在 Williams E S 介质中重新暂停细胞颗粒。计数细胞，确保细胞生存能力高于80%。
    5. 在Williams E S介质16中，以24：1的比例生成结合肝球蛋白和HHSTeC细胞的肝球状。加入 4.8 x 104 分化的 HepaRG 和 0.2 x10 4 HHSTeC，组成 50，000 个细胞的每个肝球体，体积为 80 μL。仔细混合。
    6. 使用多通道移液器，在每孔384个球形微孔板中分配80μL的组合细胞池，该孔具有圆形井底几何形状。
      注：四天后，形成约300μm的球体。
    7. 使用宽孔尖端，将肝脏球体转移到超低附着6孔板，允许所需的"一对一"计数。

2. 肠和肝脏当量在2-OC MPS中的整合

  1. 用于吸收测定的肠道 2-OC MPS 组件
    1. 移液 500 μL 的 DMEM S 进入较小的 2-OC 和 300 μL 的较大隔间。在24个井板中吸气每个肠道屏障的基底和孔基 media。使用无菌钳子，将每个 2-OC 电路集成一个刀片，特别是集成到较大的隔间中。在肠侧涂抹200μL的肠介质。
      注：在将器官集成到 MPS 中时，避免形成气泡。
    2. 将 MPS 连接到控制单元，控制单元必须连接到加压空气供应。设置参数：压力大约为 ±300 bar，泵送频率为 0.3 Hz。第二天，进行APAP治疗。
  2. 肝脏 2-OC MPS 组件用于代谢检测
    1. 将威廉姆斯 E S 的移液 650 μL 放入大隔间，将 350 μL 放入较小的隔间，从而接收球体。在超低附件 6 孔板中，使用宽孔尖端计算球体。每个肝脏等价物由二十个球形26组成。每个电路集成20个肝脏当量，使用宽孔尖端，只允许将器官转移到2-OC的较小隔间中。
    2. 将 MPS 连接到控制单元，控制单元必须连接到加压空气供应。设置参数：压力大约为 ±300 bar，泵送频率为 0.3 Hz。第二天，进行APAP治疗。
  3. 肠道/肝脏 2-OC MPS 组件，用于吸收和代谢测定
    1. 将两种介质（肠和肝脏）组合在1：4的比例中，这意味着肠面的DMEM S为200μL，壁体侧为800μL，在基础侧为800μL。同时在2-OC中整合肠道和肝脏当量。
    2. 将 MPS 连接到控制单元，控制单元必须连接到加压空气供应。设置参数：压力大约为 ±300 bar，泵送频率为 0.3 Hz。第二天，进行APAP治疗。
      注：对于所有实验，在三元化中执行每个时间点，这意味着三个分离的 2-OC 电路（即 1 和 1/2 2-OC 器件）。每个 2-OC 电路的总体积为 1 mL。

3. 乙酰氨基酚 （APAP） 制备

  1. 准备APAP库存溶液，在绝对乙醇中溶解APAP。在实验当天，在相应的介质（APAP溶液）中稀释APAP，浓度为12μM用于"口服给药"，2微米用于"静脉注射"。
  2. 确保两种管理方法在车辆控制和处理溶液中乙醇的最终浓度为 0.5%。对于正对比（100 mM APAP），乙醇浓度为2%。

4. 测试物质管理和介质取样

  1. APAP"口头"管理和媒体抽样
    1. 将2-OC.P出液500μL中各肠道屏障的基底和腹膜培养基吸入有机基质侧大隔间，将300μL吸入小隔间。
    2. 检查有无气泡，并继续进行肠道屏障等效治疗与测试物质在一面，模拟口服。通过在肠道培养插入物的皮面添加 200 μL 的 12 μM APAP 溶液来模拟 APAP"口服"给药，该溶液表示肠道"流明侧"（图 1B）。将 MPS 连接到控制单元。
    3. 收集总体积从阿皮和从基础侧在以下时间点：0小时，5分钟，15分钟，30分钟，1小时，3小时，6小时，12小时，和24小时15，27。在静态和动态条件下进行三分之一酸酯的所有实验，并在单独的微管中收集每个三分之一的每个样本。使用 HPLC/UV 分析样品。
      注：单独的基础样本和基础样本。
  2. APAP"静脉"给药和介质采样
    1. 通过将 2 μM APAP 溶液直接施用到肝脏室，模拟"静脉注射"途径。吸气所有 2-OC 中等内容。将测试物质放入大隔间和 350 μL 的相同介质的移液器 650 μL 放入包含 20 个球状物的较小隔间中。收集以下时间点的所有卷：0 小时、30 分钟、1 小时、2 小时、3 小时、6 小时、12 小时和 24 小时27、28。
    2. 在静态和动态条件下进行三次三次试验。在单独的微管中收集每个三分之一的样品。使用 HPLC/UV 分析样品。

5. 仪器和色谱条件

  1. HPLC 分析
    1. 根据表 1 设置 HPLC 分析 的所有相关参数。
    2. 在真空下，通过0.45 μm膜过滤器过滤移动相。通过 0.22 μm 孔径 PVDF 注射器过滤器（直径 13 mm）过滤样品，并将其存放在小瓶中。开始测量。
  2. 库存解决方案、校准标准和质量控制 （QC） 样品
    1. 在醋酸铵缓冲液（100 mM，pH 6.8）中制备10 mM的APAP库存溶液，用用醋酸铵缓冲液稀释的DMEM S和Williams E S细胞培养基介质进一步稀释，以实现0.25至100.00μM的工作溶液。
    2. 在三钙中包括一组校准样品，在三次三度中包括质量控制样品。通过串行稀释准备这些标准。
    3. 创建 APAP 峰值区域与 APAP 标称标准浓度的校准曲线。确定每个校准曲线的线性回归拟合。通过目视检测、相关系数、运行内和运行间精度和精度值评估各种校准模型的拟合优度。
    4. 注射DMEM S和Williams E S介质的空白样品稀释在醋酸铵缓冲液（1：1，v/v）中。为APAP浓度为0.50（LOQ）、4.50、45.00和90.00μM，在用醋酸铵缓冲液稀释的DMEM S和Williams E S介质中制备质量控制样品的三倍。
    5. 确保质量控制样品是根据新的库存解决方案准备的，与用于生成标准曲线的解决方案不同。使用质量控制样本调查运行内和运行间变化。
  3. 验证程序
    1. 按照先前报告的程序29，30执行生物分析方法的验证。分别考虑威廉姆斯 E S 和 DMEM S 细胞培养基，在五到六个不同的场合进行色谱运行。
    2. 确保根据APAP（轴 y）的峰值区域（轴 y）与各自的标称浓度（轴 x）绘制的在醋酸铵缓冲液中稀释的DMEM S或Williams E S细胞培养基中从0.25至100.00μM的校准点。将这些标准校准曲线的斜率与醋酸铵缓冲液中准备的校准曲线的斜率进行比较。确保所有校准曲线的相关性值至少为 0.998。
    3. 使用 5 天或 6 个不同天在四个不同级别 LLOQ、低、中、高质量控制的复制，确定代理矩阵中分析的精度和准确性（内部和运行间）。在同一天，在含有0.50、4.50、45.00和90.00μM.00 μMM APAP浓度（n= 3）的醋酸铵缓冲液（1：1，v/v）中稀释的DMEM S或Williams E S细胞培养基中执行运行内精度和精度测量。
    4. 根据最近获得的校准曲线评估每组包含APAP浓度的质量控制样品。通过利益化合物的分离程度和干扰成分引起的其他色谱峰的选择性测试测定的选择性。
  4. 定量下限 （LLOQ） 和检测限值 （LOD）
    1. 根据响应和斜率方法的标准偏差确定定量 （LLOQ） 的下限。使用公式 10°/S 计算，其中 α 是 y-intercept 的标准偏差，S 是通过绘制校准曲线29、30 获得的直线斜率。估计检测极限（LOD），考虑3.3倍于标准差的空白，除以校准曲线29，30的斜率。

6. 组织等效可行性/功能

  1. Mtt
    1. 执行 MTT 测定，以评估 MPS 测定的所有时间点的器官生存能力。作为负控制，使用细胞介质加车辆。作为阳性对照，用100mM APAPAP和1%NaOH在细胞培养中稀释的器官进行治疗。
    2. 将每个复制的20个球体转移到96孔板中的单个孔中，细胞培养物插入24个孔细胞板，每孔放置一个肠道当量。用1x DPBS清洗组织等价物三次。
    3. 加入300μL的1mg/mL MTT溶液，在各自的细胞介质中稀释，每井。在标准细胞培养条件下孵育板3小时。
    4. 通过移液仔细从每一个井中去除 MTT 溶液。在4°C下，使用每口200μL的异丙醇从肠道和肝脏当量中提取MTT formazan。
      注：密封盖子以防止蒸发。
    5. 将每个上一液的 200 μL 转移到 96 井微测试板中各自的预识别井。使用异丙醇作为空白。
    6. 在 570 nm 的板读卡器中读取前坦吸收。计算单元格减少 MTT 的相对能力 （%）使用每个时间点的平均光学密度，与负对相比，被认为是100%的细胞生存能力。
  2. 细胞化学/组织学
    1. 在室温下修复肠道和肝脏当量25分钟，在0.1 M磷酸盐盐缓冲液中使用4%（w/v）半成甲醛，pH 7.4。在PBS缓冲液中清洗器官5次，每次10分钟。用四甲苯胺甲胺甲胺-法洛丁或亚历克萨氟647 phaloidin染色肠道和肝脏当量，PBS31中的1：50。
    2. 将它们转移到 OCT 冷冻介质几分钟，在 RT 适应，然后将它们转移到液氮，直到完全冻结。使用低温恒温器进行约10-12 μm厚的肝球状切除。
    3. 使用 DAPI 在安装介质中安装组织部分。通过共和荧光显微镜检查它们。
    4. 固定后冷冻器官，根据既定协议进行色氧林和 eosin 染色。如上文所述，在切片组织后，用安装介质安装幻灯片，并使用光学显微镜拍摄组织学图像。
  3. 高含量分析
    1. 细胞的线粒体和核染色
      1. 在 DMSO 中重组冻干粉末，以制造 1 mM 线粒体染色库存溶液（例如，MitoTracker 深红色调频）。将等分库存溶液储存在-20°C，防止光线。在没有血清的预战 （37 °C） 组织培养基中，将 1 mM 线粒染色存量溶液稀释至最终浓度 （200 nM）。
      2. 删除单元格培养媒体。加入线粒体染色溶液，在37°C的加湿大气中用5%的CO2完全覆盖样品和孵育细胞15-45分钟。
      3. 小心地去除线粒体染色工作溶液，并在室温下用PBS中的2-4%甲醛固定液更换15分钟。
      4. 用 PBS 轻轻冲洗固定单元格 5 分钟。重复洗涤过程两次。
      5. 在10 mL超纯水中溶解100毫克的 Hoechst 33342 染料，准备 10 mg/mL （16.23 M） 核酸染色库存溶液。
        注：库存溶液应等分，并储存在-20°C下不受光线。
      6. 在PBS中制备0.2-2.0μg/mL核酸染色工作溶液，并在室温下用核酸染色工作溶液孵育固定细胞10分钟。
      7. 去除核酸染色工作溶液，用PBS轻轻冲洗细胞3分钟。细胞应保存在4°C的PBS中，防止光线。
    2. 线粒体和核染色分析
      1. 使用荧光显微镜分析细胞，使用适用于核酸污渍（+Ex/μEm：361/497 nm）和线粒体污渍（+Ex/+μEm：644/665 nm）的过滤组。通过核酸阳性染色和量化细胞数来查找细胞。量化线粒体染色荧光强度线粒体。
  4. 图像J 中的变形测量（球体计算）
    1. 从哥伦布软件将高内容分析 （HCA） 图像导出为 *.flex 文件。使用 Bio 格式插件32将 .flex 文件作为灰度作为图像 J 使用： 文件 > 导入 > 生物格式。
    2. 在" 导入选项" 窗口中，选择 "超堆栈查看 "，并在 "拆分为单独的 窗口"下启用拆分通道。此选项将允许访问特定通道中的所有文件（例如，DAPI、线跟踪器等）。不要选择在 内存管理下使用 虚拟堆栈。
      注：最好在图像中使用 DAPI 通道作为"灰尘"，因为培养基在 UV 波长中会降低（例如，405 nm）。
    3. 如果像素大小未根据 .flex 文件中的嵌入值加载，则调整像素大小 （分析 > 设置比例）。应用高斯模糊滤镜以消除过多的杂色，避免形状轮廓的不规则。过程 > 过滤器 > 高斯模糊.2.0 和 3.0 之间的西格玛（半径）值是大多数情况的理想。如果堆栈有多个图像，请应用于所有图像（选择"进程堆栈"窗口中的"是"）。
    4. 使用阈值生成二进制图像以分隔背景和器官（对象）。单击图像 > 调整 > 阈值。使用红色蒙版根据图像的强度调整值，以适合器官形状，保持形态完好无损。如果图像具有白色背景，请禁用"深色背景"。单击"应用"。
    5. 在"将堆栈转换为二进制"窗口中，选择阈值方法。通常，在此类图像处理中，默认或三角形是首选。保持背景为黑暗。如果堆栈中存在多个图像，请选择计算每个图像的阈值。
    6. 选择 "过程">二进制 > 填充孔。可选，从背景中去除孔。在 "处理>二进制"> 选项s 中， 选择黑色背景 并再次 执行填充 孔。在 继续 下一步之前，请禁用黑色背景选项。
    7. 单独的对象。对于有机体，分水岭法是一个不错的选择。单击 "进程">二进制 > 分水岭。执行形状分析。
      1. 选择"分析>设置测量值"。有几个选项可用（详细信息https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html）。对于器官，选择"面积"，"平均灰色值"，"最小和最大值"灰色值和形状描述符。选择"显示"标签以标识图像和科学表示法中的对象。单击"确定"。
      2. 选择 分析 > 分析粒子。选择 "大小 " 和"循环" 限制。分别保留 0 无穷大和 0.00-1.00 以测量图像中的所有对象。在 "显示" 中，选择 "大纲"，以便识别对象。启用 显示结果 以输出结果; 在边上排除 以排除接触边框的对象; 包括孔 ，以便对象中最终的内部孔被视为主形状的一部分。
    8. 对 每个图像 堆栈重复形状分析，结果将追加到单个表中。将结果表导出 到文件 > 保存 .csv为...
  5. 实时 PCR
    1. 按照制造商的指示，使用苯酚和瓜尼丁同位素的单相溶液从组织等价物中提取RNA。
    2. 通过逆转录1~2μg的总RNA进行cDNA合成。
    3. 使用基因特异性底向量（表5）放大所有靶点，以执行实时定量PCR.每个 qRT-PCR 包含 30 ng 的反向转录 RNA 和每个底转的 100 nM。
    4. 遵循 PCR 条件：50°C 3 分钟（1 个周期）;95 °C，5分钟（1次）;95 °C 30 秒，59 °C 45 秒，72 °C 45 秒（35 - 40 次循环）。
  6. CYP 测定
    1. 遵循第 2.2 节进行肝脏 2-OC 组装。实验组为无细胞控制、APAP 2 μM 12小时、24小时和车辆控制。遵循第 3.3 节和 4.2 节，进行 APAP 2 μM 制备和治疗。
      注：为确保所有样品同时准备好进行CYP检测，在开始24小时治疗后12小时开始12小时治疗。使用 0.5% 乙醇溶液处理 CYP 活性无细胞控制，以及车辆控制。
    2. 在室温下解冻 3 mM 致发光基板库存溶液，并在 William 的 E S. 中进行 1：1000 稀释，防止光线。
    3. 收集球体，将每个实验组转移到96井板的井中。拆下介质，用 100 μL 的 1x DPBS 洗涤两次，每井加入 80 μL 的 3 μM 基板溶液。将无细胞控制留在威廉的 E S 介质中。保存一个没有球体或基板溶液的井，用于背景控制。在37°C下孵育30-60分钟，用5%CO2，防止光线。
    4. 使用带酯酶的重组缓冲液平衡冻干路西林检测试剂 （LDR）。通过旋转或反转混合。将被处理的体积存放在室温下，直到下一步。
      注：重组后的LDR可储存在室温下24小时或4°C1周，不丧失活动。对于长期存储，储存在+20°C。
    5. 孵育后，在白色不透明96孔微孔的三个不同孔中转移25μL完整球体的上清液。每井添加25μLLDR，均质化。
    6. 在室温下孵育白板20分钟。读取发光仪上的亮度。请勿使用荧光计。
    7. 通过从经过试验的化合物处理和未经处理的（车辆控制）值中减去背景发光值（无细胞控制）来计算净信号。通过将处理净值除以未经处理的净值并乘以 100 来计算 CYP3A4 活动的百分比变化。
  7. 西方印迹
    1. 将肝脏球状体转移到已识别的 1.5 mL 微管。拆下介质，用 100 μL 的 1x DPBS 洗涤两次。
    2. 在4°C下将肝脏球状体在100μL细胞裂解RIPA缓冲液中裂解20分钟。离心机 15 分钟、4 °C 和 11000 rpm。将上一液转移到另一个已识别的 1.5 mL 微管。
    3. 量化通过布拉德福德方法获得的蛋白质量。从梯度聚丙烯酰胺凝胶每井的10至50μg蛋白质中加载10至50μg的蛋白质，并执行SDS-PAGE。
    4. 通过半干燥系统设备将加载的蛋白质从凝胶转移到 0.22 μm PVDF 膜。使用 50 mM Tris-HCl 和 192 mM 甘氨酸的转移溶液。根据要转移的凝胶数量（一次 1 到 2）设置设备参数。
    5. 在TBS-T缓冲液中用3-5%脱脂牛奶溶液阻断PVDF膜上的非特异性相互作用：三叶酸盐（50 mM Tris pH 7.6，150 mM 氯化钠）辅以Tween 20的0.1%。在室温下，保持膜在轻轻恒定的摇动下1小时。
    6. 在室温下轻轻持续摇动 3-5 分钟，用 TBS-T 清洗。重复此洗涤步骤两次。
    7. 在TBS-T上分别稀释白化素和文古林原抗体1：1000和1：2000。在4°C下，在轻轻不断的摇动下，用原抗体孵育膜过夜。
      注：始终按照制造商的指示稀释抗体。
    8. 去除原抗体并洗膜3次（步骤6.7.6）。稀释ECL抗小鼠IgG二级抗体至1：5000对TBS-T。在室温下轻轻持续摇动下，用二次抗体孵育膜2小时。
    9. 去除二次抗体并清洗膜（步骤6.7.6）。使用 ECL 西样板基物进行蛋白质检测。暴露自动放射胶片 30 秒至 30 分钟。在三钙中执行免疫印迹检测。

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Representative Results

要在 2-OC MPS 中执行 PK APAP 测试，第一步是制造人肠和肝脏等价物（器官）。在开始PKAPAP检测之前，它们被集成到2-OC微流体装置（图1A）24小时。第二天，介质被更改，模型将暴露在 APAP。图 1显示了放置在 2-OC 设备（图1B）和APAP PK 实验时间过程（图1C）内的肠道和肝脏等价物。我们在 2D 培养物和 3D 器官中进行了 MTT 测定、TEER 测量、HCA、实时 PCR、西部印迹、组织学和共和荧光显微镜，以检查组织的生存能力并检测可能的 APAP 毒性影响。在共分荧光显微镜图像中，染色有DAPI和Phalloidin（分别用于核和作用素）的肠道等效样本被作为非处理（图2A）和12μM APAP处理样品（图2B）的连续屏障。如图2C所示，MTT测定显示相对细胞生存能力水平超过70%，表明在12μM浓度33、34、35、36、37时对APAP暴露没有相关细胞毒性效应。阳性控制（100 mM）诱发重大细胞死亡（存活率低于5%）。在分化期间，TEER的进化验证了Caco-2/HT-29的生存能力和适当的分化以及肠道等效屏障完整性（图2D）。APAP 未导致 TEER 值的任何更改，如图2E 所示。分析了活性钠耦合葡萄糖运输器SLC5A1、多药耐药运输商MDR1和钠-钾 ATPase 的表达，验证了APAP治疗对细胞屏障形成和基底功能的影响。如图2 F+H所示，未治疗的和APAP治疗的肠道当量都显示出SLC5A1和NaKATPase的类似表达。12 μM APAP 诱导的口服药而，在 24 小时后，肠道当量中的 MDR1 mRNA 水平显著增加 （图 2H）。我们还通过荧光染料混合物对核和线粒体质量含量进行了细胞表型变化的HCA。正对控为 100 mM APAP 和 1% NaOH。

此外，我们分析了12μM APAPAP是否会诱导细胞毒性到2D Caco-2/HT-29共培养。图 2I 所示用荧光显微镜获得的肠道细胞图像证实了MTT数据，这些数据证明12μM APAP在Caco-2/HT-29肠道当量中没有引起显著的细胞毒性。

通过MTT测定和形态学分析，通过共生荧光显微镜、H&E组织学和HCA测定，对肝球体基底生存能力和细胞毒性对2μM APAP的响应进行了评估。如图3A所示，MTT测定无法识别任何相关的细胞毒性，以响应在静态和动态条件下从肝脏2-OC组件采集的样品中2 μm APA处理。细胞生存能力下降，但仍超过80%的12小时和24小时时间点33，34，35，36，37。阳性控制治疗（100 mM APAPAP 和 1% NaOH）引起严重的组织损伤（生存能力低于 10%）。微观共体图像表明，在基础或APAP治疗条件下，肝脏球类中没有坏死中心，并且没有证据表明死亡率显著（图3B-C）。然而，当我们通过HCA测定分析车辆或2μM APAP管理后多细胞表型变化时，使用100 mM APAP（C+）作为阳性对照，与MTT测定结果相矛盾时，肝细胞表现出对2μM APAP治疗的早期细胞毒性反应（图3D）。24小时后，核区域的细胞数量减少，线粒体质量增加。此外，含有 Hoechst 33342 和 MitoTracker 深红色（图 3J） 的荧光染料鸡尾酒也被用来染色3D 肝球类（图 3J）。斐济软件用于评估几个球体之间的3D球形结构同质性（图3E+I）。图3E 中所示的图形显示了肝脏球体总面积的相似性。纵横比（图3F）约1表示在球体的糖果过程中不存在偏置。评估还表明，大多数球体大致是圆舍的（图3G）。形态周长和细胞分布的评价分别通过圆度（图3I）和固体计算（图3H）进行。我们的结论是，对肝球体进行糖果的方法产生了平滑的器官，与球形生长相容，过程中无偏置或坏死。

如图 4A-B所示，肝球体分别表现出相对基底高水平的白化素和GST mRNA表达，表明基底功能正确。然而，2 μM APAP治疗24小时诱导白素和GST mRNA表达水平下降，表明肝球体功能损害在24小时时间点APAP治疗。

CYP3A4和UGT1A1mRNA表达水平的检测表明肝脏等效代谢能力。CYP3A4 mRNA基质水平（图4C）与之前的报告6一致。APAP治疗诱导CYP3A4 mRNA和UGT1A1表达下降的趋势，以回应APAP治疗（图4C-D）再次证实了在APAP治疗24小时时间点肝球体功能损伤的假设。

此外，还进行了西印迹和体外内酶活性的实验，以分析白蛋白表达，以及CYP 3A4活性在基础和APAP治疗条件下肝当量。我们发现，在肝脏2-OC MPS下进行2μM APAP治疗，在静态（图4E）和动态（图4F）条件下，在12小时和24小时的时间点下，肝脏等效总白素表达的减少。另一方面，与静态条件相比，来自动态条件的肝脏等量样本显示出一种趋势，表明白蛋白的蛋白质表达水平更高（图4G）。CYP 3A4在肝脏2-OC MPS的肝脏等价物下进行的体外测定表明，12小时或24小时2μM APAP治疗能够在静态和动态条件下诱导CYP 3A4活性的强健和显著损伤（图4H-I）。更有趣的是，与肝当量在没有循环介质（静态条件）的情况下保持肝脏当量（静态条件）相比，介质流动（动态）的存在导致肝脏当量CYP 3A4活性水平显著改善（图4J）。

为了找到有关HPLC分析的最敏感的分析条件，对几个参数进行了调查，包括移动相的组成、添加剂的类型和浓度。研究发现，乙酰甲酰甲酰甲酰酸盐的色谱分辨率和适当的保留时间比甲醇好。使用 C18 反相列获得 APAP 的快速且可重复的分离。APAP 保留时间 （Rt） 值为 9.27 ± 0.19 分钟。APAP 的选择性由峰值的形状和对称分辨率以及 DMEM 和 Williams 细胞培养介质中缺少干扰峰表示。

使用用醋酸铵缓冲液（1：1，v/v）稀释的DMEM S和Williams E S细胞培养基中的APAP标准浓度，其范围为0.25至100.00μM，用于构建校准曲线。该方法的线性度在九个浓度水平确定。数据见表2 和表 3。线性回归方程描述了APAP浓度与峰值区域之间的关系：y = 16106*x = 3579.8（R2±1， 在 DMEM 介质中）和 y = 16397*x = 2475.1（R2±1，在威廉姆斯介质中），其中"x"在 μM 中为 APAP 标称浓度，而"y"是 AU 中 APAP 的色谱峰区。在定量上限（即 100.00 μM）时，百分比偏差和运行间变异值小于 2.50%。除 0.50 μM （LLOQ） 外，9 个浓度水平的精度和精度在 DEV 和 C.V. 值小于 7.00% 的可接受范围内（表 2和表 3）。

在四个测试浓度下，运行间和运行内精度分析方法符合普遍接受的生物分析标准。通过分析 APAP 质量控制样本的复制结果，评估了该方法的可重复性，这些样本为 0.50 （LLOQ）、4.50、45.00 和 90.00 μM。表 4 中报告了运行内和运行间 平均结果。DEV值为15.00%，≤ C.V.值为7.00%，证明了测定的≤精度。

LOD 被确定为信噪比 （S/N） 刚刚大于 3 且对应于 0.25 μM APAP 的样本。另一方面，用 0.50 μM APAPP 样本估计的 LLOQ 显示的 S/N 比率等于 10。此外，我们发现精度值 （DEV%）范围在≤浓度值的19.00%以内。C.V. ≤ 18.77%， 表2、表 3 和表4）29，30） 显示了运行内和运行间变异性。

APAP PK分析在三个不同的2-OC MPS组件中进行：1） 肠2-OC，仅包含肠道当量;2） 肝脏 2-OC，仅包含肝脏球类和 3） 肠/肝脏 2-OC 与肠道屏障和肝球类。

对于吸收研究，口服途径被模仿的12μMAPAP在肠道等效的脂肪侧。APAP浓度由HPLC/UV在中度样品中测量，这些样本是从静态和动态条件下从基础肠道当量两侧收集的。从面壁和基础侧收集的介质中的APAP动力学表明，肠道模型能够吸收APAP。在肠道基底侧有逐渐减少的APAP浓度（图5A）同时，在肠道基底侧增加APAP浓度（图5B）。在施用（Tmax）12小时之后，介质中的最大浓度（Cmax）在静态和动态条件下约为2μM。

对于代谢研究，静脉注射被模仿在肝室的介质中应用2μM APAP。在静态和动态条件下介质中的 APAP 浓度动力学表明，只有在动态条件下才能检测到 APAP 浓度的降低，在 2 μM APAP 施用（T1+2 = 12 h）后达到 0.87 μM APAP 12 h。肝脏当量在静态条件下的代谢效率最低（图5C）。APAP浓度达到1.7μM12小时后APAP管理。在肠道/肝脏2-OC模型中进行了综合的、系统化的APAP吸收和代谢评估。APAP在肠道等价物的皮面上施用，模拟口服途径。从肠两侧和肝脏室采集中等样本。 图 5D 显示了 APAP 浓度在静态和动态条件下在水平侧逐渐衰减。

图5E显示了 可区分的吸收和代谢阶段。流动也影响肠道吸收。介质中的 APAP Cmax 从"肠 2-OC"（图5B）组件上的 2 μM 更改为动态"肠/肝脏 2-OC"的 1.7 μM（图 5E）。 图5F 显示了我们动态的"肠/肝脏2-OC"微生理系统（红色曲线和y轴）中APAP的浓度-时间轮廓与单口剂量1000mg（黑色曲线和y轴）后在人类身上获得的代表性轮廓之间的直接比较。

Figure 1
图 1：2-OC MPS 中 PK 研究的架构步骤编译。A） 2-OC MPS 的示意图，自下而上视图中显示肠道和肝人体组织等效项。 B）2-OC MPS 照片与肠道和肝脏等效项集成在设备的自下而上视图，具有代表性的光学显微镜图像。 C）组织等效物制剂、APAP 治疗和培养基收集阶段的时间轴，用于器官制造，以及药代动力学和毒理学评估。这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。 化学生物相互作用。 299， 59-76 （2019）. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：肠道当量的生存能力和毒理学评估。A） 具有未处理的Caco-2/HT-29细胞的共理荧光显微镜图像，这些细胞沾染了细胞核和作用素丝荧光染料（DAPI和Phalloidin）;63 倍放大，缩放 2.6。 B） 使用12μM APAP处理24小时，用核和作用丝荧光染料（DAPI和Phalloidin分别染色）的Caco-2/HT-29细胞的代表性共理荧光显微镜图像;63 倍放大，缩放 2.6。 C） 在静态和动态条件下，由MTT测定进行肠道等效性评估。图中条形表示的值是相对于车辆控制（时间点称为 0）计算的百分比：*P<0.05 0 与处理。 D） TEER 在 21 天分化期间的进化。*P<0.05 第 1 天与其他日子相比。 E） 在动态条件下，APAP 管理到肠道 2-OC MPS 后，TEER 值。肠道中的基因表达等价物。SLC5A1 （F）、Na-K-ATPase （G） 和MDR1 （H） 表达验证了肠道屏障的吸收潜力和 12 μM APAP 在动态条件下 24 小时可能产生的影响。值表示三个±的SEM平均值。结果表示为与家政服务的比率。*P<0.05 车辆与 APAP。 I）哥伦布的基于图像的HCA®2.4.0。软件。12 μM APAP治疗后不同时间点的2D肠共培养的代表性图像。负对比为中等（0小时）或车辆（0.5%乙醇）。此处所示的正控是 100 mM APAP。这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。 化学生物相互作用。 299， 59-76 （2019）. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：肝脏当量的生存能力和毒理学评估。A） 肝脏等效于MTT测定在静态和动态条件下的可行性评估。图中条形表示的值是相对于车辆控制（时间点称为 0）计算的百分比：*P<0.05 0 与处理。 B） 代表从车辆捕获的共和图像和 2 μM APAP 24 h 处理的肝球体从内侧。 C） 代表从车辆中捕获的 H&E（赤氧树脂和 eosin 染色）图像和从内段捕获的 2 μM APAP 24 h 处理过的肝球体。2μM APAP 治疗后，2D 肝脏在不同时间点的代表性图像 2μM D = 50 μm. D） 。在这些分析中考虑了用车辆和 2 μM APAP 处理的样品。荧光染料混合物包括用于核染色的 Hoechst 和用于线粒体质量染色的米托跟踪器深红色。负对比为中等（0小时）或车辆（0.5%乙醇）。正对控为 100 mM APAP。使用斐济软件对捕获的整个球体图像进行测量。 E） 面积 F ） 纵横比的频率分布， G） 圆度， H） 固体度， I） 圆度.N = 85。*p < 0，05. J） Operetta 使用 LWD 10x 目标获得的 3D 肝球体的代表性图像。这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。 化学生物相互作用。 299， 59-76 （2019）. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：通过基因和蛋白质表达以及酶活性验证了肝脏的生存能力/功能以及2μM APAP在静态和动态条件下的可能影响。A） 白细胞基因表达。B） GSTA2基因表达。在动态条件下，通过CYP3A4（C）和UGT1A1（D）的基因表达验证了肝脏在动态条件下2μM APAP的2μM APAP的可受性作用。E） 静态条件下总白蛋白表达。F） 动态条件下总白蛋白表达。条件。G） 比较图，说明在静态或动态条件下培养和治疗的肝脏等价物中总白素表达的差异。H） CYP 3A4 在静态条件下的体外内创酶活性。I） CYP 3A4 在动态条件下的体外内创酶活性。J） 比较图，说明在静态或动态条件下培养和治疗的肝当量中CYP 3A4活性的差异。值表示三个±的SEM平均值。基因表达数据表示为与家政GAPH的比率。蛋白质表达数据以与文库林蛋白的比例表示。*P<0.05 车辆与 APAP 治疗。这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。化学生物相互作用。299， 59-76 （2019）.请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：2-OC MPS中APAP药代动力学分析。在肠道 2-OC MPS 制备的 apical 端进行 12 μM APAP 管理后，APAP 吸收轮廓。肠道屏障是由Caco-2/HT-29细胞系（A）的静态和动态APAP浓度在介质中从阴极侧（代表人类肠道流明侧）共同培养的。（B） 基质中静态和动态APAP浓度（代表人类肠道血侧）。*P<0.05 静态条件与动态条件。 C）APAP代谢配置文件在肝脏2-OC MPS由赫帕格/HHSTEC肝球体。将 2 μM APAP 管理后静态和动态条件进行比较到介质中。*P<0.05 0h vs 6 小时、12 小时和 24 小时 APAP 治疗。APAP吸收和代谢轮廓后12μM施用肠道屏障的肠道屏障，肠2-OC MPS制剂的肠道屏障一侧。这模拟了口头路线。肠道屏障由Caco-2/HT-29细胞系和肝等价物组成，由肝细胞系的球状体组成。（D） 在静态和动态条件下，肠道/肝脏2-OC APAP浓度在肠道屏障的腹侧。（E） 在静态和动态条件下，肠道/肝脏2-OC APAP浓度在介质中。*P<0.05 静态条件与动态条件。（F） 比较我们微生理系统中APAP的浓度-时间轮廓（红色曲线和y轴）与在单次口服剂量为1000mg（黑色曲线和y轴）后在人类身上获得的代表性轮廓。使用 WebPlotDigitizer 4.2 （https://automeris.io/WebPlotDigitizer） 从https://automeris.io/WebPlotDigitizer。这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。 化学生物相互作用。 299， 59-76 （2019）. 请单击此处查看此图的较大版本。

HPLC 系统 沃特斯联盟 2695 （美国加利福尼亚州米尔福德），配备四元泵、样品管理器和脱气器
探测器 水 2996 Uv-Vis 设置在 210-400 nm 范围内
系统控制、数据采集和处理 沃特世授权 2002 色谱软件
列 反相 Luna C18
（150 x 4.6 毫米的径;5 毫米颗粒尺寸）
佩诺梅内克斯
防护栏 反相 Luna C18 （4 x 3 毫米）
佩诺梅内克斯
移动阶段 溶剂 A- 乙酰三叶酸
溶剂 B- 0.10 M 醋酸铵，pH 6.8
等格拉底条件 时间 A （%） B （%）
（最小）
15 5 95
流 1.0 mL/分钟
喷射体积 25 μL
温度 25 °C
APAP 检测 UV = 243 和 254 nm
运行时间 15 分钟

表1：用于培养介质矩阵中APAP的HPLC-UV分析的条件和参数。

标称浓度 计算APAP浓度（μM） 平均 （μM） S.D.b C.V. 开发
（μM） （每次浓度的三分之一） （μM） （%）c （%）d
检测编号 1 2 3 4 5 6
0.25 （LOD） 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 € 46.05
0.50 （LLOQ） 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 € 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 € 6.65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 €0.09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 €0.03
R 2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

表2：运行间变异 – 在DMEM介质与6个独立测定的0.10M醋酸铵缓冲液（1：1，v/v）混合中准备的标准曲线样品的精度、精度和线性度。a
a线性曲线与实验中描述的理论浓度相比，在响应数据（APAPAP） 中拟合了一条线性曲线。计算浓度来自根据校准曲线读取每个标准样品的响应。每个条目（分析 1-6）对应于三次分析的平均值。
bSD = 标准偏差。
cC.V. （变化系数. 精度）.
d精度 （DEV %） = 计算浓度与标称值的偏差。
这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。 化学生物相互作用。 299， 59-76 （2019）.

标称浓度 计算APAP浓度（μM） 平均 S.D.b C.V. 开发
（μM） （每次浓度的三分之一） （μM） （μM） （%）c （%）d
检测编号 1 2 3 4 5
0.25 （LOD） 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 ¥26.03
0.50 （LLOQ） 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 ¥14.97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 ¥6.85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 ¥1.56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 ±0.01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 €0.05
R 2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

表3：运行间变异 – 标准曲线样本的精度、精度和线性度，由六种独立测定的0.10M醋酸铵缓冲液（1：1，v/v）混合使用。以威廉姆斯介质为混合物准备的标准曲线样本。a
a线性曲线与实验中描述的理论浓度相比，在响应数据（APAPAP） 中拟合了一条线性曲线。计算浓度来自根据校准曲线读取每个标准样品的响应。每个条目（分析 1-5）对应于三次分析的平均值。
bSD = 标准偏差。
cC.V. （变化系数. 精度）.
d精度 （DEV %） = 计算浓度与标称值的偏差。
这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。 化学生物相互作用。 299， 59-76 （2019）.

威廉姆斯媒体 标称浓度 测量浓度 S.D. C.V. 开发
（μM） （μM） （μM） (%) (%)
运行内部 （n=3） 0.50 （LLOQ） 0.49 0.08 15.55 ±1.77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 ¥8.37
90.00 82.29 1.75 2.13 ¥8.57
间运行 （n=15） 0.50 （LLOQ） 0.43 0.05 10.99 ¥14.97
4.50 4.37 0.19 4.42 ¥2.99
45.00 42.35 0.82 1.93 ¥5.88
90.00 85.22 2.25 2.65 ¥5.31
DMEM 介质 标称浓度 测量浓度 S.D. C.V. 开发
（μM） （μM） （μM） (%) (%)
运行内部 （n=3） 0.50 （LLOQ） 0.47 0.09 18.77 ¥6.35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1.04
45.00 44.24 1.59 3.58 ¥1.69
90.00 86.40 4.09 4.73 ¥4.00
间运行 （n=12） 0.50 （LLOQ） 0.46 0.08 17.81 ¥7.75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

表4：质量控制样品中APAP的运行内和间精度。 a
a数据显示为平均值。SD（标准偏差）。C.V. （变化系数. 精度） 和精度 （百分比偏差）。开发%）。
这个数字已经修改了马林等人。肠/肝脏微生理系统中的对乙酰氨基酚吸收和代谢。 化学生物相互作用。 299， 59-76 （2019）.

底图 （5' → 3'）
组织 基因 向前 反向
肠 SGLT1/SLC5A1 加格卡克特克 卡格特卡加格特
纳 - K - atpase Accgaacc 卡格格特卡特克
MDR1 特加格特克格特加格 格特格
肝 白 蛋白 特加格格加塔加格 塔加格特格特特塔卡茨
GSTA2 克加格格加格 阿加加格格特塔格
CPY3A4 加格特 · 加卡加加格特格 塔克格特克卡特格萨克
UGT1A1 阿格特卡格格加加茨 ggtccttgtgagggtggag

表5：实时 qPCR 底土器，用于评估肠道和肝脏组织 2-OC 培养物中 mRNA 水平的基因转录

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Discussion

准确、可靠地评估研究性新药的药理特性，对于降低以下开发步骤的风险至关重要。MPS 是一项相对较新的技术，旨在提高预测能力，减少临床前测试的成本和时间。我们的团队正在推进对铅优化所需的药代动力学和毒理学特性的评估。我们与2-OC微流体装置合作，该装置有两个腔室，允许两个器官的整合。APAP之所以被选中，是因为它拥有大量高质量的人类数据，大部分是肝脏代谢的，并且也表现出肝毒性。研究方案旨在模拟人类第一阶段临床试验的一些步骤，即对志愿者进行口头施用药物，并绘制定期血液样本以评估药物的浓度，以了解药代动力学特性，并收集生化和临床参数，以评估安全性和耐受性。因此，当 MPS 发展到足以提供可靠的预测时，它将大大降低第一阶段试验中失败的风险。通过在未来添加疾病模型，同样的假设可能适用于II期和III期临床试验。

所有研究都以三种模式进行：肠道2-OC（APAP口服给药）、肝脏2-OC（静脉注射）和肠道/肝脏2-OC（口服给药）。第一个模型分离吸收，第二个代谢，和第三个集成两者。我们首先生产了器官并并纳入微流体装置，其次管理APAP并收集介质样本，最后进行了一组测试，以评估APAP暴露的细胞生存能力和功能以及毒理学影响。在药代动力学研究中，我们开发并验证了一种在介质中APAP定量的色谱方法。验证符合FDA29、30所概述的生物分析方法验证指南，内容包括特异性、线性度、定量限（LOQ）、检测限值（LOD）、矩阵效应、精度和精度。特异性由来自两个不同来源的空白、池和单个生物样本确定。该方法在分析过程中执行得可以接受，数据证实了一个简单的等式移动相分离和量化APAP的能力。

肠道和肝脏器官的生存能力/功能性由不同的技术评估。对于肠道等效物，共理荧光显微镜（图2A-B），MTT测定（图2C），基因表达评估（图2D-F）或HCA实验，在APAP暴露后24小时未检测到任何毒性。同样，MTT测定没有检测出APAP在肝脏当量中引起的毒性侮辱（图3A）。然而，HCA技术增加了通过观察细胞表型变化，通过观察细胞表型变化，以及一些机械线索（图3D），检测肝细胞早期毒性事件（APAP暴露后24小时）的可能性。另一方面，共和荧光显微镜（图3B）和组织学（图3C）是研究人体组织等量的生存能力状态的有用补充工具。对于肝细胞，同时使用不同的技术是非常有利的。如前所述，MTT 检测无法检测 APAP 24 h 暴露后 HCA 24 h 检测到的 APAP 细胞毒性。基因表达分析评估肠道的功能 （图2D-F） 和肝脏器官 （图4A-D） 在基础和 24 小时后 APAP 治疗.在基础条件下，有正常水平的肠道和肝脏特异性标记，建议适当的功能。在24小时APAP暴露后，白化素、GST mRNA水平呈下降，且肝等效组织中CYP3A4基因表达呈下降趋势，表明APAP早期细胞毒性。证实了这些发现，西方的印迹实验表明，基因表达的减少也伴随着肝脏总白蛋白蛋白表达的强劲增长，以回应APAP治疗（图4E-F），证实了接触APAP对肝脏组织施加的毒性侮辱。因此，体外内酶活性的实验表明，在肝脏当量中，由APAP治疗引起的CYP 3A4活性水平有强劲且逐步降低（图4H-I）。

在图像J（图3E-I）上对器官进行形态测量。该区域揭示了 2D 大小与所分析的所有器官的接近性，这些器官可用作本协议中的标准化，以便产生公正的结果。"形状描述符"显示与形状形态精确对应的统计信息。纵横比是使用主轴和次要轴的指数，因此在器官形成过程中，1 左右的结果表示无偏差（即优先生长）。圆度值（4×面积]/（π ×[主轴]2）对优先增长非常敏感，该增长将揭示为主轴。固体度（[面积]/（[凸面面积]）对于显示总形态至关重要，因为它不受边界不规则的影响，因为它使用凸面区域（+包络）。以 1.0 为中心的分布表示球形增长。相反，循环度（4× π[面积]/[周边]2）对复杂的周长非常敏感，因此"空腔"或"口袋"会影响此指数。因此，1 周围的循环也证实了认为球形生长，与适当的有机体功能相容。

分析结果表明，MPS可以模拟APAP吸收和代谢特性，既分离，又集成在一条曲线中，与体内产生的（图5F）相当，没有排泄期。在静态和动态条件下，口服后APAP吸收与肠道 MPS 或肠/肝脏 MPS 模型相似（图 5A-B，图 5D-E）。在这两个中，APAP浓度在阿皮克侧同时降低，其在基底侧增加，静态和动态条件没有显著差异。相比之下，APAP肝代谢在这些条件下不同。MPS 中的循环介质似乎提高了器官代谢能力（图 5C和图 5E）。有一个显著的APAP衰变下溢，没有流动就见不到。有趣的是，在体外，CYP3A4活动实验证实了系统中流动的存在增加了人类肝脏当量功能的假设。如图4J所示，CYP3A4在基础和APAP治疗条件下保持的肝脏等价物的活性显著增加。同样，在流量下保持的肝脏等价物（动态）与在基线或APAP治疗条件下保持无流动（静态）的蛋白表达相比，呈增加（图4G）

与口服APAP给人类后浓度时间剖面相比，我们的微观生理系统显示的t 1/2（ 半寿命时间）要大得多（图5F）。如前所述，这种情况会发生，因为我们有一个双器官系统，肠和肝脏当量可以吸收和代谢药物，没有肾脏等效于排泄的APAP及其代谢物从血浆室38。除此之外，微生理系统显示的Cmax（峰值血浆浓度）和更大的tmax（到达Cmax的时间）比通常观察到的人类（图5F）。这是体外和体内实验规模差异的结果。总体而言，使用微生理系统获得的浓度-时间剖面与口服APAP给人类后获得的剖面之间有三个主要区别：较大的t1/2，较小的C最大值 和更大的t最大值 （图5F）。虽然较大的t1/2 是由于没有肾脏相当于排泄的APAP及其代谢物从血浆当量，较小的C 最大和更大的t最大值 是实验小规模的结果，相比之下，人体。构建和操作微生理系统的最佳缩放策略仍然是一个活跃的研究领域，不可能单一的方法是最适合所有系统39。此外，数学建模或机器学习可用于应用修正或学习从微量表到满量表的映射，以便推断出通过微观生理系统获得的体外数据，以在人类体内观察到的体内行为40。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢克里斯蒂·古根-吉卢佐博士、INSERM 522单元的菲利普·格里邦博士和271 INSERM单元的克里斯蒂安·特雷波博士使用生物材料（Hepa RG细胞），并随后提供给我们进行学术研究。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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References

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化学， 问题 166， 微生理系统， 对乙酰氨基酚， ADMETox， 有机体
药物药代动力学和毒理学评估的肠道/肝脏微生理系统
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Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

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