Summary
腸と肝オルガノイドを有する微小生理学的システム(MPS)をアセトアミノフェン(APAP)に曝露した。本稿では、MPSにおけるオルガノイド産生法およびAPAP薬物動態学的および毒性学的特性評価法について説明する。また、結果を検証するために必要な組織機能分析についても説明します。
Abstract
ヒトオルガノイドを栽培する最近導入された微小生理学的システム(MPS)は、遺伝的にヒトであり、組織間の相互作用を再現するため、薬物開発プロセスの前臨床試験段階で動物よりも優れたパフォーマンスが期待されています。本研究では、ヒト腸バリア(Caco-2およびHT-29細胞の共培養によってエミュレートされる)と肝臓等価物(分化されたHepaRG細胞およびヒト肝星状細胞で作られたスフェロイドによってエミュレートされる)を、2臓器チップ(2-OC)微小流体装置に統合し、アセトアミノフェン(APAP)薬能的反応薬基性(PK)および毒性特性を評価した。MPSには、腸のみ2-OC、肝臓のみ2-OC、腸/肝臓2-OCの3つのアセンブリがあり、両方のオルガノイドを介する同じ培地が付いていました。PK評価では、腸の障壁(経口経路をエミュレートする)または媒体(静脈内経路をエミュレートする)をそれぞれ12μMおよび2μMで投与した後、事前設定された時点でメディアにAPAPを投与した。培地サンプルを、逆相高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析した。オルガノイドは、遺伝子発現、TEER値、タンパク質発現および活性について分析し、次いで収集、固定、および形態学的評価のセットに提出した。MTT技術はオルガノイドの生存率を評価する上で良好な成績を発揮したが、高含量分析(HCA)はAPAP治療に応答して非常に初期の毒性事象を検出することができた。我々は、培地流量がAPAP吸収に有意に影響を及ぼさないのに対し、肝臓と同等の機能を有意に改善することを検証した。APAPヒト腸管吸収および肝代謝は、MPSでエミュレートすることができる。MPSデータとインシリコモデリングとの関連は、インビトロ法の予測可能性を向上させ、薬物動態および毒物学的研究における動物モデルよりも優れた精度を提供する大きな可能性を秘めています。
Introduction
ゲノムとプロテオミクスの違いにより、動物モデルはいくつかの人間の結果に対して予測値が限られています。さらに、彼らは時間がかかり、高価で倫理的に疑わしい1です。MPSは、予測力の向上を目的とし、前臨床試験に費やされるコストと時間を削減することを目的とした比較的新しい技術です。オルガノイド(臓器の人工模倣機能単位)を、オルガノイドとオルガノイドのコミュニケーションを促進する媒体流れの下で育成する微小流体デバイスです。ヒト細胞から作られたオルガノイドは、翻訳関連性を2、3、4に増加させる。MPSは、遺伝的にヒトであり、組織間の相互作用を再現するため、動物実験よりも優れたパフォーマンスを発揮することが期待されています。完全に機能すると、MPSはより高い速度と低コストとリスク4で、より有意義な結果を提供します。多くのグループは、いくつかの目的のためにMPSを開発しています, 特に薬物の有効性をテストするための疾患モデル.
暴露レベルは、薬効と毒性5、6、7、8、9、10、11、12を評価するための最も重要なパラメータの1つです。MPSは全身暴露をエミュレートするオルガノイド統合を可能にし、従来の2Dヒト組織培養よりも優れたパフォーマンスを発揮することが期待される。この技術は、化合物腸吸収と肝臓代謝の予測を大幅に改善することができます4.
腸と肝臓のヒト等価モデルを統合するMPSは、薬物生物学的利用能および全身暴露におけるこれら2つの器官の中心的な役割を考慮して、良い出発点である13、14、15。APAPは、その代謝が主に肝臓16、17によって行われるので、腎臓と同等のMPSを研究するための魅力的な薬です。
2-OCは、マイクロチャネル16によって相互接続された2つの異なるヒト等価組織/オルガノイドの培養に適した2チャンバーマイクロ流体装置である。インビトロヒトの経口/静脈内投与をエミュレートし、腸と肝臓の同等物がAPAP薬物動態に及ぼすクロストークの影響を評価するために、 オルガノイドの機能性と生存率に加えて、3つの異なるMPSアセンブリが行われました:(1)2-OCデバイスに統合されたCaco-2 + HT-29細胞の共培養を含む培養インサートに基づく腸と同等の腸で構成される「腸2-OC MPS」。(2)2-OCデバイスに組み込まれたヘパRG+HHSteC(ヒト肝星状細胞)から成る肝スフェロイドで構成される「肝臓2-OC MPS」。そして(3)マイクロ流体チャネルを通る媒体流によって他方の肝臓と同等の肝臓と通信する一つの装置コンパートメントの腸と同等の腸で構成される「腸/肝臓2-OC MPS」。
全てのアッセイは、細胞の生存率及び機能性18、19、20に対する機械的刺激(圧縮、伸張、および剪断)の影響による静的(流れなし)および動的(流れ)条件下で行われた。本稿では、APAP経口/静脈内投与エミュレーションのプロトコルと、ヒト腸および肝臓等価モデルを含む2-OC MPSにおけるそれぞれの吸収/代謝および毒物学的分析について説明する。
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Protocol
1. 2-OCでの栽培に使用する組織等価物の製造
- 小腸バリア同等生産
- 腸に相当する培地を使用してCaco-2およびHT-29細胞を維持する:DMEMは10%FBS、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を補充し、この原稿では「DMEM S」と名付けられました。
- 培地を取り出し、1x DPBSで2回洗浄し、0.25%トリプシン/EDTAの8 mLを加えて、細胞培養フラスコで増殖させたCaco-2細胞を解化する(175 cm2)。37°Cで5分間インキュベートし、少なくとも2倍のトリプシン阻害剤を添加して反応を停止する。HT-29細胞に対して同様の手順を実行し、これらの細胞の少量が必要であり、それらがより小さなフラスコ(75cm2)で維持されるので、試薬の体積を調節する。
- 遠心分離機を5分間250xgで、両方のチューブから上澄み剤を取り除き、細胞ペレットを10 mLのDMEM S.Count細胞に再懸濁し、80%以上の細胞生存率を保証する。 無菌的にバソラテラサイド(人間の血流を表す)のウェルあたりDMEM Sの400 μLで満たされた24ウェルプレートに細胞培養挿入物を統合する。
- 9:121の比率でCaco-2とHT-29細胞を共同栽培する。DMEM Sの最終容積200μLで各腸に相当する2.25 x 105 Caco-2および2.5 x 104 HT-29細胞を使用し、所望のオルガノイド数に応じて細胞数と体積を調整します。慎重に混ぜます。
- ピペット200μLの細胞溶液を各インサートのアプリカル側(ヒト腸管腔側を表す)に入れ、挿入ごとに250,000個の細胞を播種する。3週間の挿入物中の細胞を共同培養22.培地を週に3回以上変更し、無菌パスツールピペットで補助側側とバソララル側の両方から吸引し、無傷の細胞バリアを損傷しないように注意する。
注:セルバリア(セルインサートのプラスチックリムのパスツールピペットを支持して吸引)に触れないように、アプリカル側の吸引を進めます。 - メーカーの指示に従って、3日ごとに鉄(経上皮電気抵抗)を測定して、1層の密着性を確認します。
- ブランクを実行し、細胞のない細胞培養挿入物の間で抵抗を測定しますが、同じ細胞媒体と同じ細胞プレートで測定します。
- 組織等価抵抗からブランク抵抗を差し引き、フィルター膜の有効表面積(0.6cm2)を掛けて組織抵抗を計算する。良好な腸バリア抵抗は、150〜400 Ω∙cm2の範囲にある。
注:21日後、細胞は完全に分化し、腸の障壁が形成されなければならないので、腸の同等物はMPSに統合される準備ができています。
- 肝臓等価生産
- 10%のウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、100単位/mLペニシリン、100 μg/mLレンサ球菌、5 μg/mLヒトインスリンおよび5 x 10-5 MHydrocortisoneを添加したウィリアムの培地である肝同等培地を使用してHepaRG細胞を維持し、「このウィリアムズの原稿E」と名付けられました。HepaRG培地を2~3日ごとに更新し、細胞培養を2週間維持して、肝細胞および血行細胞の分化を開始する。
- 最初の2週間の後、細胞分化24、25を完了するためにさらに2週間HepaRGの培地に2%DMSOを加える。ステラート細胞培地(SteC CM)でHHSTeCを成長させ、ポリL-リジンコーティング細胞培養フラスコを使用して、2〜3日ごとに培地を変化させる。
- 培地を取り出し、1x DPBSで2回洗浄し、0.05%トリプシン/EDTAの8mLを加え、細胞培養フラスコで増殖させたHepaRG細胞を解約する(175cm2)。37°Cで5〜10分間インキュベートし、トリプシン阻害剤の少なくとも2倍の体積を加えて反応を停止する。HHSTeCに対しても同じものを実行し、これらの細胞の量が少ないため試薬量を適応させ、より小さなフラスコ(75cm2)で維持することができるので、
- 遠心分離機は250 x g で5分間、上清を取り除き、ウィリアムズE S培地中の細胞ペレットを再懸濁する。セルを数え、80%を超える細胞生存率を保証する。
- ウィリアムズE S培地16で、それぞれ24:1の比率でhepaRGとHHSTeC細胞を組み合わせた肝臓スフェロイドを生成する。4.8 x 104 分化ヘパRGと 0.2 x 104 HHSTeC を加えて、50,000 個の細胞の各肝スフェロイドを構成し、80 μL の体積でセル数と体積を所望のスフェロイド数に応じて調整します。慎重に混ぜます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、384個のスフェロイドマイクロプレートの各ウェルに結合されたセルプールの80 μLを分配し、丸いボトムジオメトリを持っています。
注:4日後、約300μmのスフェロイドが形成されます。 - 広孔の先端を使用して、肝臓のスフェロイドを超低く取り付け可能な6ウェルプレートに移し、必要な「1つずつ」カウントを可能にする。
2. 腸と肝臓の同等物の2-OC MPSにおける統合
-
吸収アッセイのための腸2-OC MPSアセンブリ
- DMEM Sのピペット500 μLは、小さい方の2-OCおよび300 μLのより大きいコンパートメントに入る。24ウェルプレートに相当する各腸壁のバソラテラおよびアピカル培地を吸引する。滅菌鉗子を使用して、2-OC回路ごとに1つの挿入物を、特に大きいコンパートメントに統合する。腸培地の200μLを補助側に塗布する。
注:オルガノイドをMPSに組み込む場合は、気泡の形成を避けてください。 - MPSを制御ユニットに接続し、加圧空気供給に接続する必要があります。パラメータを設定:約±300バーの圧力と0.3 Hzのポンピング周波数を設定し、試験物質投与の前に流れを24時間開始します。翌日、APAP治療を行う。
- DMEM Sのピペット500 μLは、小さい方の2-OCおよび300 μLのより大きいコンパートメントに入る。24ウェルプレートに相当する各腸壁のバソラテラおよびアピカル培地を吸引する。滅菌鉗子を使用して、2-OC回路ごとに1つの挿入物を、特に大きいコンパートメントに統合する。腸培地の200μLを補助側に塗布する。
-
代謝アッセイのための肝臓2-OC MPSアセンブリ
- ウィリアムズE Sのピペット650 μLは大きなコンパートメントに、350 μLは小さなコンパートメントに入り、スフェロイドを受け取ります。超低添付着6ウェルプレートでは、広孔先端を使用して回転楕円体をカウントします。各肝臓の同等物は、20個の回転楕円体26で構成される。オルガノイドのみの転送を可能にする広孔先端を使用して、回路ごとに20の肝臓相当物を2-OCの小さなコンパートメントに統合する。
- MPSを制御ユニットに接続し、加圧空気供給に接続する必要があります。パラメータを設定:約±300バーの圧力と0.3 Hzのポンピング周波数を設定し、試験物質投与の前に流れを24時間開始します。翌日、APAP治療を行う。
-
吸収と代謝アッセイのための腸/肝臓2-OC MPSアセンブリ
- 2つの培地(腸と肝臓)を1:4の割合で組み合わせると、腸管の補助側に200μLのDMEM S、バソラテラ側のウィリアムズE Sの800 μLを意味します。腸と肝臓の同等物を同時に2-OCに統合する。
- MPSを制御ユニットに接続し、加圧空気供給に接続する必要があります。パラメータを設定:約±300バーの圧力と0.3 Hzのポンピング周波数を設定し、試験物質投与の前に流れを24時間開始します。翌日、APAP治療を行う。
注: すべての実験では、3 つの 2-OC 回路 (つまり、1 および 1/2 2-OC デバイス) を 3 つの分離した場合に、各タイム ポイントを実行します。各2-OC回路の総容量は1mLです。
3. アセトアミノフェン(APAP)製剤
- APAPストック溶液を調製し、APAPを絶対エタノールに溶解する。実験の日に、それぞれの培地(APAP溶液)でAPAPを希釈し、「経口投与」に対して12μM、2μMの濃度に「静脈内投与」を行う。
- 両方の投与において、車両制御および処理溶液中のエタノールの最終濃度が0.5%であることを確認してください。陽性対照(100mM APAP)の場合、エタノール濃度は2%である。
4. 試験物質の投与とメディアサンプリング
- APAP「経口」投与およびメディアサンプリング
- 適切な培養培地の各腸壁と腹膜媒体を、適切な培養培地のピペット500μLにそれぞれ吸引し、オルガノイドバソララル側の大室に、300μLを小区画に入れます。
- 気泡を確認し、試験物質を有する腸バリア同等の治療を経て、経理側で、経口投与をエミュレートする。腸管の「ルーメン側」を表す腸培養インサートの補助側に12μM APAP溶液の200 μLを加えることによってAPAP「経口」投与をエミュレートする(図1B)。MPS を制御装置に接続します。
- 次の時点で、補助的およびバソラテラの側から総体積を収集する:0時間、5分、15分、30分、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間15、27。静的および動的条件ですべての実験を三重に行い、各三重体の各サンプルを別々のマイクロチューブに集めます。HPLC/UV を使用してサンプルを分析します。
注:別の補助的なサンプルとバソラテララルサンプル。
- APAP「静脈内」投与およびメディアサンプリング
- 2 μM APAP溶液を直接肝臓コンパートメントに投与することで、「静脈内」経路をエミュレートします。すべての2OC培地コンテンツを吸引します。試験物質を含むウィリアムズE Sのピペット650 μLは、同じ培地の350 μLを含む20個のスフェロイドを含む小さなコンパートメントに入った。0 h、30 分、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、および 24 h27、28の時点ですべてのボリュームを収集します。
- 静的および動的条件で、三重ですべての実験を行います。各三重体の各サンプルを別々のマイクロチューブに集める。HPLC/UV を使用してサンプルを分析します。
5. 計測とクロマトグラフィーの条件
- HPLC分析
- 表 1に従って、HPLC 分析に関連するすべてのパラメータを設定します。
- 真空下で0.45 μmの膜フィルターを通して移動相をフィルター処理します。0.22 μmの細孔サイズPVDFシリンジフィルター(直径13mm)でサンプルをフィルターし、バイアルに保管します。測定を開始します。
- ストックソリューション、校正規格、品質管理(QC)サンプル
- 酢酸アンモニウムバッファー (100 mM, pH 6.8) で APAP ストック溶液を 10 mM 準備し、酢酸アンモニウムバッファー (1:1, v/v) で希釈した DMEM S およびウィリアムズ E S 細胞培養培地でさらに希釈して 0.25 ~ 100.00 μM の範囲の作業ソリューションを実現します。
- 三重にキャリブレーションサンプルのセットを含めるとともに、品質管理サンプルを三重に4段階で含めます。シリアル希釈によってこれらの標準を準備します。
- APAPピーク領域とAPAP公称標準濃度の較正曲線を作成します。各キャリブレーション曲線に対する線形回帰適合を決定します。目視検査、相関係数、実行精度と実行間精度、精度の値を使用して、さまざまな校正モデルの適合度を評価します。
- セクストプリケートで酢酸アンモニウムバッファー(1:1、v/v)で希釈されたDMEM SおよびウィリアムズE S培地のブランクサンプルを注入します。APAP濃度0.50(LOQ)、4.50、45.00、90.00 μMのAPAP濃度に対して、酢酸アンモニウムバッファー(1:1、v/v)で希釈したDMEM SおよびウィリアムズE S培地で品質管理サンプルの三部分解物を調製します。
- 標準曲線の生成に使用した品質評価サンプルとは異なる新しいストックソリューションから、品質制御サンプルが用意されていることを確認します。品質管理サンプルを使用して、イントラランとインターランのバリエーションを調査します。
- 検証手順
- 前述の手順29,30に従ってバイオアナリシス法の検証を実行します。ウィリアムズE SとDMEM S細胞培養培地を考慮して、クロマトグラフィーは5〜6回の別々の機会に実行されます。
- APAP の 0.25 ~ 100.00 μM の範囲のキャリブレーション ポイントを、酢酸アンモニウムバッファー(1:1、v/v)で希釈した DMEM S またはウィリアムズ E S 細胞培養培地 (1:1, v/v) で、それぞれの公称濃度(軸 x)に対する APAP (軸 y) のピーク領域に基づいてプロットされていることを確認します。これらの標準キャリブレーション曲線の傾きを酢酸アンモニウムバッファーで調製された較正曲線の傾きと比較します。すべてのキャリブレーションカーブの相関値が 0.998 以上であることを確認します。
- 5~6日間の4つの異なるレベルLLOQ、低、中間、および高品質の制御での反復を使用して、サロゲートマトリックス内の検数の精度と精度(イントラおよびインターラン)を決定します。0.50、4.50、45.00、90.00 μM APAP濃度(n= 3)を含む酢酸アンモニウムバッファー(1:1、v/v)で希釈されたDMEM SまたはウィリアムズE S細胞培養培地で、同じ日に実行中の精度と精度の測定を行います。
- 最近取得したキャリブレーション曲線からAPAP濃度を含む各品質管理サンプルを評価します。干渉成分によって引き起こされる目的の化合物と可能な他のクロマトグラフィーピークの分離の程度によってアッセイの選択性をテストする。
- 定量(LLOQ)の下限と検出限界(LOD)
- 応答の標準偏差と勾配アプローチに基づいて、定量(LLOQ)の下限を決定します。αはy-切片の標準偏差、Sはキャリブレーション曲線29,30をプロットして得られる直線の傾きである式10α/Sを用いて計算する。検出限界(LOD)を推定して、ブランクの標準偏差の3.3倍を考慮し、較正曲線29,30の傾きで割った値を示す。
6. 組織等価の生存率/機能性
- Mtt
- MPSアッセイのすべての時間ポイントでオルガノイド生存率を評価するためにMTTアッセイを実行する。ネガティブコントロールとして、セルメディアと車両を使用します。陽性対照として、細胞培地で100mM APAPと1%NaOH希釈したオルガノイドを治療する。
- 各々の20個のスフェロイドを96のウェルプレート内の個々のウェルに対して移し、腸に相当する細胞を含む細胞培養インサートを24のウェルセルプレートに移し、1つの腸をウェルごとに同等の腸に置く。1x DPBSで組織に相当する量を3回洗浄します。
- 300 μL の 1 mg/mL MTT 溶液を加え、各細胞培地で希釈します。標準的な細胞培養条件でプレートを3時間インキュベートします。
- ピペット処理を行うことで、各井戸からMTT溶液を慎重に取り除きます。腸および肝臓当量からMTTフォルマザンを抽出し、4°Cで一晩200μLのイソプロパノールを使用します。
注:蒸発を防ぐために蓋を密封してください。 - 各上清の200 μLを、96ウェルマイクロテストプレートで事前に識別された各ウェルに移します。イソプロパノールをブランクとして使用します。
- 570 nmのプレートリーダーでフォルマザン吸光度をお読みください。MTTを減らすために細胞の相対的な能力を計算する(%)各時点の平均光学密度を用いて、陰性対照と比較して、100%細胞生存率と考えられる。
- 細胞化学/細胞学
- 0.1 Mリン酸生理食塩水バッファーに4%(w/v)パラホルムアルデヒドを使用して、室温で25分間、腸および肝臓の同等物を固定します。オルガノイドをPBSバッファーで5回洗浄し、毎回10分間洗浄します。腸および肝臓等価物をテトラメチルrhodamineイソチオシアネート・ファロイジンまたはアレクサ・フルオール647ファロイジンで染色し、PBS31で1:50。
- 完全な凍結まで液体窒素に移す前に、RTで順応するために数分間OCT凍結培地に移します。肝スフェロイドは、クライオスタットを使用して、厚さ約10〜12μmの凍結切片を行います。
- DAPIを使用して、取り付け媒体に組織セクションをマウントします。共焦点蛍光顕微鏡法で調べてください。
- 固定後にオルガノイドを凍結し、確立されたプロトコルに従ってヘマトキシリン&エオシン染色を行います。上述のように組織をスライスした後に取り付け媒体でスライドを取り付け、光学顕微鏡を用いて組織学的画像を撮る。
- 高コンテンツ分析
- ミトコンドリアと細胞の核染色
- DMSOで凍結乾燥粉末を再構成して、1 mMミトコンドリア染色ストック溶液(例えば、ミトトラッカーディープレッドFM)を作ります。-20 °Cで、光から保護された貯蔵の在庫の解決。1 mM ミトコンドリア染色ストック液を、血清を含まない前温め(37°C)の組織培養培地で最終濃度(200 nM)に希釈します。
- 細胞培養培地を取り除きます。ミトコンドリア染色液を加えて、サンプルを完全に覆い、5%CO2の加湿雰囲気で37°Cで15〜45分間細胞をインキュベートします。
- ミトコンドリア染色作業溶液を慎重に取り除き、室温で15分間PBSで2〜4%パラホルムアルデヒド固定液に交換してください。
- 固い細胞をPBSで5分間やさしくすすめます。洗浄を2回繰り返します。
- 10mg/mL(16.23 M)の核酸染色ストック液を、100mgの極純水に100mgのHoechst 33342染料を溶解して調製します。
注:ストックソリューションは、-20°Cで光から保護され、保存する必要があります。 - PBSで0.2~2.0 μg/mL核酸染色作業溶液を調製し、固定された細胞を核酸染色作業溶液で室温で10分間インキュベートします。
- 核酸染色作業溶液を取り除き、PBSで細胞を5分間3回やさしくすすます。細胞は、光から保護された4°CでPBSに保管する必要があります。
- ミトコンドリアと核染色解析
- 核酸染色に適したフィルターセット(λEx/λEm:361/497 nm)とミトコンドリア染色(λEx/λEm:644/665nm)を用いて、蛍光顕微鏡を用いて細胞を解析します。核酸陽性染色で細胞を見つけ、細胞数を定量化します。ミトコンドリアの蛍光強度を定量化します。
- ミトコンドリアと細胞の核染色
- ImageJ におけるモルフォメトリック測定(回転楕円体計算)
- コロンバスソフトウェアから*.flexファイルとして高コンテンツ分析(HCA)画像をエクスポートします。バイオフォーマットプラグイン32を使用して ImageJ でグレースケールとして .flex ファイルをインポートする : ファイル > インポート > バイオフォーマット.
- [ インポート オプション] ウィンドウで、[ ハイパースタック 表示] を選択し、[別々のウィンドウに分割] の下の [チャネルの分割 ] を有効にします。このオプションは、特定のチャネル内のすべてのファイル(例えば、DAPI、ミトトラッカーなど)へのアクセスを許可します。[メモリ管理] の下の [ 仮想スタックを使用 する] を選択しないでください。
注:培養培地がUV波長(例えば405nm)で減少するとして、画像内で「ダスト」としてDAPIチャネルを使用することが好ましい。 - ピクセル サイズを調整する ([解析] > [スケールの設定] をクリック) は、.flex ファイルの埋め込み値に従って読み込まれません。ガウス ブラーフィルタを適用して、ノイズの超過を除去し、形状の輪郭の不規則性を回避します。プロセス > フィルター > ガウスブラー.2.0 ~ 3.0 の範囲のシグマ(半径)の値が高い場合は、ほとんどの場合に最適です。スタックに複数のイメージがある場合は、すべてのイメージに適用します(プロセススタックウィンドウで[はい]を選択)。
- しきい値を使用して背景とオルガノイド(オブジェクト)を分離するバイナリ画像を生成します。[ イメージ] > [調整] > [しきい値] をクリックします。赤いマスクを使用して、画像の強度に応じて値を調整し、オルガノイド形状にフィットし、形態をそのまま維持します。画像の背景が白い場合は 、背景の濃 さを無効にします。[ 適用] をクリックします。
- [ スタックをバイナリに変換] ウィンドウで、[ しきい値 ] メソッドを選択します。通常、 この 種の画像処理ではデフォルトまたは トライアングル が好ましい。 背景 を 暗くしてください。スタックに複数のイメージがある場合は 、[各イメージのしきい値を計算 ] を選択します。
- [プロセス]-[バイナリ]-[穴を埋める]を選択します。必要に応じて、背景から穴を削除します。プロセス> バイナリ /オプションs で黒の背景を選択し、穴を埋めるをもう一度実行します。次のステップに進む前に、黒の背景オプションを無効にします。
- オブジェクトを分離します。オルガノイドの場合、流域法は良い選択です。[ プロセス] > [バイナリ] > [流域] をクリックします。形状解析を実行します。
- [ 分析]-[計測値の設定] を選択します。いくつかのオプションが用意されています (詳細はhttps://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html)。オルガノイドの場合は、[ 面積]、[ 平均グレー値]、[ 最小と最大グレーの値 ]、および [形状記述子] を選択します。必要に応じて、[ ラベルの表示 ] を選択して、画像内のオブジェクトを識別し、 指数表記を選択します。 [OK] をクリックします。
- [ 解析]-[パーティクルの解析]を選択します。 [サイズ] と [円形] の制限を 選択します。イメージ内のすべてのオブジェクトを測定するには、それぞれ 0-無限大と 0.00~ 1.00 を保持します。[ 表示] で [ アウトライン ] を選択して、オブジェクトを識別します。 結果を出力する結果の表示 を有効にします。境界に接するオブジェクトを除外するには 、エッジを除外 します。 穴を含 めるので、オブジェクトの最終的な内部の穴がメイン シェイプの一部とみなされます。
- すべての画像スタックに対して 形状解析 を繰り返すと、結果は単一のテーブルに追加されます。[ ファイル] > [名前を付けて保存] の結果テーブルをコンマ区切り値 (.csv) ファイルとしてエクスポートします。
- リアルタイム PCR
- フェノールとグアニジンイソチオシアネートのモノファーシ溶液を使用して、組織の同等物からRNAを抽出します, メーカーの指示に従って.
- 1~ 2 μgの全RNAの逆転写によりcDNA合成を行います。
- 遺伝子特異的プライマー(表5)を用いて全ての標的を増幅し、リアルタイム定量PCRを行う。各qRT-PCRには、30ngの逆転写されたRNAと各プライマーの100 nMが含まれています。
- PCR条件に従ってください: 50 °C 3分間(1サイクル);95 °C 5分間(1サイクル)。95°Cを30秒間、59°Cで45秒間、72°Cで45秒(35~40サイクル)にします。
- サイプアッセイ
- 肝臓2-OCアセンブリのセクション2.2に従ってください。実験グループは、無細胞制御、APAP 2 μM処理、12時間、24時間、および車両制御です。APAP 2 μMの調製および治療のためのセクション3.3および4.2に従ってください。
注:すべてのサンプルがCYPアッセイのために同時に準備ができていることを確認するために、24時間の治療を開始してから12時間後に12時間の治療を開始します。CYP活性の無細胞制御を0.5%エタノール溶液と同様に車両制御で処理します。 - 3 mMの発光基質ストック溶液を室温で解凍し、ウィリアムのE S.で1:1000希釈を行います。
- スフェロイドを収集し、各実験グループを96ウェルプレートのウェルに移します。媒体を取り出し、1x DPBSの100 μLで2回洗浄し、ウェルあたり3μMの基板溶液を80 μL加えます。ウィリアムのE S培地で無細胞制御を保ちます。背景制御のための回転楕円体または基質解決なしで井戸を保存します。光から保護された37°Cで30〜60分間インキュベートします。
- エステル消去を伴う再構成バッファーを使用して、凍結乾燥したルシフェリン検出試薬(LDR)を平衡化します。渦巻きまたは反転によって混ぜます。次のステップまで、適切なボリュームを室温で保管します。
注意:再構成されたLDRは活動の損失なしで24時間または4 °Cで24時間または4 °Cで保存することができます。長期保管のため、–20°Cで保管してください。 - インキュベーション後、白い不透明な96ウェルマイクロプレートの3つの異なるウェルに無傷のスフェロイドの上澄み液の25 μLを移す。ウェルあたり25μLのLDRを加え、均質化します。
- 室温で白板を20分間インキュベートします。ルミノメーターの発光を読み取る。蛍光計は使用しないでください。
- テスト化合物処理値と未処理(車両制御)値からバックグラウンドルミネッセンス値(非細胞制御)を差し引いて、正味信号を計算します。正味処理値を正味未処理の値で割り、100 を掛けることで、CYP3A4 アクティビティの変化率を計算します。
- 肝臓2-OCアセンブリのセクション2.2に従ってください。実験グループは、無細胞制御、APAP 2 μM処理、12時間、24時間、および車両制御です。APAP 2 μMの調製および治療のためのセクション3.3および4.2に従ってください。
- ウェスタンブロッティング
- 特定された1.5 mLマイクロチューブに肝臓スフェロイドを移す。培地を取り出し、100 μLの1x DPBSで2回洗います。
- 4°Cで20分間、100μLの細胞リパバッファーで肝スフェロイドをリセートします。遠心分離機15分、4°C、11000rpm。上清を別の識別された1.5 mLマイクロチューブに移します。
- ブラッドフォード法を通じて得られるタンパク質の量を定量化します。グリギュラジポリアクリルアミドゲルのウェル当たり定量化された細胞ライセートから10~50μgのタンパク質を3~15%ロードし、SDS-PAGEを実行します。
- ゲルから0.22 μmのPVDF膜に、半乾式システム装置を介して、ロードしたタンパク質を移動させます。50 mM Tris-HCl および 192 mM グリシンのトランスファーソリューションを使用してください。転送するゲルの数に応じて機器パラメータを設定します(1~2回)。
- TBS-Tバッファー内の3〜5%スキムミルク溶液を有するPVDF膜上の非特異的相互作用をブロック:トリス緩衝生理食塩水(50 mM Tris pH 7.6、150 mM塩化ナトリウム)にTween 20の0.1%を補った。膜を室温で1時間静かに一定に揺れに保ちます。
- 室温で3~5分間静かに一定の揺れをしてTBS-Tで洗います。この洗浄手順を2回繰り返します。
- 希薄アルブミンおよびビンクリン一次抗体をTBS-T上でそれぞれ1:1000および1:2000にする。一次抗体を一晩4°Cで、穏やかに一定の揺れの下で膜をインキュベートします。
注:常に抗体を希釈するためにメーカーの指示に従ってください。 - 一次抗体を取り出し、膜を3回洗浄する(ステップ6.7.6)。T TBS-T上で1:5000にECL抗マウスIgG二次抗体を希釈する。室温で2時間穏やかに一定の揺れの下で二次抗体で膜をインキュベートします。
- 二次抗体を取り出し、膜を洗浄する(ステップ6.7.6)。ECLウェスタンブロッティング基質を用いてタンパク質検出を行います。30 s~30 分の自動電波フィルムを公開します。免疫ブロット検出を三重で行います。
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Representative Results
2-OC MPSでPKAPAP検査を行うために、第一のステップは、ヒトの腸および肝臓等価物(オルガノイド)を製造することです。それらはPK APAPのアッセイを開始する前に2-OCのマイクロ流体装置(図1A)24時間に統合される。翌日、メディアが変更され、モデルが APAP に公開されます。図1は、2-OC装置内に配置された腸および肝臓等価物(図1B)およびAPAP PK実験時間経過(図1C)を示す。MTTアッセイ、TEER測定、HCA、リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング、組織学、共焦点蛍光顕微鏡を2D培養および3Dオルガノイドで行い、組織の生存率を確認し、APAP毒性の可能性を検出しました。共焦点蛍光顕微鏡画像において、DAPIとファロイジンで染色された腸の同等のサンプル(それぞれ核およびアクチンについて)を非処理サンプル(図2A)および12μMAPAP処理試料に対する連続的な障壁として提示した(図2B)。図2Cに見られるように、MTTアッセイは、70%を超える相対的な細胞生存率を示し、12μM濃度33、34、35、36、37におけるAPAP曝露に応答して関連する細胞毒性効果の欠如を示した。陽性対照(100mM)は有意な細胞死(生存率5%未満)を誘発した。Caco-2/HT-29の生存率と適切な分化、ならびに腸の同等のバリア完全性は、分化期間中のTEERの進化によって検証された(図2D)。図 2Eに示すように、APAP は TEER 値に変更を生じませんでした。活性ナトリウム結合グルコーストランスポーターSLC5A1、多剤耐性トランスポーターMDR1およびナトリウムカリウムATPaseの発現を分析し、細胞障壁形成および基底機能に対するAPAP治療の影響を検証した。図2F–Hに示すように、非処置およびAPAP処置腸等価物の両方が、SLC5A1およびナカトパーゼの同様の発現を示している。12 μM APAP誘導の経口投与は、腸内のMDR1 mRNAレベルの増加を24時間後に示した(図2H)。また、核およびミトコンドリア質量含有量に対するフルオロフォア色素混合物による細胞のフェノチの変化のHCAを行った。陽性コントロールは100 mM APAPおよび1%NaOHであった。
さらに、12μM APAPが2D Caco-2/HT-29共培養に細胞毒性を誘導できるかどうかを分析した。 図2に 示す蛍光顕微鏡で得られた腸細胞画像はMTTデータを裏付け、12μM APAPがCaco-2/HT-29腸内の同等物に有意な細胞毒性を引き起こさなかったことを実証した。
2μM APAPに応答した肝スフェロイド基底生存率と細胞毒性の評価は、共焦点蛍光顕微鏡、H&E組織学、およびHCAアッセイによるMTTアッセイおよび形態学的分析によって行われた。図3Aに示すように、MTTアッセイは、静的および動的条件の両方で肝臓2-OCアセンブリから採取したサンプル中の2μm APA治療に応答して、関連する細胞毒性を特定することができなかった。細胞生存率は減少したが、12時間および24時間の両方のタイムポイント33、34、35、36、37の両方で80%以上のままでした。陽性対照治療(100 mM APAPおよび1%NaOH)は、重大な組織損傷(10%未満の生存率)を誘発した。顕微鏡共焦点画像は、肝スフェロイド中の壊死中心が基底またはAPAPの両方の治療条件に存在し、有意な死亡率の証拠がないことを示す(図3B-C)。しかし、2D HepaRG/HHSteC共存培養における車両または2μM APAP投与後の複数の細胞表現型変化をHCAアッセイを用いて分析したところ、MTTアッセイの結果と矛盾して100mM APAP(C+)を用いて、肝細胞は2μM APAP治療に対する初期の細胞毒性応答を実証した(24時間後、細胞数の減少、核領域およびミトコンドリア質量の増加があった。さらに、3D肝スフェロイドを染色するために、Hoechst 33342とMitoTrackerディープレッドを含むフルオロフォア色素カクテルを使用しました(図3J)。フィジーのソフトウェアは、いくつかのスフェロイドの間で3D球体アーキテクチャの均質性を評価するために使用されました(図3E–I)。図3Eに示す図は、全領域の肝スフェロイド間の類似性を示しています。アスペクト比(図3F)1の周りは、スフェロイドの菓子プロセス中のバイアスの欠如を意味する。また、この評価は、スフェロイドの大部分が丸みを帯びていたことも示した(図3G)。形態の周長と細胞分布の評価は、それぞれ円形(図3I)と固化計算(図3H)によって行われた。我々は、肝臓のスフェロイドを菓子化する方法論は、プロセス中に球形の成長、バイアス、または壊死と互換性のある滑らかな周囲を有するオルガノイドを生成したと結論付けた。
図4A-Bに示すように、肝臓スフェロイドは、それぞれ相対的な基底高レベルのアルブミンおよびGST mRNA発現を示し、適切な基底機能を示した。それにもかかわらず、24時間の2μM APAP治療はアルブミンおよびGST mRNA発現レベルの低下を誘発し、APAP治療の24時間時点における肝スフェロイドの機能的障害を示唆した。
CYP3A4およびUGT1A1 mRNA発現レベルの検出は、肝臓と同等の代謝能力を示す。CYP3A4 mRNA基底レベル(図4C)は、以前の報告6と一致していた。APAP治療は、APAP治療に応答してCYP3A4 mRNAおよびUGT1A1発現の両方の減少の傾向を誘導した(図4C-D)APAP治療の24時間時点で機能的に肝スフェロイドの障害の仮説を再び裏付けた。
さらに、アルブミンタンパク質発現を分析するためにウェスタンブロッティングおよびインビトロ酵素活性の実験を行い、同様に、基底およびAPAP治療条件における肝臓等価物におけるCYP 3A4活性を分析した。肝臓2-OC MPSで2μM APAP治療を行い、静的(図4E)および動的(図4F)条件の両方で12時間および24時間の時間点で肝同等の総アルブミン発現の減少を誘発することを発見した。一方、動的条件からの肝臓等価サンプルは、静的条件と比較してアルブミンのタンパク質発現の高レベルを提示する傾向を示した(図4G)。CYP 3A4 in vitroアッセイは肝臓2-OC MPSから肝臓同等物で行われ、12時間または24時間の2μM APAP治療が静的および動的条件の両方でCYP 3A4活性の堅牢かつ有意な障害を誘発することができることを示した(図4H-I)。さらに興味深いのは、培地フロー(動的)の存在が、肝臓当量が循環媒体の不在下で保持された条件(静的条件)と比較した場合に、CYP 3A4活性レベルの有意な改善を誘発した(図4J)。
HPLC分析に関する最も感度の高い分析条件を見つけるために、移動相の組成、種類、添加剤の濃度など、いくつかのパラメータを調べた。アセトニトリルはメタノールよりもクロマトグラム分解能と適切な保持時間を与えることがわかった。APAPの迅速かつ再現性分離は、C18逆相カラムを用いて得られた。APAP 保存時間 (Rt) の値は 9.27 ± 0.19 分でした。APAPの選択性は、ピークの形状と対称解像度、ならびにDMEMおよびウィリアムズ細胞培養培地からの干渉ピークの欠如によって示される。
DMEM SおよびウィリアムズE S細胞培養培地中のAPAP標準濃度は、0.25~100.00μMの範囲の酢酸アンモニウムバッファー(1:1,v/v)で希釈され、キャリブレーション曲線の構築に使用されました。この方法の直線性は、9濃度レベルで決定した。データは、表 2および表 3 に示されています。APAP濃度とピーク領域の関係は、y = 16106*x + 3579.8(R2 =1、DMEM培地)およびy=16397*x + 2475.1(R2=1、ウィリアムズ培地)の線形回帰式で表された。定量の上限(すなわち、100.00 μM)では、パーセント偏差とラン間変動率の値は2.50%未満でした。0.50 μM(LLOQ)を除く9濃度レベルの精度と精度は、DEVおよびC.V.値が7.00%未満の許容範囲内であった(表2および表3)。
分析方法は、4つの試験された濃度で、実行間および内部の精度と、バイオアナリシスアッセイのための一般的に受け入れられている基準の範囲内に収まった。この方法の再現性を、0.50(LLOQ)、4.50、45.00、90.00μMのAPAP品質管理サンプルの複製を分析して評価しました。ラン内および実行間の平均結果を 表 4に示します。アッセイの精度と精度は、DEV値≤15.00%、C.V.値がそれぞれ7.00%≤示しています。
LODは、信号対雑音比(S/N)が3より大きく、0.25 μM APAPに対応するサンプルとして決定されました。一方、LLOQは、0.50 μM APAPサンプルで推定され、S/N比を10に表示しました。さらに、精度値(DEV%)を見つけました。公称濃度値の19.00%≤内に及ぶ。C.V. ≤ 18.77% で示した、ラン内およびラン間の変動性を示しました(表 2、表 3、表 4)29,30に示すとおり。
APAP PK分析は、3つの異なる2-OC MPSアセンブリで行われました:1)腸2-OC、腸相当のみを含む。2)肝臓2-OC、肝臓のスフェロイドのみを含む 3) 腸/肝臓 2-OC 腸壁と肝スフェロイドの両方を有する。
吸収研究のために、経口経路は、腸に相当する頭道側に12μM APAPの投与によって模倣された。APAP濃度は、HPLC/UVによって測定され、培地サンプル中、静止条件および動的条件の両方で、腹端およびそば腸の同等の側から採取した。アピカル側およびバソララル側から採取された培地中のAPAP運動論は、腸モデルがAPAPを吸収できることを実証した。腸側側でAPAP濃度の増加に伴って補助側(図5A)に進行性APAP濃度低下があった(図5B)。培地中の最大濃度(Cmax)は、投与の12時間後(Tmax)の後、静的条件と動的条件の両方で約2μMであった。
代謝研究のために、静脈内投与は、肝臓コンパートメントの培地中に2μM APAPを適用することによって模倣された。静的条件と動的条件の両方の下でのメディア中のAPAP濃度動態は、動的条件でのみAPAP濃度の減少を検出することができ、2μM APAP投与後に0.87 μM APAP 12hに達することを示した(T1/2 = 12h)。肝臓当量は、静的条件下での代謝効率を最小限に抑えた(図5C)。APAP濃度はAPAP投与後12時間に1.7μMに達した。この統合された、APAP吸収および代謝評価のような全身性を腸/肝臓2-OCモデルで行った。APAPを腸の補助側に投与した等分を、経口経路にエミュレートする。培地サンプルは、両方の腸側および肝臓コンパートメントから収集した。 図5D は、静的条件と動的条件の両方で、aPAP濃度のアパピカル側における漸進的減衰を示す。
図5E は、識別可能な吸収および代謝相を示す。この流れは腸の吸収にも影響を与えた。培地中のAPAP Cmaxは、腸2-OCの2μM(図5B)アセンブリから動的「腸/肝臓2-OC」(図5E)の1.7μMに変化した。 図5F は、動的な「腸/肝臓2-OC」微生理学的システム(赤曲線およびy軸)におけるAPAPの濃度-時間プロファイルと、1000mg(黒色曲線およびy軸)の単回投与後にヒトで得られた代表的なプロファイルとの直接比較を示す。
図 1: 2-OC MPS における PK スタディのスケマティック ステップ コンパイルA)2-OC MPSの模式図、腸および肝ヒト組織等価物をボトムアップビューで示す。B)腸と肝臓の同等物を底面に統合した2-OC MPS写真を、代表的な光学顕微鏡画像で、ボトムアップビューで。C)組織等価物の調製のタイムライン、APAP治療、および培養培地コレクションの分相をオルガノイド製造のための、薬物動態および毒物学的評価この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腸の等価物の生存率と毒物学的評価A)細胞核とアクチンフィラメント蛍光色素(DAPIおよびファロイジン)で染色された非治療Caco-2/HT-29細胞の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像;63倍の倍率、ズーム2.6。B)12μM APAPで24時間処理したCaco-2/HT-29細胞の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像、核で染色し、アクチンフィラメント蛍光色素(DAPIおよびファロイジン)をそれぞれ染色する;63倍の倍率、ズーム2.6。C)腸は、静的および動的条件の両方におけるMTTアッセイによる生存率評価に相当する。グラフ内のバーで表される値は、車両制御 (0 と命名されたタイムポイント) * P<0.05 0 対処理に対するパーセント値です。D)分化の 21 日間の間の TEER の進化。*P<0.05 日 1 対他の日。E)APAP投与後のTEER値は、動的条件下で腸2-OC MPSに投与された。腸内の遺伝子発現は等価である。動的条件下での腸バリアの吸収電位および24時間の12μM APAPの可能性のある効果は、SLC5A1(F)、Na-K-ATPase(G)およびMDR1(H)発現により検証された。値は、3つの独立した実験の平均±SEMを表します。結果は、ハウスキーピングGAPDHに対する比率として表されます。*P<0.05車両対APAP。コロンバスによって行われるオペレッタ画像ベースHCA®2.4.0.ソフトウェア。12 μM APAP治療後の異なる時点における2D腸共培養の代表的な画像。陰性対照は、培地(0h)または車両(0.5%エタノール)であった。ここに示す肯定的な制御は100 mM APAPである。この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:肝臓等価物の生存率と毒物学的評価A)肝臓は、静的および動的条件の両方でMTTアッセイによる生存率評価に相当する。グラフ内のバーで表される値は、車両制御 (0 と名付けられた時間ポイント) *P<0.05 0 対処理に対するパーセント値です。B)車両から撮影したコンフォーカル画像と、内部から肝臓回転楕円体を2μMAPAP 24h処理した。C)車両から撮影したH&E(ヘマトキシリンおよびエオシン染色)画像と2μM APAP 24hは、内側のセクションから肝臓のスフェロイドを処理した。スケールバー= 50 μm D)2 μM APAP処理後の異なる時点における2D肝共培養の代表的な画像。これらの分析では、車両で2μM APAPで処理されたサンプルが考慮されました。フルオロフォア色素混合物には、核染色用のHoechstとミトコンドリア質量染色のためのミトトラッカーディープレッドが含まれる。陰性対照は、培地(0h)または車両(0.5%エタノール)であった。陽性制御は100 mM APAPであった。キャプチャされたスフェロイド画像全体の測定は、フィジーのソフトウェアを使用して行われました。E)領域F)アスペクト比の周波数分布、G)丸み、H)の固さ、I)の円形度。N = 85。*p < 0,05.J)LWD 10x目的を用いてオペレッタで獲得した3D肝スフェロイドの代表的な画像。この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:肝臓の生存率/機能性およびそれに対する静的および動的条件下での2μM APAPの可能性のある効果は、遺伝子およびタンパク質の発現および酵素活性によって検証された。アルブミン遺伝子発現。B)GSTA2遺伝子発現。第I相および第II相APAPを実施する肝臓能力および24時間の動的条件下での2μM APAPの可能性のある効果を、CYP3A4(C)の遺伝子発現とUGT1A1(D)によってそれぞれ検証した。E)静的条件下でのアルブミンタンパク質の総発現量。F)動的条件下でのアルブミンタンパク質の総発現量。条件。G)静的または動的条件下で栽培・処理した肝臓当量のアルブミン総発現の差を示す比較グラフ。H)CYP 3A4 in vitro酵素活性は静的条件下で行う。)CYP 3A4 in vitroの酵素活性を動的条件下で行う。J)静的または動的条件下で栽培・処理した肝臓当量におけるCYP 3A4活性の差異を示す比較グラフ。値は、3つの独立した実験の平均±SEMを表します。遺伝子発現のデータは、ハウスキーピングGAPDHに対する比率で表されます。タンパク質発現のデータは、ビンクリンタンパク質に対する比率として表される。*P<0.05車両対APAP処理。この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:2-OC MPSにおけるAPAP薬物動態の分析腸2-OC MPS製剤のアピカル側での12μM APAP投与後のAPAP吸収プロファイル。腸の障壁はCaco-2/HT-29細胞株の共培養から作られた(A)、ピカル側からの培地中の静的および動的APAP濃度(ヒト腸管腔側を表す)。.(B) バソラショナル側からの培地中の静的かつ動的なAPAP濃度 (ヒト腸血流側を表す)。*P<0.05 静的条件と動的条件。肝2-OC MPSの肝代謝プロファイルをヘパRG/HHSTeC肝スフェロイドによるC.2 μM APAP投与後の静的条件と動的条件の比較。*P<0.05 0h対6 h, 12 h, 24時間APAP治療.腸/肝臓2-OC MPS調製の腸バリア腹端に12μM投与後のAPAP吸収および代謝プロファイル。これは、口頭ルートをエミュレートします。腸の障壁は、Caco-2/HT-29細胞株と肝等価株HepaRG/HHSTeC細胞株のスフェロイドで作られたもので作られました。(D) 腸/肝臓 2-OC APAP の静的および動的条件下での腸の障壁の補助側の APAP 濃度.(E) 腸/肝臓 2-OC APAP 濃度は、静的および動的条件下での培地中で.*P<0.05 静的条件と動的条件。(F) 我々の微小生理学的系におけるAPAPの濃度-時間プロファイル(赤曲線およびy軸)と1000mgの経口投与後にヒトで得られた代表的なプロフィール(黒色の曲線およびy軸)との比較。データは、WebPlotDigitizer 4.2(https://automeris.io/WebPlotDigitizer)を使用してプロットから抽出されました。この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| HPLCシステム | ウォーターズアライアンス2695(ミルフォード、米国)、第四級ポンプ、サンプルマネージャーとデガッサーを装備 | ||
| 検出 器 | ウォーターズ 2996 Uv-Vis 210-400 nm レンジに設定 | ||
| システム制御、データ収集、処理 | ウォーターズエンパワー2002クロマトグラフィーソフトウェア | ||
| 列 | リバースフェーズルナC18 | ||
| (150 x 4.6 mm I.D.5mm粒径) | |||
| フェノメネックス | |||
| ガード列 | 逆相ルナC18(4 x 3 mm) | ||
| フェノメネックス | |||
| モバイルフェーズ | 溶媒 A- アセトニトリル | ||
| ソルベント B- 0.10 M酢酸アンモニウム、 pH 6.8 | |||
| アイソクラティック条件 | 時間 | A (%) | B (%) |
| (分) | |||
| 15 | 5 | 95 | |
| 流量 | 1.0 mL/分 | ||
| 注入容積 | 25 μL | ||
| 温度 | 25°C | ||
| APAP 検出 | UV @ 243 および 254 nm | ||
| 実行時間 | 15分 | ||
表1:培養培地マトリックス中のAPAPのHPLC-UV分析に使用される条件およびパラメータ。
| 名目濃度 | 計算されたAPAP濃度(μM) | 平均(μM) | S.D.b | C.V. | Dev | |||||
| (μM) | (各濃度の三重化) | (μM) | (%) | (%) | ||||||
| アッセイ番号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||
| 0.25 (LOD) | 0.02 | 0.08 | 0.21 | 0.14 | 0.08 | 0.27 | 0.13 | 0.11 | 84.96 | + 46.05 |
| 0.50 (LLOQ) | 0.31 | 0.36 | 0.29 | 0.47 | 0.42 | 0.65 | 0.41 | 0.05 | 12.72 | + 17.08 |
| 1.00 | 0.87 | 0.87 | 0.80 | 1.04 | 1.02 | 1.01 | 0.93 | 0.04 | 3.76 | + 6.65 |
| 2.50 | 2.44 | 2.61 | 2.52 | 2.42 | 2.56 | 2.54 | 2.52 | 0.04 | 1.54 | -0.62 |
| 5.00 | 5.02 | 4.99 | 5.06 | 5.01 | 5.01 | 5.05 | 5.02 | 0.09 | 1.88 | -0.45 |
| 10.00 | 10.21 | 10.13 | 9.96 | 10.25 | 10.08 | 10.21 | 10.14 | 0.10 | 0.97 | -1.41 |
| 25.00 | 25.33 | 25.28 | 25.20 | 25.13 | 25.14 | 24.92 | 25.17 | 0.36 | 1.45 | -0.67 |
| 50.00 | 50.30 | 50.04 | 50.51 | 49.70 | 49.98 | 49.19 | 49.95 | 0.86 | 1.71 | +0.09 |
| 100.00 | 99.75 | 99.90 | 99.70 | 100.09 | 99.97 | 100.40 | 99.97 | 0.69 | 0.69 | +0.03 |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 0.9999 | 1.00 | 1.00 | 0.9999 | ||||
表2:6つの別々のアッセイから0.10 M酢酸アンモニウムバッファー(1:1、v/v)を用いたDMEM培地の混合物で調製された標準曲線サンプルの精度、精度、および直線性。a
a線形曲線は、実験で説明されているように応答(APAP)対理論的濃度のデータに適合した。算出濃度は、検量線に対する各標準サンプルの応答を読み取った結果から導出された。各エントリ(アッセイ1-6)は三重分析の平均値に対応します。
bSD= 標準偏差。
cC.V. (変動の係数の精度)。
d精度 (DEV %) = 計算された濃度と公称値の偏差を示します。
この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。
| 名目濃度 | 計算されたAPAP濃度(μM) | 平均 | S.D.b | C.V. | Dev | ||||
| (μM) | (各濃度の三重化) | (μM) | (μM) | (%) | (%) | ||||
| アッセイ番号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||||
| 0.25 (LOD) | 0.34 | 0.12 | 0.30 | 0.16 | 0.00 | 0.18 | 0.08 | 45.46 | +26.03 |
| 0.50 (LLOQ) | 0.36 | 0.44 | 0.49 | 0.43 | 0.40 | 0.43 | 0.02 | 5.84 | +14.97 |
| 1.00 | 0.87 | 0.98 | 1.04 | 0.94 | 0.83 | 0.93 | 0.04 | 4.67 | +6.85 |
| 2.50 | 2.41 | 2.46 | 2.49 | 2.52 | 2.43 | 2.46 | 0.06 | 2.39 | +1.56 |
| 5.00 | 5.00 | 4.99 | 5.12 | 5.10 | 5.14 | 5.07 | 0.15 | 3.00 | -1.38 |
| 10.00 | 10.08 | 10.01 | 9.93 | 10.10 | 10.29 | 10.08 | 0.18 | 1.80 | -0.81 |
| 25.00 | 25.14 | 25.18 | 24.96 | 25.32 | 25.35 | 25.19 | 0.45 | 1.78 | -0.76 |
| 50.00 | 50.19 | 50.23 | 49.83 | 49.56 | 50.17 | 49.99 | 0.87 | 1.75 | +0.01 |
| 100.00 | 99.87 | 99.84 | 100.10 | 100.13 | 99.80 | 99.95 | 2.12 | 2.12 | +0.05 |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | ||||
表3:6つの別々のアッセイから0.10 M酢酸アンモニウムバッファー(1:1、v/v)を持つウィリアムズ培地の混合物で調製された標準曲線サンプルの精度、精度、および直線性の相互実行変動。a
a線形曲線は、実験で説明されているように応答(APAP)対理論的濃度のデータに適合した。算出濃度は、較正曲線に対する各標準サンプルの応答を読み取った結果から導出された。各エントリ(アッセイ1-5)は三重分析の平均値に対応する。
bSD= 標準偏差。
cC.V. (変動の係数の精度)。
d精度 (DEV %) = 計算された濃度と公称値の偏差を示します。
この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。
| ウィリアムズ培地 | 名目濃度 | 測定濃度 | S.D. | C.V. | Dev |
| (μM) | (μM) | (μM) | (%) | (%) | |
| イントララン (n=3) | 0.50 (LLOQ) | 0.49 | 0.08 | 15.55 | +1.77 |
| 4.50 | 4.59 | 0.23 | 5.10 | -2.06 | |
| 45.00 | 41.23 | 0.76 | 1.85 | +8.37 | |
| 90.00 | 82.29 | 1.75 | 2.13 | +8.57 | |
| インターラン (n=15) | 0.50 (LLOQ) | 0.43 | 0.05 | 10.99 | +14.97 |
| 4.50 | 4.37 | 0.19 | 4.42 | +2.99 | |
| 45.00 | 42.35 | 0.82 | 1.93 | +5.88 | |
| 90.00 | 85.22 | 2.25 | 2.65 | +5.31 | |
| DMEMメディア | 名目濃度 | 測定濃度 | S.D. | C.V. | Dev |
| (μM) | (μM) | (μM) | (%) | (%) | |
| イントララン (n=3) | 0.50 (LLOQ) | 0.47 | 0.09 | 18.77 | +6.35 |
| 4.50 | 4.45 | 0.30 | 6.63 | +1.04 | |
| 45.00 | 44.24 | 1.59 | 3.58 | +1.69 | |
| 90.00 | 86.40 | 4.09 | 4.73 | +4.00 | |
| インターラン (n=12) | 0.50 (LLOQ) | 0.46 | 0.08 | 17.81 | +7.75 |
| 4.50 | 5.16 | 0.27 | 5.31 | -14.68 | |
| 45.00 | 48.99 | 2.10 | 4.29 | -8.86 | |
| 90.00 | 96.18 | 4.47 | 4.65 | -6.86 | |
表 4: 品質管理サンプルにおける APAP のイントラおよびインターラン精度 a
aデータは平均として表示されます。SD (標準偏差)。C.V. (変動の係数の精度) と精度 (パーセント偏差.開発%)。
この図はマリンらから修正された。腸/肝臓の微生理学的システムにおけるアセトアミノフェンの吸収と代謝ケムバイオルインターアクト.299、59-76(2019)。
| プライマー(5' → 3') | |||||
| 組織 | 遺伝子 | 転送 | 逆 | ||
| 腸 | SGLT1/SLC5A1 | アググマグルカアクトゥトゥアッサック | カグクトッカアカチャガガツグト | ||
| NA-K-アパーゼ | アクグクアッヒアガアアタカアアック | CAgCggTCATCCCAgTCC | |||
| MDR1 | TggATTTCcggTTTGgAg | TgTggCTgTATTTTgg | |||
| 肝臓 | アルブミン | TgCAAggCTATAAg | TTTAgAgggTgTggCTTTACAC | ||
| GSTA2 | CTgAggAACAAgAGC | アグアグガグアアグックッガガアアターアグ | |||
| CPY3A4 | ジャグガッグガッラガアアクツク | タックグ・コッカトゥッハッテク・トゥガツ | |||
| UGT1A1 | アトッカアグ・CgCATggAC | ダグトックTTTGTgAAggCTggAg | |||
表5:腸および肝臓組織の2-OC培養におけるmRNAレベルでの遺伝子転写を評価するリアルタイムqPCRプライマー
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Discussion
次の開発ステップでリスクを低減するためには、調査用新薬の薬理学的特性の正確かつ信頼性の高い評価が不可欠です。MPSは比較的新しい技術であり、予測力を向上させ、前臨床試験に費やすコストと時間を削減することを目的としています。私たちのグループは、主に鉛最適化に必要な薬物動態および毒物学的特性の評価を進めています。私たちは、2つの部屋を持つ2-OCマイクロ流体デバイスと協力して、2つのオルガノイドの統合を可能にしました。APAPは、高品質の人間のデータをたくさん持っているので選ばれました, 主に肝臓によって代謝されています, また、肝毒性特性を表示します.研究プロトコルは、薬物がボランティアに経口投与されるヒト第I相臨床試験のいくつかのステップをエミュレートすることを目的とし、薬物動態特性を知るために薬物の濃度を評価するために定期的な血液サンプルを採取し、生化学的および臨床的パラメータを収集して安全性と耐容性を評価する。したがって、MPS が十分に進化して信頼性の高い予測を提供できる場合、第 1 段階の試行で障害が発生するリスクが大幅に軽減されます。将来的に疾患モデルを追加することにより、同じ仮定がフェーズIIおよびIII臨床試験にも適用される可能性があります。
すべての研究は、腸2-OC(APAP経口投与)、肝臓2-OC(静脈内投与)、腸/肝臓2-OC(経口投与)の3つのモデルで行われた。第1のモデルは吸収を単離し、第2の代謝、そして第3のモデルは両方を統合した。我々は、まずオルガノイドを製造し、マイクロ流体装置に組み込み、2番目にAPAPを投与し、培地サンプルを採取し、最後に細胞の生存率と機能性およびAPAP暴露の毒物学的影響を評価するための一連の試験を行った。薬物動態学的研究のために、我々は、培地中のAPAP定量のためのクロマトグラフィー法を開発し、検証した。この検証は、特異性、線形性、定量限界(LOQ)、検出限界(LOD)、マトリックス効果、精度、精度に関するバイオアナリシス法検証に関するガイドラインに準拠し、FDA29,30で概説した。特異性は、2つの異なるソースからのブランク、プール、および個々の生物学的サンプルで確立された。この方法は分析中に許容可能に行われ、データはAPAPを分離し定量化する単純なアイソクラティック移動相の能力を確認した。
腸および肝オルガノイドの生存率/機能的には、異なる技術によって評価された。腸に相当する、共焦点蛍光顕微鏡(図2A-B)、MTTアッセイ(図2C)、遺伝子発現評価(図2D-F)またはHCA実験では、APAP曝露後の毒性24時間を検出しなかった。同様に、MTTアッセイは、APAPが肝臓等価物に誘導する毒性侮辱を検出しなかった(図3A)。しかし、HCA技術は、肝細胞に対する非常に初期の毒性事象(APAP曝露後24時間)の検出の可能性を追加し、細胞の現象変化を観察することによって、いくつかの機械的な手がかりを有する(図3D)。一方、共焦点蛍光顕微鏡(図3B)および組織学(図3C)は、ヒト組織の同等物の生存状態の調査において有用な補完的なツールであることが示された。肝細胞に対しては、異なる技術の同時使用は非常に有利であった。MTTアッセイは、前述のように、APAP曝露後にHCA24hによって検出されたAPAP細胞傷害性を検出できなかった。遺伝子発現解析では、APAP治療後の基底と24時間後の両方で、腸の機能を評価しました(図2D-F)と肝オルガノイド(図4A-D)。.基礎条件下では、腸および肝臓特異的マーカーの正常なレベルがあり、適切な機能性を示唆した。APAP曝露の24時間後、アルブミン、GST mRNAレベルのダウンレギュレーション、および肝臓等価組織におけるCYP3A4遺伝子発現を低下させる傾向があり、APAP早期細胞毒性を示す。これらの知見を裏付け、ウェスタンブロッティング実験は、APAP処置に応答した肝臓総アルブミンタンパク質発現の減少もまた、APAPへの暴露によって肝組織に課される毒性侮辱を確認することを示した。従って、インビトロ酵素活性の実験は、APAP治療によって誘導されるCYP 3A4活性レベルの、肝臓等価物における堅牢かつ進行的な減少を示した(図4H-I)。
オルガノイドの形態測定統計は、画像J(図3E-I)で行った。この領域は、2Dサイズが分析されたすべてのオルガノイドにどれだけ近いかを明らかにし、このプロトコルで標準化として使用して公平な結果を生み出すことができる。「形状記述子」は、形状形態に正確に対応する統計を明らかにします。アスペクト比は主軸と短軸を用いた指標であり、1の周りの結果はオルガノイド形成中に偏り(すなわち、優先的な成長)を示さないことを示す。丸み (4 ×[area]/ (π × [長軸]2)の値は、主軸として明らかにされる優先的な成長に非常に敏感です。固体性([面積]/[凸面領域]))は、凸面積(=エンベロープ)を使用するため、国境の不規則性の影響を受けないため、総形態を示す上で不可欠です。1.0を中心とした分布は、推定球面成長を示しています。逆に、円周(4× π[面積]/[周囲]2)は複雑な境界に対して非常に敏感であるため、「空洞」または「ポケット」はこのインデックスに影響を与えます。したがって、1の周りの円形はまた、適切なオルガノイド機能と互換性のある推定球成長を裏付ける。
分析結果は、MPSがAPAP吸収および代謝特性をエミュレートできることを示し、排泄相なしで生体内で産生されるものと同等の曲線(図5F)で単離または統合された。APAP吸収は、経口投与後、腸管MPSまたは腸/肝臓MPSモデルの両方に類似しており、静的および動的条件下で(図5A-B、図5D-E)。両方とも、バソラテラ側での増加に付随する補助側でAPAP濃度が低下し、静的および動的条件に有意な差はなかった。これに対し、APAP肝代謝はこれらの条件下で異なった。MPSの循環媒体は、オルガノイド代謝能力を向上させるように見えた(図5Cおよび図5E)。流れなしでは見られない有意なAPAP崩壊アンダーフローがあった。興味深いことに、in vitroのCYP3A4活性実験は、システム内の流れの存在がヒト肝臓等価物の機能性を増大させるという仮説を裏付ける。図4Jのグラフに示すように、CYP 3A4の活性は、基底およびAPAP治療条件の両方で流動下で維持される肝臓等価物において有意に高かった。同様に、肝臓等価物は、フロー下(動的)の下で維持され、ベースラインまたはAPAP処理条件の両方でフロー(静的)を保持しないものと比較してアルブミンのタンパク質発現を増加させる傾向を示した(図4G)。
ヒトに対するAPAPの経口投与後の濃度時間プロファイルと比較すると、我々の微小生理学的システムは、はるかに大きなt1/2( 半減期)を示す(図5F)。これは、前述のように、薬物を吸収して代謝することができる腸および肝臓等価物を有する2臓器系を有する一方で、血漿区画38からAPAPおよびその代謝産物を排泄することに相当する腎臓がないために起こる。それに加えて、微小生理学的システムは、ヒトに対して通常観察されるものよりも小さいCmax(ピーク血漿濃度)およびより大きなtmax(Cmaxに到達するまでの時間)を示す(図5F)。これは、インビトロおよびインビボ実験の規模の違いの結果である。全体として、マイクロ生理学的システムを用いて得られた濃度-時間プロファイルと、APAPの経口投与後に得られたプロファイルとの間には、大きなt1/2、より小さいCmax、 およびより大きなtmax の3つの大きな違いがあります(図5F)。より大きなt1/2 は、APAPを排泄することと同等の腎臓とその代謝産物が血漿中に相当するものがないためであるが、より小さいCmax およびより大きなtmax は、人体と比較した場合の実験の小規模の結果である。マイクロ生理学的システムの構築と運用に最適なスケーリング戦略は、依然として研究の活発な領域であり、単一のアプローチがすべてのシステム39に最適であるとは考えにくい。さらに、数学的モデリングまたは機械学習を用いて、マイクロ生理学的システムで得られたインビトロデータをヒト40で観察された生体内行動に推定するために、補正を適用したり、マイクロスケールからフルスケールへのマッピングを学習したりすることができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
クリスティ・グゲン=ギロウゾ博士、522号機INSERMのフィリップ・グリポン博士、インセルム271号機271 INSERMのクリスチャン・トレポ博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
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