Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

We stelden een microfysiologisch systeem (MPS) met darm- en leverorganoïden bloot aan paracetamol (APAP). Dit artikel beschrijft de methoden voor organoïde productie en APAP farmacokinetische en toxicologische eigendomsbeoordelingen in de MPS. Het beschrijft ook de weefselfunctionaliteitsanalyses die nodig zijn om de resultaten te valideren.

Abstract

De onlangs geïntroduceerde microfysiologische systemen (MPS) cultiveren menselijke organoïden zullen naar verwachting beter presteren dan dieren in de preklinische tests fase van het geneesmiddel ontwikkelen proces, omdat ze genetisch menselijk en recapituleren het samenspel tussen weefsels. In deze studie werden de menselijke darmbarrière (geëmuleerd door een co-cultuur van Caco-2- en HT-29-cellen) en het leverequivalent (geëmuleerd door sferoïden gemaakt van gedifferentieerde HepaRG-cellen en menselijke lever stellatische cellen) geïntegreerd in een twee-orgaanchip (2-OC) microfluïde apparaat om wat paracetamol (APAP) farmacokinetische (PK) en toxische eigenschappen te beoordelen. De MPS had drie samenstellingen: Darm slechts 2-OC, Lever slechts 2-OC, en Darm/Lever 2-OC met de zelfde media die beide organoïden doordringen. Voor PK-beoordelingen hebben we de APAP in de media gesedisd op vooraf ingestelde tijdpunten na toediening over de darmbarrière (het emuleren van de orale route) of in de media (het emuleren van de intraveneuze route), op respectievelijk 12 μM en 2 μM. De mediamonsters werden geanalyseerd door reversed-phase hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC). Organoïden werden geanalyseerd voor genexpressie, voor TEER-waarden, voor eiwitexpressie en -activiteit, en vervolgens verzameld, vastgesteld en onderworpen aan een reeks morfologische evaluaties. De MTT-techniek presteerde goed bij het beoordelen van de levensvatbaarheid van de organoïden, maar de hoge gehalteanalyses (HCA) konden zeer vroege toxische voorvallen detecteren in reactie op apap-behandeling. We hebben geverifieerd dat de mediastroom de APAP-absorptie niet significant beïnvloedt, terwijl de leverequivalente functionaliteit aanzienlijk verbetert. De APAP menselijke darmabsorptie en leverstofwisseling kan worden geëmuleerd in de MPS. Het verband tussen MPS-gegevens en in silico-modellering heeft een groot potentieel om de voorspelbaarheid van de in vitro-methoden te verbeteren en een betere nauwkeurigheid te bieden dan diermodellen in farmacokinetische en toxicologische studies.

Introduction

Als gevolg van genomische en proteomische verschillen, dier modellen hebben beperkte voorspellende waarde voor verschillende menselijke resultaten. Bovendien zijn ze tijdrovend, duur en ethisch twijfelachtig1. MPS is een relatief nieuwe technologie die gericht is op het verbeteren van de voorspellende kracht en het verminderen van de kosten en tijd besteed aan pre-klinische tests. Het zijn microfluidische apparaten die organoïden (kunstmatige mimetiek functionele eenheden van organen) cultiveren onder mediastroom die organoïde-organoïde communicatie bevordert. Organoïden gemaakt van menselijke cellen verhogen de relevantie van de vertaling2,3,4. MPS zal naar verwachting beter presteren dan de dierproeven omdat ze genetisch menselijk zijn en het samenspel tussen weefsels samenvatten. Wanneer het volledig functioneel is, zal de MPS zinvollere resultaten opleveren, met hogere snelheid en lagere kosten en risico's4. Veel groepen ontwikkelen MPS voor verschillende doeleinden, met name ziektemodellen om de werkzaamheid van geneesmiddelen te testen.

Blootstellingsniveau is een van de meest kritieke parameters voor de evaluatie van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen5,6,7,8,9,10,11,12. MPS maakt organoïde integratie die systemische blootstelling emuleert en zal naar verwachting beter presteren dan de traditionele 2D menselijke weefsel cultuur. Deze technologie kan de voorspelling van samengestelde darmabsorptie en levermetabolisme4aanzienlijk verbeteren.

Een MPS integratie van menselijk gelijkwaardig model van darm en lever is een goed uitgangspunt, gezien de centrale rol van deze twee organen in de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen en systemische blootstelling13,14,15. APAP is een aantrekkelijk medicijn voor het bestuderen van een MPS zonder nierequivalent omdat de metabolisatie voornamelijk wordt gedaan door de lever16,17.

De 2-OC is een tweekamermicrofluïdisch apparaat dat geschikt is voor de cultuur van twee verschillende menselijke equivalente weefsels/organoïden met elkaar verbonden door microkanalen16. Om een in vitro human orale/intraveneuze toediening van een geneesmiddel na te bootsen en de effecten van de kruisspraak tussen de darm- en leverequivalenten op APAP-farmacokinetiek te beoordelen, naast de organoïden functionaliteit en levensvatbaarheid, drie verschillende MPS assemblages werden uitgevoerd: (1) een "Darm 2-OC MPS" bestaat uit een darm equivalent gebaseerd op een cultuur insert met een Caco-2 + HT-29 cellen cocultuur, geïntegreerd in de 2-OC apparaat; (2) een "Liver 2-OC MPS" bestaande uit leversferoïden van HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) geïntegreerd in het 2-OC apparaat; en (3) een "Darm/Lever 2-OC MPS" bestaande uit het darmequivalent in het ene apparaatcompartiment dat communiceert met het leverequivalent in het andere door de mediastroom door de microfluïde kanalen.

Alle tests werden uitgevoerd onder statische (geen stroom) en dynamische (met stroom) omstandigheden als gevolg van de impact van de mechanische stimuli (compressie, stretching, en schuintrekken) op de levensvatbaarheid van de cel en functionaliteiten18,19,20. Het onderhavige artikel beschrijft het protocol voor APAP orale/intraveneuze toedieningsmultiulatie en de respectievelijke absorptie/stofwisseling en toxicologische analyses in de 2-OC MPS met menselijke darm- en leverequivalentenmodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Productie van weefselequivalenten voor de teelt in de 2-OC

  1. De gelijkwaardige productie van de dunne darmbarrière
    1. Onderhouden Caco-2 en HT-29 cellen met behulp van de darm equivalent medium: DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline en streptomycine, en 1% niet-essentiële aminozuren, die wordt genoemd als "DMEM S" in dit manuscript.
    2. Verwijder het medium, was twee maal met 1x DPBS en voeg 8 mL van 0,25% Trypsin/EDTA toe om Caco-2 cellen te scheiden die in celkweekkolven worden gekweekt (175 cm2). Incubeer gedurende 5 min bij 37 °C en stop de reactie door ten minste het dubbele volume van de trypsineremmer toe te voegen. Voer dezelfde procedure uit voor HT-29-cellen, waarbij de reagensvolumes worden aangepast omdat een kleinere hoeveelheid van deze cellen nodig is en ze worden gehandhaafd in kleinere kolven (75 cm2).
    3. Centrifuge op 250 x g gedurende 5 min, verwijder de supernatant uit beide buizen, en resuspend de cel pellets in 10 mL van DMEM S. Tel cellen, het waarborgen van een cel levensvatbaarheid hoger dan 80%. Aseptically integreren celcultuur inserts in een 24-put plaat eerder gevuld met 400 μL van DMEM S per goed in de basolaterale kant (die de menselijke bloedbaan vertegenwoordigt).
    4. Co-cultiveren Caco-2 en HT-29 cellen met een verhouding van 9:121. Gebruik 2,25 x 105 Caco-2 en 2,5 x 104 HT-29 cellen aan elk darmequivalent in een eindvolume van 200 μL DMEM S. Pas celnummers en -volume aan op basis van het gewenste aantal organoïden. Meng voorzichtig.
    5. Pipette 200 μL celoplossing in de apicale kant van elke insert (die de menselijke darmlumenzijde vertegenwoordigt), die 250.000 cellen per insert zaait. Co-cultiveren van de cellen in de inserts gedurende drie weken22. Verander het medium ten minste drie keer per week, aspirating het van zowel de apicale en basolaterale zijden met een steriele Pasteur pipet, waarbij zorg ervoor dat de intacte celbarrière niet beschadigen.
      OPMERKING: Ga verder met de aspiratie aan de apicale kant, om de celbarrière niet aan te raken (aanzuigen door de Pasteur pipet op de plastic rand van de cel insert te ondersteunen).
    6. Controleer de strakke monolaagvorming door de TEER (transepithelial electrical resistance) om de drie dagen te meten met behulp van een voltmeter23, volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Voer een lege, het meten van de weerstand over een cel cultuur insert zonder cellen, maar met dezelfde cel medium en op dezelfde celplaat.
      2. Bereken de weefselweerstand door de blancoweerstand af te trekken van de weefselequivalentweerstand en vermenigvuldig met het effectieve oppervlak van het filtermembraan (0,6 cm2). Een goede darmbarrièreweerstand bedraagt 150 tot 400 Ω·cm2.
        OPMERKING: Na 21 dagen moeten de cellen volledig gedifferentieerd zijn en de darmbarrière gevormd, zodat de darmequivalenten klaar zijn om in MPS te worden geïntegreerd.
  2. Leverequivalenten productie
    1. Onderhouden HepaRG cellen met behulp van de lever equivalent medium, dat is William's Medium E aangevuld met 10% foetale runder serum, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / mL penicilline, 100 μg / mL streptomycine, 5 μg / mL menselijke insuline en 5 x 10-5 M hydrocortison, en heet "Williams E S" in dit manuscript. Vernieuwen HepaRG media elke 2-3 dagen en handhaven celcultuur voor twee weken om de differentiatie in hepatocyten en cholangiocyten te starten.
    2. Voeg na de eerste twee weken 2% DMSO toe aan het medium van HepaRG voor nog eens twee weken om de celdifferentiatie24,25te voltooien . Grow HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), met behulp van poly-L-lysine-gecoate celkweekkolven, veranderende media om de twee of drie dagen.
    3. Verwijder het medium, was twee maal met 1x DPBS en voeg 8 mL van 0,05% Trypsin/EDTA toe om HepaRG-cellen te scheiden die in celkweekkolven worden gekweekt (175 cm2). Incubeer gedurende 5 tot 10 min bij 37 °C en stop de reactie door het volume van de trypsineremmer minstens het dubbele toe te voegen. Voer hetzelfde uit voor HHSTeC, het aanpassen van het reagensvolume omdat een kleinere hoeveelheid van deze cellen nodig is en ze kunnen worden onderhouden in kleinere kolven (75 cm2).
    4. Centrifuge zowel op 250 x g gedurende 5 min, verwijder de supernatant en resuspend de cel pellets in Williams E S medium. Tel cellen, het verzekeren van een cel levensvatbaarheid hoger dan 80%.
    5. Genereer de leversferoïden die HepaRG- en HHSTeC-cellen combineren met een verhouding van respectievelijk 24:1 in Williams E S medium16. Voeg 4,8 x 104 gedifferentieerde HepaRG en 0,2 x 104 HHSTeC toe om elke leversferoïde van 50.000 cellen samen te stellen, in een volume van 80 μL. Pas celnummers en -volume aan op basis van het gewenste aantal sferoïden. Meng voorzichtig.
    6. Met behulp van een multichannel pipet, afzien van 80 μL van de gecombineerde cel pool in elke put van 384 sferoïde microplaten, die ronde goed-bodem geometrie heeft.
      OPMERKING: Na vier dagen worden sferoïden van ongeveer 300 μm gevormd.
    7. Met behulp van wide-bore tips, breng de lever sferoïden naar ultra-low-attachment 6 goed platen, die het mogelijk maakt de vereiste "een-voor-een" tellen.

2. Integratie van darm- en leverequivalenten in een 2-OC MPS

  1. Darm 2-OC MPS assemblage voor absorptietest
    1. Pipette 500 μL DMEM S in het grotere compartiment van 2-OC en 300 μL in de kleinere. Aspirate de basolaterale en apicale media van elke darmbarrière equivalent in de 24 goed platen. Met behulp van steriele tangen, integreren een insert per 2-OC circuit, met name in het grotere compartiment. Breng 200 μL van het darmmedium aan de apicale kant aan.
      OPMERKING: Vermijd de vorming van bellen bij de integratie van de organoïden in de MPS.
    2. Sluit de MPS aan op de besturingseenheid, die moet worden aangesloten op een luchttoevoer onder druk. Stel de parameters: een druk van ongeveer ±300 bar en een pompfrequentie van 0,3 Hz. Start de stroom 24 uur voor de toediening van de teststof. De volgende dag voert u de APAP-behandeling uit.
  2. Lever 2-OC MPS assemblage voor metabolisme test
    1. Pipette 650 μL van Williams E S in het grote compartiment en 350 μL in het kleinere compartiment, dat de sferoïden zal ontvangen. In de ultra-lage bevestiging 6 goed platen, tel de sferoïden met behulp van wide-bore tips. Elk leverequivalent bestaat uit twintig sferoïden26. Integreer twintig leverequivalenten per circuit, met behulp van brede-boring tips, die de overdracht van organoïden alleen mogelijk maakt, in het kleinere compartiment van een 2-OC.
    2. Sluit de MPS aan op de besturingseenheid, die moet worden aangesloten op een luchttoevoer onder druk. Stel de parameters: een druk van ongeveer ±300 bar en een pompfrequentie van 0,3 Hz. Start de stroom 24 uur voor de toediening van de teststof. De volgende dag voert u de APAP-behandeling uit.
  3. Darm/Lever 2-OC MPS assemblage voor absorptie en metabolisme test
    1. Combineer de twee media (darm en lever) in een 1:4 verhouding, wat betekent 200 μL DMEM S in de darm apicale kant en 800 μL van Williams E S in de basolaterale kant. Integreer darm- en leverequivalenten tegelijkertijd in de 2-OC.
    2. Sluit de MPS aan op de besturingseenheid, die moet worden aangesloten op een luchttoevoer onder druk. Stel de parameters: een druk van ongeveer ±300 bar en een pompfrequentie van 0,3 Hz. Start de stroom 24 uur voor de toediening van de teststof. De volgende dag voert u de APAP-behandeling uit.
      OPMERKING: Voer voor alle experimenten elk keer punt in drievoud uit, wat betekent dat drie gescheiden 2-OC-circuits (d.w.z. 1 en 1/2 2-OC-apparaten). Het totale volume van elke 2-OC circuits is 1 mL.

3. Paracetamol (APAP) voorbereiding

  1. Bereid de APAP voorraadoplossing voor en los APAP op in absolute ethanol. Op de dag van het experiment verdunt APAP in het respectievelijke medium (APAP-oplossing), tot een concentratie van 12 μM voor "orale toediening" en 2 μM voor "intraveneuze toediening".
  2. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie ethanol in de voertuigcontrole- en behandelingsoplossing 0,5% bedraagt voor beide overheidsdiensten. Voor de positieve controle (100 mM APAP) bedraagt de ethanolconcentratie 2%.

4. Toediening van de teststof en bemonstering van media

  1. APAP "orale" administratie en mediabemonstering
    1. Aspirate de basolaterale en apicale media van elk darmbarrière-equivalent in de 2-OC. Pipet 500 μL van het juiste kweekmedium in het grote compartiment aan de organoïde basolaterale kant en 300 μL in het kleine compartiment.
    2. Controleer op bellen en ga verder met de darmbarrière gelijkwaardige behandeling met de teststof in de apicale kant, emuleren orale toediening. Emuleer APAP "orale" toediening door 200 μL van een 12 μM APAP-oplossing toe te voegen aan de apicale kant van de darmcultuurinserts, die de darmzijde van het lumen vertegenwoordigt (Figuur 1B). Sluit de MPS aan op de besturingseenheid.
    3. Verzamel het totale volume van apicale en van basolaterale kanten op de volgende tijdstippen: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, en 24 h15,27. Voer alle experimenten uit in drievoud, onder statische en dynamische omstandigheden, en verzamel elk monster, van elk drievoud, in een aparte microtube. Analyseer de monsters met behulp van HPLC/UV.
      OPMERKING: Afzonderlijke apicale en basolaterale monsters.
  2. APAP "intraveneuze" administratie en mediabemonstering
    1. Emuleer de "intraveneuze" route door 2 μM APAP-oplossing rechtstreeks in het levercompartiment toe te dienen. Aspirate alle 2-OC medium content. Pipette 650 μL Williams E S met de teststof in het grote compartiment en 350 μL van hetzelfde medium in het kleinere compartiment dat de 20 sferoïden bevat. Verzamel alle volumes op de volgende tijdstipen: 0 uur, 30 min, 1 uur, 2 uur, 3 uur, 6 uur, 12 uur en 24 uur27,28.
    2. Voer alle experimenten uit in drievoud, onder statische en dynamische omstandigheden. Verzamel elk monster, van elk drievoud, in een aparte microbuis. Analyseer de monsters met behulp van HPLC/UV.

5. Instrumentatie en chromatografische omstandigheden

  1. HPLC-analyse
    1. Stel alle relevante parameters voor de HPLC-analyse in volgens tabel 1.
    2. Filtreer de mobiele fase door een membraanfilter van 0,45 μm onder vacuüm. Filtreer de monsters door een 0,22 μm porie grootte PVDF spuitfilter (diameter 13 mm) en bewaar ze in een flacon. Start de meting.
  2. Stockoplossingen, kalibratienormen en QC-monsters (Quality Control)
    1. Bereid 10 mM APAP-voorraadoplossingen voor in ammoniumacetaatbuffer (100 mM, pH 6.8) en verdun verder met DMEM S- en Williams E S-celkweekmedia verdund met ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) om de werkoplossingen te bereiken variërend van 0,25 tot 100,00 μM.
    2. Neem een set kalibratiemonsters op in drievoud en kwaliteitscontrolemonsters op vier niveaus in drievoud. Bereid deze normen door seriële verdunning.
    3. Maak kalibratiecurven van APAP-piekgebieden versus APAP nominale standaardconcentraties. Bepaal de lineaire regressie die geschikt is voor elke kalibratiecurve. Evalueer de goedheid van verschillende kalibratiemodellen aan de hand van visuele inspectie, correlatiecoëfficiënt, intra- en inter-run nauwkeurigheid en precisiewaarden.
    4. Injecteer lege monsters van DMEM S en Williams E S media verdund in ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) in sextuplicaat. Bereid drievouden van kwaliteitscontrolemonsters in DMEM S en Williams E S-media die zijn verdund met ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) voor de APAP-concentraties van 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 en 90,00 μM.
    5. Zorg ervoor dat de kwaliteitscontrolemonsters worden bereid vanuit een nieuwe voorraadoplossing, anders dan die voor het genereren van een standaardcurve. Gebruik kwaliteitscontrolemonsters om intra- en inter-run variaties te onderzoeken.
  3. Validatieprocedures
    1. Voer de validatie van de bioanalytische methode uit volgens de eerder gerapporteerde procedures29,30. Voer de chromatografische runs uit op vijf of zes afzonderlijke gelegenheden, rekening houdend met Williams E S en DMEM S cel cultuur media, respectievelijk.
    2. Zorg ervoor dat kalibratiepunten variërend van 0,25 tot 100,00 μM APAP, in DMEM S- of Williams E S-celkweekmedia verdund in ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v), worden uitgezet op basis van de piekgebieden van APAP (as y) ten opzichte van de respectieve nominale concentraties (as x). Vergelijk de hellingen van deze standaard kalibratiecurven met hellingen van kalibratiecurve die zijn bereid in ammoniumacetaatbuffer. Zorg ervoor dat alle kalibratiecurven een correlatiewaarde hebben van ten minste 0,998.
    3. Bepaal de precisie en nauwkeurigheid (intra- en inter-run) voor de analyt in de draagmatrix met behulp van replica's op vier verschillende niveaus LLOQ, lage, middelste en hoge kwaliteit controle op vijf of zes verschillende dagen. Voer op dezelfde dag intra-run precisie- en nauwkeurigheidsmetingen uit in DMEM S- of Williams E S-celkweekmedia verdund in ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) met 0,50, 4,50, 45,00 en 90,00 μM APAP-concentraties (n= 3).
    4. Evalueer elke set van kwaliteitscontrolemonsters die de APAP-concentraties bevatten van recent verkregen kalibratiecurven. Test de selectiviteit van de tests door de mate van scheiding van de verbinding van belang en mogelijke andere chromatografische pieken veroorzaakt door storende componenten.
  4. Ondergrens van kwantificering (LLOQ) en detectielimiet (LOD)
    1. Bepaal de ondergrens van kwantificering (LLOQ) op basis van de standaarddeviatie van de respons en de hellingsbenadering. Bereken met behulp van de formule 10α/S, waarbij α de standaarddeviatie is van y-intercept en S is de helling van de rechte lijn verkregen door kalibratiecurven29,30teplotten . Schat de detectiegrens (LOD) rekening houdend met 3,3 keer de standaarddeviatie van de blanco, gedeeld door de helling van de kalibratiecurve29,30.

6. Weefselequivalenten levensvatbaarheid/functionaliteit

  1. Mtt
    1. Voer een MTT-test uit om de levensvatbaarheid van organoïden te beoordelen in alle tijdstippen van de MPS-test. Als de negatieve controle, gebruik cel media plus voertuig. Behandel als de positieve controle de organoïden met 100 mM APAP en 1% NaOH verdund in celmedium.
    2. Breng de 20 sferoïden van elk repliceren voor individuele putten in een 96 put plaat, en de celcultuur inserts, met de darm equivalenten, tot 24 goed celplaten, het plaatsen van een darm equivalent per goed. Was de weefselequivalenten drie keer met 1x DPBS.
    3. Voeg 300 μL van een 1 mg/mL MTT-oplossing, verdund in het respectievelijke celmedium, per put toe. Incubeer de platen voor 3 uur bij standaard celkweekomstandigheden.
    4. Verwijder de MTT-oplossing uit elke put zorgvuldig door pipetten. Haal MTT formazan uit de darm- en leverequivalenten met 200 μL isopropanol per put 's nachts bij 4 °C.
      LET OP: Sluit het deksel af om verdamping te voorkomen.
    5. Breng 200 μL van elke supernatant over naar de respectievelijke vooraf geïdentificeerde put in een 96 goed micro testplaat. Gebruik isopropanol als de lege.
    6. Lees de formazan absorptie in een plaatlezer op 570 nm. Bereken het relatieve vermogen van de cellen om MTT te verminderen (%) met behulp van de gemiddelde optische dichtheid van elk tijdspunt, in vergelijking met de negatieve controle, beschouwd als 100% cel levensvatbaarheid.
  2. Cytochemie/Histologie
    1. Bevestig de darm- en leverequivalenten gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur met behulp van 4% (w/v) paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatzoutbuffer, pH 7.4. Was de organoïden 5 keer in PBS buffer gedurende 10 minuten elke keer. Bevlek de darm- en leverequivalenten met tetramethylrhodamine isothiocyanaat-phalloïden of Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 in PBS31.
    2. Breng ze enkele minuten over naar het vriesmedium van de LGO om bij RT te acclimatiseren voordat u ze overzet naar vloeibare stikstof tot de volledige bevriezing. Voer leversferoïden cryosections uit van ongeveer 10-12 μm dik, met behulp van een cryostat.
    3. Monteer de weefsels secties in montage medium met DAPI. Onderzoek ze door confocale fluorescentie microscopie.
    4. Vries de organoïden na fixatie om hematoxyline & eosine kleuring uit te voeren volgens de vastgestelde protocollen. Monteer de dia's met montagemedium na het snijden van het weefsel zoals hierboven beschreven en neem histologische beelden met behulp van een optische microscoop.
  3. Analyse met hoge inhoud
    1. Mitochondriale en nucleaire kleuring van de cellen
      1. Reconstrueer het gelyofiele poeder in DMSO om een 1 mM mitochondriale kleurstofoplossing te maken (bijvoorbeeld MitoTracker Deep Red FM). Bewaar aliquoted stock oplossing bij -20 °C beschermd tegen licht. Verdun de 1 mM mitochondriale kleurstofoplossing tot de uiteindelijke concentratie (200 nM) in voorverwarmd (37 °C) weefselkweekmedium zonder serum.
      2. Verwijder de celcultuurmedia. Voeg de mitochondriale kleuroplossing toe om het monster volledig af te dekken en incubeercellen gedurende 15-45 min bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
      3. Verwijder voorzichtig de mitochondriale kleuroplossing en vervang deze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur door 2-4% paraformaldehyde fixatief in PBS.
      4. Spoel de vaste cellen voorzichtig af met PBS gedurende 5 minuten. Herhaal het wasproces twee keer.
      5. Bereid een nucleïnezuuroplossing van 10 mg/mL (16,23 M) voor door 100 mg Hoechst 33342 kleurstof op te lossen in 10 mL ultrazuiver water.
        LET OP: De voorraadoplossing moet worden opgeslagen en beschermd tegen licht bij -20 °C.
      6. Bereid een 0,2-2,0 μg/mL nucleïnezuur kleuringsoplossing in PBS en ontcubeer de gefixeerde cellen met nucleïnezuur kleuroplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      7. Verwijder de nucleïnezuur kleuring werkoplossing en spoel de cellen zachtjes met PBS gedurende 5 minuten drie keer. Cellen moeten in PBS op 4 °C worden bewaard, beschermd tegen licht.
    2. Mitochondriale en nucleaire kleuringsanalyse
      1. Analyseer cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met filtersets die geschikt zijn voor de nucleïnezuurvlek (λEx/ λEm: 361/497 nm) en de mitochondriale vlek (λEx/ λEm: 644/665 nm). Zoek cellen door nucleïnezuur positieve kleuring en kwantificeren celnummer. Kwantificeren mitochondriale vlekfluorescentie intensiteit in mitochondriën.
  4. Morfmetrische metingen (sferoïdenberekeningen) in ImageJ
    1. Exporteer HCA-afbeeldingen (High Content Analysis) als *.flex-bestanden uit de Columbus-software. Importeer .flex-bestanden als grijswaarden in ImageJ met Bio-formats plugin32: Bestand > Importeren > Bio-indelingen.
    2. Selecteer in het venster Opties importeren de optie Hyperstack-weergave en schakel Gesplitste kanalen in onder Splitsen in afzonderlijke vensters. Met deze optie kunnen alle bestanden in een bepaald kanaal worden geopend (bijvoorbeeld DAPI, mitotracker, enz.). Selecteer Virtuele stack gebruiken niet onder Geheugenbeheer.
      OPMERKING: Het is beter om DAPI-kanaal te gebruiken als "stof" in beelden, omdat het kweekmedium wordt verminderd in UV-golflengte (bijvoorbeeld 405 nm).
    3. Pixelgrootte aanpassen(Analyseren > Schaal instellen)als deze niet is geladen op basis van ingesloten waarden in het .flex-bestand. Breng een Gaussian Blur filter om de overmaat van ruis te verwijderen en onregelmatigheden in de vormcontour te voorkomen. Proces > Filters > Gaussian Blur. Een hoge waarde van Sigma (straal) tussen 2.0 en 3.0 is ideaal voor de meeste gevallen. Als de stapel meerdere afbeeldingen heeft, moet u deze op alle afbeeldingen toepassen (selecteer Ja in processtapelvenster).
    4. Een binaire afbeelding genereren om achtergrond- en organoïden (objecten) te scheiden met behulp van een drempelwaarde. Klik op Afbeelding > Aanpassen > Drempelwaarde. Gebruik het rode masker om de waarden aan te passen aan de intensiteit van de afbeelding, om de organoïde vorm te passen, waarbij de morfologie intact blijft. Donkere achtergrond uitschakelen als de afbeelding een witte achtergrond heeft. Klik op Toepassen.
    5. Kies in het venster Stapel converteren naar binair de methode Drempel. Meestal hebben Standaard of Driehoek de voorkeur in dit soort beeldverwerking. Houd de achtergrond zo donker. Selecteer Drempelwaarde berekenen voor elke afbeelding als er meerdere afbeeldingen in de stapel zijn.
    6. Selecteer Proces > Binair > Opvulgaten. Verwijder eventueel gaten van de achtergrond. Selecteer in Proces > Binair > Opties de optie Zwarte achtergrond en voer Vulgaten opnieuw uit. Schakel de optie Zwarte achtergrond uit voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    7. Afzonderlijke objecten. Voor organoïden is de waterscheidingsmethode een goede keuze. Klik op Proces > Binair > Waterscheiding. Voer de vormanalyse uit.
      1. Selecteer Analyseren > Metingen instellen. Er zijn verschillende opties beschikbaar (details in https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Selecteer voor organoïden Gebied, Gemiddelde grijze waarde, Min & max grijswaarde en Shapedescriptors. Selecteer de optie Afbeeldingslabel om objecten in de afbeelding en wetenschappelijke notatiete identificeren. Klik op OK.
      2. Selecteer Analyse > Deeltjes analyseren. Kies de limieten Grootte en Circulariteit. Houd respectievelijk 0-oneindigheid en 0,00-1,00 om alle objecten in de afbeelding te meten. Kies in Weergeven contouren zodat de objecten worden geïdentificeerd. Weergaveresultaten inschakelen om resultaten uit te geven; Sluit randen uit om objecten uit te sluiten die randen raken; Neem gaten op, zodat eventuele binnengaten in de objecten worden beschouwd als onderdeel van de hoofdvorm.
    8. Herhaal shapeanalyse voor elke afbeeldingsstapel en de resultaten worden in één tabel toegevoegd. Tabel Resultaten exporteren in Bestand > Opslaan als... als bestand met gescheiden waarden van komma's (.csv).
  5. Real-Time PCR
    1. Extract RNA uit weefsel equivalenten met behulp van een monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voer de cDNA-synthese uit door omgekeerde transcriptie van 1 – 2 μg van het totale RNA uit te voeren.
    3. Versterk alle doelen met behulp van genspecifieke primers(tabel 5) om real-time kwantitatieve PCR uit te voeren. Elke qRT-PCR bevat 30 ng reverse-transcribed RNA en 100 nM van elke primer.
    4. Volg PCR-voorwaarden: 50 °C gedurende 3 minuten (1 cyclus); 95 °C gedurende 5 minuten (1 cyclus); 95 °C gedurende 30 seconden, 59 °C gedurende 45 seconden en 72 °C gedurende 45 seconden (35 - 40 cycli).
  6. CYP-test
    1. Volg punt 2.2 voor lever 2-OC assemblage. De experimentele groepen zijn No-cell control, APAP 2 μM behandelingen voor 12 uur, 24 uur en voertuigcontrole. Volg de punten 3.3 en 4.2 voor APAP 2 μM preparaat en behandeling.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat alle monsters tegelijkertijd klaar zijn voor CYP-test, start u de 12-uursbehandeling 12 uur na het starten van de 24-uursbehandeling. Behandel de no-cell controle van CYP activiteit met 0,5% ethanol oplossing, evenals de controle van het voertuig.
    2. Ontdooi 3 mM luminogene substraatvoorraadoplossing bij kamertemperatuur en maak een verdunning van 1:1000 in William's E S. Bescherm tegen licht.
    3. Verzamel sferoïden en breng elke experimentele groep over naar een put van een 96-put plaat. Verwijder het medium, was twee maal met 100 μL 1x DPBS en voeg 80 μL van 3 μM substraatoplossing per put toe. Bewaar de no-cell controle in William's E S medium. Bewaar een put zonder sferoïden of substraatoplossing voor een achtergrondcontrole. Incubeer gedurende 30-60 min bij 37 °C met 5% CO2, beschermd tegen licht.
    4. Equilibrate lyophilized Luciferin Detection Reagent (LDR) met behulp van de Reconstitution Buffer met esterase. Meng door te wervelen of om te keren. Bewaar het toegeëigende volume bij kamertemperatuur tot de volgende stap.
      LET OP: Gereconstitueerde LDR kan 24 uur of 1 week bij kamertemperatuur worden opgeslagen zonder verlies van activiteit. Voor langdurige opslag, bewaar op -20 °C.
    5. Breng na incubaties 25 μL intacte sferoïden over in drie verschillende putten van een witte ondoorzichtige microplaat van 96 put. Voeg 25 μL LDR per put toe en homogeniseer.
    6. Broed de witte plaat 20 minuten op kamertemperatuur. Lees de luminescentie op een luminometer. Gebruik geen fluorometer.
    7. Bereken nettosignalen door achtergrond luminescentiewaarden (no-cell control) af te trekken van de met de test samengestelde en onbehandelde (voertuigcontrole) waarden. Bereken procentuele verandering van CYP3A4 activiteit door de netto behandelde waarden te delen door de netto onbehandelde waarden en vermenigvuldigen met 100.
  7. Westelijke blotting
    1. Breng de leversferoïden over op een geïdentificeerde 1,5 mL microbuis. Verwijder het medium en was twee maal met 100 μL 1x DPBS.
    2. Lysate de leverferoïden in 100 μL van cellyse RIPA buffer bij 4 °C gedurende 20 min. Centrifuge voor 15 min, 4 °C en 11000 rpm. Breng de supernatant over naar een andere geïdentificeerde 1,5 mL microbuis.
    3. Kwantificeer de hoeveelheid eiwit verkregen door de Bradford methode. Laad tussen 10 en 50 μg eiwit uit de gekwantificeerde cellysaat per put van een gradiënt polyacrylamide gel 3-15% en voer een SDS-PAGINA uit.
    4. Breng het geladen eiwit van de gel naar een 0,22 μm PVDF mem mem via de semi-droge systeemapparatuur. Gebruik een overdrachtsoplossing van 50 mM Tris-HCl en 192 mM glycine. Stel de parameters van de apparatuur in op basis van het aantal gels dat moet worden overgedragen (1 op 2 tegelijk).
    5. Blokkeer niet-specifieke interacties op PVDF-membraan met een 3-5% magere melkoplossing in tbs-T-buffer: Tris-Buffered Saline (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM natriumchloride) aangevuld met 0,1% van Tween 20. Houd het membraan 1 uur zachtjes constant schudden bij kamertemperatuur.
    6. Was met TBS-T onder zacht constant schudden gedurende 3-5 min bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap twee keer.
    7. Verdun albumine en vinculine primaire antilichamen tot respectievelijk 1:1000 en 1:2000 op TBS-T. Broed het membraan 's nachts bij 4 °C uit met primaire antilichamen, onder zacht constant schudden.
      LET OP: Volg altijd de instructies van de fabrikant om antilichamen te verdunnen.
    8. Verwijder het primaire antilichaam en was membraan 3 keer (stap 6.7.6). Verdun ECL anti-muis IgG secundair antilichaam tot 1:5000 op TBS-T. Incubeer het membraan met een secundair antilichaam onder zacht constant schudden gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    9. Verwijder het secundaire antilichaam en was het membraan (stap 6.7.6). Voer eiwitdetectie uit met ECL Western Blotting Substraat. Bloot de autoradiografische films voor 30 s tot 30 min. Voer de immunoblottingdetectie uit in drievoud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de PK APAP-tests uit te voeren in de 2-OC MPS, is de eerste stap het vervaardigen van de menselijke darm- en leverequivalenten (organoïden). Ze zijn geïntegreerd in de 2-OC microfluïde apparaat (Figuur 1A) 24 uur voor het starten van de PK APAP test. De volgende dag wordt het medium gewijzigd en wordt het model blootgesteld aan APAP. Figuur 1 illustreert de darm- en leverequivalenten die in het 2-OC-apparaat(figuur 1B) en de APAP PK-experimenttijdcursus(figuur 1C)worden geplaatst. We voerden een MTT-test uit, TEER-metingen, HCA, real-time PCR, western blotting, histologie en confocale fluorescentiemicroscopie in 2D-cultuur en 3D-organoïden om de levensvatbaarheid van het weefsel te controleren en mogelijke APAP-toxische effecten te detecteren. In de confocale fluorescentiemicroscopiebeelden werden de darmequivalenten met DAPI en Phalloidine (respectievelijk voor kernen en actin) gepresenteerd als een aaneengesloten barrière voor de niet-behandelde (Figuur 2A) en de 12 μM APAP behandelde monsters(figuur 2B). Zoals in figuur 2Cis gebleken , vertoonde de MTT-test relatieve celbestaanheidsniveaus van meer dan 70%, wat wijst op het ontbreken van relevante cytotoxische effecten in reactie op apap-blootstelling bij 12 μM-concentratie33,34,35,36,37. De positieve controle (100 mM) leidde tot significante celdood (overleving onder 5%). De caco-2/HT-29 levensvatbaarheid en de juiste differentiatie en de darm equivalent barrière integriteit werden geverifieerd door TEER evolutie tijdens de differentiatieperiode (Figuur 2D). APAP heeft geen wijziging van de TEER-waarden veroorzaakt, zoals weergegeven in figuur 2E. De expressie van de actieve natrium-gekoppelde glucosetransporters SLC5A1, multidrug weerstand vervoerder MDR1 en natrium-kalium ATPase werden geanalyseerd, om de APAP behandeling impact op celbarrières vorming en basale functionaliteit te verifiëren. Zoals aangetoond in figuur 2F–H, hebben zowel niet-behandelde als APAP behandelde darmequivalenten een vergelijkbare expressie van SLC5A1 en NaKATPase aangetoond. De orale toediening van 12 μM APAP veroorzaakte een toename van het MDR1 mRNA-gehalte in darmequivalenten na 24 uur(figuur 2H). We hebben ook HCA uitgevoerd van celfenotypische veranderingen door een fluorofofre kleurstof mengsel voor kernen en mitochondriale massa gehalte. Positieve controles waren 100 mM APAP en 1% NaOH.

Daarnaast hebben we geanalyseerd of 12 μM APAP cytotoxiciteit kon opwekken in de 2D Caco-2/HT-29 co-cultuur. De beelden van de darmcellen die zijn verkregen met fluorescentiemicroscopie in figuur 2I bevestigen de MTT-gegevens, waaruit is gebleken dat 12 μM APAP geen significante cytotoxiciteit heeft veroorzaakt in de Caco-2/HT-29 darmequivalenten.

De beoordeling van hepatische sferoïden basale levensvatbaarheid en de cytotoxiciteit in reactie op 2 μM APAP werden gedaan door MTT-test en morfologische analyses door confocale fluorescentiemicroscopie, H&E-histologie en HCA-tests. Zoals blijkt uit figuur 3A,kon de MTT-test geen relevante cytotoxiciteit identificeren in reactie op de 2 μm APA-behandeling in monsters die uit de lever 2-OC-assemblage zijn genomen onder zowel statische als dynamische omstandigheden. De levensvatbaarheid van de cellen daalde, maar bleef meer dan 80% voor zowel 12 uur als 24 uur tijdspunten33,34,35,36,37. De positieve controlebehandelingen (100 mM APAP en 1% NaOH) veroorzaakten aanzienlijke weefselschade (levensvatbaarheid onder de 10%). Microscopische confocale beelden wijzen op de afwezigheid van een necrotisch centrum in de leverferoïden in zowel basale als APAP-behandelingsomstandigheden, en geen bewijs van significante sterftecijfers(figuur 3B-C). Echter, toen we meerdere cellulaire fenotypische veranderingen analyseerden na het voertuig of 2 μM APAP-toediening in de 2D HepaRG/HHSteC-cocultuur door HCA-test, met behulp van 100 mM APAP (C+) als een positieve controle, in tegenspraak met de resultaten van de MTT-test, toonden de levercellen vroege cytototoxische reacties op 2 μM APAP-behandeling(figuur 3D). Na 24 uur was er een afname van het aantal cellen, in het nucleaire gebied en een toename van de mitochondriale massa. Daarnaast werd een fluorofofoorkleurstofcocktail met Hoechst 33342 en MitoTracker Deep Red gebruikt om de 3D hepatische sferoïden(figuur 3J)te bevlekken. Fiji-software werd gebruikt om 3D-bolvormige architectuur homogeniteit te evalueren onder verschillende sferoïden(figuur 3E-I). De afbeelding in figuur 3E toont de gelijkenis tussen leversferoïden totale oppervlakte. De beeldverhouding (figuur 3F) rond 1 betekent een afwezigheid van bias tijdens het confectieproces van de sferoïden. Uit de evaluatie bleek ook dat de meeste sferoïden ruwweg afgerond waren (figuur 3G). De evaluatie van de omtrek en celverdeling werd uitgevoerd door circulariteit(figuur 3I) en door soliditeitsberekening (figuur 3H),respectievelijk. We concludeerden dat de methodologie voor het confectie van de leverferoïden organoïden had gegenereerd met een gladde omtrek, compatibel met bolvormige groei, geen vooroordelen of necrose tijdens het proces.

Zoals aangetoond in figuur 4A-B, vertoonden de leversferoïden respectievelijk een relatief basaal hoog niveau van albumin- en GST-mRNA-expressie, wat duidt op de juiste basale functionaliteit. Niettemin leidde de 2 μM APAP-behandeling voor 24 uur tot een afname van de albumine- en de GST mRNA-expressieniveaus, wat wijst op een functionele aantasting van leversferoïden op 24 uur van APAP-behandeling.

De detectie van de CYP3A4 en UGT1A1 mRNA expressie niveaus toont de lever equivalenten metabolische capaciteit. Het basale niveau van cyp3A4 mRNA (figuur 4C) was in overeenstemming met eerdere verslagen6. De APAP-behandeling veroorzaakte een trend voor een afname van zowel CYP3A4 mRNA als UGT1A1-expressie in reactie op APAP-behandeling(figuur 4C-D)die de hypothese van aantasting van leversferoïden functioneel bevestigt op 24 uur van APAP-behandeling.

Daarnaast werden experimenten met westerse blotting en in vitro enzymatische activiteit uitgevoerd om de albumine eiwitexpressie te analyseren, evenals de CYP 3A4-activiteit in leverequivalenten op basis- en APAP-behandelingsvoorwaarden. We vonden dat 2 μM APAP behandeling uitgevoerd op de Lever 2-OC MPS, veroorzaakt een vermindering van de lever equivalent totale albumin expressie op 12 uur en 24 uur time-points op zowel statische (Figuur 4E) en dynamische (Figuur 4F) voorwaarden. Aan de andere kant, lever equivalenten monsters van dynamische omstandigheden aangetoond een trend om hogere niveaus van eiwitexpressie van albumine presenteren in vergelijking met de statische omstandigheden (Figuur 4G). CYP 3A4 in vitro test uitgevoerd bij leverequivalenten van Liver 2-OC MPS toonde aan dat 2 μM APAP behandeling voor 12 uur of 24 uur in staat was om een robuuste en significante aantasting van cyp 3A4 activiteit te induceren bij zowel statische als dynamische omstandigheden (figuur 4H-I). Interessanter is dat de aanwezigheid van mediastroom (dynamisch) heeft geleid tot een aanzienlijke verbetering van de activiteitsniveaus van leverequivalenten CYP 3A4 in vergelijking met omstandigheden waarin de leverequivalenten werden gehouden bij afwezigheid van circulerend medium (statische omstandigheden) (figuur 4J).

Om de meest gevoelige analytische voorwaarde met betrekking tot HPLC-analyse te vinden, werden verschillende parameters onderzocht, waaronder de samenstelling van de mobiele fase, het type en de concentratie van additieven. Er werd vastgesteld dat acetonitril een betere chromatogramresolutie en de juiste retentietijd gaf dan methanol. Snelle en reproduceerbare scheiding van APAP werd verkregen met behulp van een C18 omgekeerde fase kolom. De APAP-bewaartijd (Rt) waarde was 9,27 ± 0,19 minuten. Selectiviteit voor APAP wordt aangegeven door de vorm en symmetrische resolutie van de piek, evenals door het ontbreken van storende pieken van de DMEM en Williams celcultuur media.

APAP standaardconcentraties in DMEM S en Williams E S celkweekmedia verdund met ammoniumacetaatbuffer (1:1, v/v) variërend van 0,25 tot 100,00 μM werden gebruikt om de kalibratiecurven te bouwen. De lineariteit van de methode werd bepaald op negen concentratieniveaus. De gegevens worden weergegeven in tabel 2 en tabel 3. De relatie tussen apap-concentratie en de piekgebieden werd beschreven door de lineaire regressievergelijkingen: y = 16106*x + 3579,8 (R2=1, in DMEM medium) en y = 16397*x + 2475.1 (R2=1, in Williams medium), waarin "x" APAP nominale concentratie in μM is en "y" het chromatogram piekgebied van APAP in AU is. Bij de bovengrens van de kwantificering (d.w.z. 100,00 μM) bedroegen de procentuele afwijking en de interrun variabiliteitswaarden minder dan 2,50%. De nauwkeurigheid en de nauwkeurigheid voor negen concentratieniveaus, met uitzondering van de 0,50 μM (LLOQ), lagen binnen een aanvaardbaar bereik met DEV- en C.V. waarden van minder dan 7,00% (tabel 2 en tabel 3).

De analysemethode inter- en intra-run nauwkeurigheid en precisie, bij vier geteste concentraties, viel binnen de algemeen aanvaarde criteria voor bioanalytische testen. De reproduceerbaarheid van de methode werd geëvalueerd door replica's van APAP-kwaliteitscontrolemonsters van 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 en 90,00 μM te analyseren. De gemiddelde resultaten binnen en tussen de sneden worden gerapporteerd in tabel 4. De nauwkeurigheid en precisie van de test worden aangetoond door de DEV-waarden ≤ 15,00% en door C.V. waarden ≤ respectievelijk 7,00%.

LOD werd bepaald als het monster waarvan de signaal-ruisverhouding (S/N) net groter was dan 3 en overeenkwam met een 0,25 μM APAP. Aan de andere kant, de LLOQ, geschat met 0,50 μM APAP monsters, weergegeven S / N verhouding gelijk aan 10. Verder vonden we nauwkeurigheidswaarden (DEV%) binnen ≤ 19,00% van de nominale concentratiewaarden. De verschillen binnen en tussen de looptijden werden aangetoond door C.V. ≤ 18,77%, zoals aangegeven in tabel 2, tabel 3 en tabel 4,29,30.

De APAP PK-analyses werden uitgevoerd in drie verschillende 2-OC MPS-samenstellingen: 1) Darm 2-OC, met alleen het darmequivalent; 2) Lever 2-OC, met de lever sferoïden alleen en 3) Darm / Lever 2-OC met zowel darmbarrière en lever sferoïden.

Voor absorptiestudies werd de orale route nagebootst door de toediening van 12 μM APAP aan de darmequivalente apicale kant. APAP concentraties werden gemeten door HPLC / UV, in de medium monsters, verzameld van apicale en basolaterale darm equivalenten kanten, in zowel statische als dynamische omstandigheden. De APAP kinetiek in het medium verzameld van de apicale en basolaterale zijden aangetoond dat de darm model in staat was om de APAP absorberen. Er was een geleidelijke apap concentratie daling in de apicale kant (Figuur 5A) gelijktijdig aan APAP concentratie te verhogen aan de darm basolaterale kant (Figuur 5B). De maximale concentraties (Cmax) in het medium waren ongeveer 2 μM voor zowel statische als dynamische omstandigheden, na 12 uur van de toediening (Tmax).

Voor metabolismestudies werd de intraveneuze toediening nagebootst door de toepassing van 2 μM APAP in het medium van het levercompartiment. De APAP-concentratiekinetiek in de media onder zowel statische als dynamische omstandigheden gaf aan dat alleen bij de dynamische omstandigheden de dalingen in de APAP-concentratie konden worden gedetecteerd, tot 0,87 μM APAP 12 uur na 2 μM APAP-toediening (T1/2 = 12 uur). De leverequivalenten vertoonden een minimale metabolische efficiëntie onder statische omstandigheden(figuur 5C). De APAP-concentratie bereikte 1,7 μM 12 uur na APAP-toediening. De geïntegreerde, systemische zoals APAP absorptie en metabolisme evaluatie werd uitgevoerd in de Darm / Lever 2-OC model. De APAP werd toegediend over de apicale kant van de darm equivalent, het emuleren van de orale route. Er werden middelgrote monsters genomen van beide darmzijden en ook uit het levercompartiment. Figuur 5D toont het progressieve verval van de APAP-concentratie aan de apicale kant in zowel statische als dynamische omstandigheden.

Figuur 5E toont te onderscheiden absorptie- en metabolismefasen. De stroming beïnvloedde ook de darmabsorptie. De APAP Cmax in het medium veranderde van 2 μM op de "Darm 2-OC" (Figuur 5B) assemblage naar 1,7 μM voor de dynamische "Darm/Lever 2-OC" (Figuur 5E). Figuur 5F toont een directe vergelijking tussen het concentratie-tijdprofiel van APAP in ons dynamische microfysiologische systeem "Darm/Lever 2-OC" (rode curve en y-as) en een representatief profiel dat bij de mens wordt verkregen na een enkele orale dosis van 1000 mg (zwarte curve en y-as).

Figure 1
Figuur 1: Schematische stap compilatie voor PK-studies in de 2-OC MPS. A) Schematische tekening van de 2-OC MPS, met de darm-en leverkundige menselijke weefsel equivalenten in bottom-up view. B) 2-OC MPS foto met de darm- en leverequivalenten geïntegreerd in het apparaat in bottom-up weergave, met representatieve optische microscopiebeelden. C) Tijdlijn van weefsel equivalenten voorbereiding, APAP behandeling, en cultuur middelgrote collecties fasen voor organoïde productie, en farmacokinetische en toxicologische beoordelingen. Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Levensvatbaarheid en toxicologische beoordeling van de darmequivalenten. A) Representatieve confocale fluorescentiemicroscopie beelden van niet-behandelde Caco-2/HT-29 cellen bevlekt met celkernen en actinefilamenten fluorescerende kleurstof (respectievelijk DAPI en Phalloidin); 63x Vergroting, zoom 2.6. B) Representatieve confocale fluorescentiemicroscopie beelden van Caco-2/HT-29 cellen behandeld met 12 μM APAP voor 24 uur, bevlekt met kernen en actinefilamenten fluorescerende kleurstof (dapi en Phalloidin respectievelijk); 63x Vergroting, zoom 2.6. C) Darm equivalenten levensvatbaarheid evaluatie door MTT test in zowel statische als dynamische omstandigheden. De waarden die worden weergegeven door de balken in de grafiek zijn procent berekend ten opzichte van voertuigcontrole (tijdpunt dat wordt aangeduid als 0)*P<0,05 0 vs. behandeling. D) TEER evolutie tijdens de 21 dagen van differentiatie. *P<0,05 dag 1 vs. andere dagen. E) TEER waarden na APAP administratie in de Darm 2-OC MPS onder dynamische omstandigheden. Genexpressie in darmen equivalenten. Het absorptiepotentieel van de darmbarrière en mogelijke effecten van 12 μM APAP voor 24 uur onder dynamische toestand werden geverifieerd door SLC5A1(F),Na-K-ATPase(G)en MDR1(H)expressie. Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Het resultaat wordt uitgedrukt als een verhouding tot huishouding GAPDH. *P<0,05 voertuig vs APAP. I) Operetta image-based HCA uitgevoerd door de Columbus® 2.4.0. Software. Representatieve beelden van 2D darm co-cultuur in verschillende tijdstippen na 12 μM APAP behandeling. Negatieve controles waren medium (0 uur) of voertuig (0,5% ethanol). Positieve controles hier getoond is de 100 mM APAP. Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Levensvatbaarheid en toxicologische beoordeling van de leverequivalenten. A) Leverequivalenten levensvatbaarheidsevaluatie door MTT-test in zowel statische als dynamische omstandigheden. De waarden die worden weergegeven door de balken in de grafiek zijn procent berekend ten opzichte van voertuigcontrole (tijdpunt met de naam 0) *P<0,05 0 vs. behandeling. B) Vertegenwoordigers confocale beelden die uit het voertuig zijn gemaakt en 2 μM APAP 24 uur behandelde leverferoïden uit een binnenste gedeelte. C) Vertegenwoordigers H&E (hematoxylin en eosine kleuring) beelden die uit het voertuig zijn gemaakt en 2 μM APAP 24 uur behandelde leversferoïden uit een binnenste sectie. Schaalbalk = 50 μm. D) Representatieve beelden van 2D-levercoedy in verschillende tijdstippen na 2 μM APAP-behandeling. In deze analyses werden monsters behandeld die met het voertuig werden behandeld en met 2 μM APAP. De fluorofoferen kleurstof mengsel omvat Hoechst voor nucleaire kleuring en Mitotracker Deep Red voor mitochondriën massa vlekken. Negatieve controles waren medium (0 uur) of voertuig (0,5% ethanol). Positieve controles waren 100 mM APAP. Metingen van hele sferoïden beelden gevangen werden uitgevoerd met behulp van Fiji-software. E) Frequentieverdelingen van het gebied F) aspect ratio, G) rondheid, H) soliditeit, I) circulariteit. N = 85. *p < 0,05. J) Representatieve beelden van 3D-leverferoïden die door de Operette zijn verkregen met behulp van de LWD 10x-doelstelling. Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Lever levensvatbaarheid / functionaliteit en mogelijke effecten van 2 μM APAP onder statische en dynamische omstandigheden over het werden geverifieerd door gen-en eiwitexpressie en door enzymatische activiteit. A) albumin genexpressie. B) GSTA2 genexpressie. Leververmogen om fase I en fase II metabolisme uit te voeren en mogelijke effecten van 2 μM APAP voor 24 uur onder dynamische toestand over het werden geverifieerd door genexpressie van CYP3A4(C) respectievelijk door UGT1A1(D). E) Totale albumin eiwitexpressie onder statische conditie. F) Total albumin eiwitexpressie onder dynamische omstandigheden. Voorwaarde. G) Vergelijkende grafiek die het verschil in totale albuminexpressie in leverequivalenten illustreert en onder statische of dynamische omstandigheden wordt behandeld. H) CYP 3A4 in vitro enzymatische activiteit onder statische omstandigheden. I) CYP 3A4 in vitro enzymatische activiteit onder dynamische omstandigheden. J) Vergelijkende grafiek die het verschil in CYP 3A4-activiteit in leverequivalenten illustreert en behandeld onder statische of dynamische omstandigheden illustreert. Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. De gegevens van genexpressie worden uitgedrukt als een verhouding tot huishouding GAPDH. De gegevens van eiwitexpressie worden uitgedrukt als een verhouding tot vinculin eiwit. *P<0.05 voertuig vs APAP behandeling. Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Analyses van APAP farmacokinetiek in 2-OC MPS. APAP absorptieprofiel na 12 μM APAP toediening aan de apicale kant van de Darm 2-OC MPS voorbereiding. De darmbarrière werd gemaakt van een cocultuur van Caco-2/HT-29 cellijnen(A) Statische en dynamische APAP concentraties in het medium van de apicale kant (die de menselijke darmlumen kant). (B) Statische en dynamische APAP-concentraties in het medium van de basolaterale zijde (die de menselijke darmbloedbaanzijde vertegenwoordigen). *P<0,05 statische vs dynamische omstandigheden. C) APAP metabolisme profiel in de Lever 2-OC MPS door HepaRG / HHSTeC lever sferoïden. Vergelijking van statische en dynamische omstandigheden na een 2 μM APAP-toediening in het medium. *P<0,05 0h vs 6 uur, 12 uur en 24 uur APAP-behandeling. APAP absorptie- en metabolismeprofiel na 12 μM toediening aan de darmbarrière apicale kant van de Darm/Lever 2-OC MPS voorbereiding. Dit emuleert de mondelinge route. De darmbarrière werd gemaakt van Caco-2/HT-29 cellijnen en het leverequivalent gemaakt van sferoïden van HepaRG/HHSTeC cellijnen. (D) Intestinal/Lever 2-OC APAP concentraties in de apicale kant van de darmbarrière onder statische en dynamische omstandigheden. (E) Intestinal/Lever 2-OC APAP concentraties in het medium onder statische en dynamische omstandigheden. *P<0,05 statische vs dynamische omstandigheden. (F) Vergelijking tussen het concentratie-tijdprofiel van APAP in ons microfysiologisch systeem (rode curve en y-as) en een representatief profiel verkregen bij de mens na een enkele orale dosis van 1000 mg (zwarte curve en y-as). De gegevens zijn uit percelen gehaald met WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

HPLC-systeem Waters Alliance 2695 (Milford, MA, USA), uitgerust met quaternaire pomp, monstermanager en degasser
Detector Waters 2996 Uv-Vis set in 210-400 nm bereik
Systeembeheer, gegevensverwerving en -verwerking Waters Empower 2002 chromatografie software
Kolom Omgekeerde fase Luna C18
(150 x 4,6 mm I.D.; 5mm deeltjesgrootte)
Phenomenex Phenomenex
Kolom bewaken Omgekeerde fase Luna C18 (4 x 3 mm)
Phenomenex Phenomenex
Mobiele fase Oplosmiddel A- Acetonitril
Oplosmiddel B- 0,10 M ammoniumacetaat, pH 6,8
Isocratische omstandigheden Tijd A (%) B (%)
(min.)
15 5 95
Stroom 1,0 mL/min
Injectievolume 25 μL
Temperatuur 25 °C
APAP-detectie UV @ 243 en 254 nm
Looptijd 15 minuten

Tabel 1: Voorwaarden en parameters die moeten worden gebruikt voor HPLC-UV-analyses van APAP in kweekme middelgrote matrices.

Nominale concentratie Berekende APAP-concentratie (μM) Gemiddeld (μM) S.D. C.v. Dev
(μM) (Drievoud van elke concentratie) (μM) (%)c (%)d
Testnummer 1 2 3 4 5 6
0,25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46,05
0,50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17,08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0,09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0,03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tabel 2: Inter-run variatie – nauwkeurigheid, precisie en lineariteit van standaard curve monsters bereid in een mengsel van DMEM medium met 0,10 M ammonium acetaat buffer (1:1, v/ v) van zes afzonderlijke tests. a.
a. Een lineaire curve werd gemonteerd op de gegevens voor een respons(APAP) versus theoretische concentratie zoals beschreven in Experimental. De berekende concentratie is afgeleid van het lezen van de respons voor elk standaardmonster tegen de kalibratiecurve. Elk item (test 1-6) komt overeen met de gemiddelde waarde van drievoudanalyse.
b SD= Standaarddeviatie.
c C.V. (variatiecoëfficiënt.
d Nauwkeurigheid (DEV %) = de afwijking van de berekende concentratie ten opzichte van de nominale waarde.
Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Nominale concentratie Berekende APAP-concentratie (μM) Gemiddelde S.D. C.v. Dev
(μM) (Drievoud van elke concentratie) (μM) (μM) (%)c (%)d
Testnummer 1 2 3 4 5
0,25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26.03
0,50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14,97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6,85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1,56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0,01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0,05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tabel 3: Inter-run variatie – nauwkeurigheid, precisie en lineariteit van standaard curve monsters bereid in een mengsel van Williams medium met 0,10 M ammonium acetaat buffer (1:1, v/ v) van zes afzonderlijke tests. a.
a. Een lineaire curve werd gemonteerd op de gegevens voor een respons(APAP) versus theoretische concentratie zoals beschreven in Experimental. De berekende concentratie is afgeleid van het lezen van de respons voor elk standaardmonster tegen een kalibratiecurve. Elk item (test 1-5) komt overeen met de gemiddelde waarde van drievoudanalyse.
b SD= Standaarddeviatie.
c C.V. (variatiecoëfficiënt.
d Nauwkeurigheid (DEV %) = de afwijking van de berekende concentratie ten opzichte van de nominale waarde.
Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Williams medium Nominale concentratie Gemeten concentratie S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-run (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1,77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8,37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8,57
Inter-run (n=15) 0,50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14,97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2,99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5,88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5.31
DMEM-medium Nominale concentratie Gemeten concentratie S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-run (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6.35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1,04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1,69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4,00
Inter-run (n=12) 0,50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7,75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tabel 4: Intra- en inter-run precisie en nauwkeurigheid voor APAP in kwaliteitscontrole monsters. a.
a. De gegevens worden weergegeven als gemiddelden. SD (standaarddeviatie). C.V. (variatiecoëfficiënt. precisie) en nauwkeurigheid (procentafwijking. DEV%).
Dit cijfer is gewijzigd van Marin et al. Paracetamol absorptie en metabolisme in een darm / lever microfysiologisch systeem. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Primer (5' → 3')
Weefsel Gen Doorsturen Omgekeerde
Darm SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAGGCTCCAACACAGACGGT
NA-K-ATPase ACCGCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgTCC
MDR1 MDR1 TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTTgg
Lever Albumine TgCAAggCTgATAAggAg TTTAgACAgggTgTggCTTTACAC
GSTA2 GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgC AgcAgggaaggCTggAAATAAg
CPY3A4 CPY3A4 ggAAAggTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgTgAAggCTggAg

Tabel 5: Real-time qPCR primers om gentranscriptie op mRNA-niveau te evalueren in de 2-OC culturen voor darm- en leverweefsels

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van de farmacologische eigenschappen van onderzoekende nieuwe geneesmiddelen is van cruciaal belang voor het verminderen van het risico in de volgende ontwikkelingsstappen. De MPS is een relatief nieuwe technologie, die gericht is op het verbeteren van de voorspellende kracht en het verminderen van de kosten en tijd besteed aan preklinische tests. Onze groep is op weg in de beoordeling van farmacokinetische en toxicologische eigenschappen meestal nodig voor lood optimalisatie. We werkten met het 2-OC microfluidic apparaat, dat twee kamers heeft, waardoor de integratie van twee organoïden mogelijk is. APAP werd gekozen omdat het veel hoogwaardige menselijke gegevens heeft, meestal wordt gemetaboliseerd door de lever, en toont ook hepatoxische eigenschappen. Het studieprotocol was bedoeld om enkele stappen van de klinische studie van de menselijke fase I na te bootsen, waarbij een geneesmiddel mondeling aan vrijwilligers wordt toegediend, en periodieke bloedmonsters worden genomen om de concentratie van de geneesmiddelen te beoordelen om de farmacokinetische eigenschappen te kennen en biochemische en klinische parameters worden verzameld om de veiligheid en verdraagbaarheid te beoordelen. Daarom, wanneer de MPS evolueert genoeg om betrouwbare voorspellingen te bieden, zal het aanzienlijk verminderen van het risico van mislukking in de fase I proef. Door de ziektemodellen in de toekomst toe te voegen, zal dezelfde veronderstelling mogelijk van toepassing zijn op de fasen II en III klinische studies.

Alle studies werden uitgevoerd in drie modellen: Darm 2-OC (APAP orale toediening), Lever 2-OC (Intraveneuze toediening), en Darm/Lever 2-OC (mondelinge toediening). Het eerste model isoleerde de absorptie, de tweede het metabolisme, en de derde geïntegreerd beide. We produceerden eerst de organoïden en verwerkten in het microfluïde apparaat, verzorgden de APAP en verzamelden de mediamonsters en voerden voor het laatst een reeks tests uit om de levensvatbaarheid en functionaliteit van de cel en de toxicologische impact van APAP-blootstelling te beoordelen. Voor de farmacokinetische studies ontwikkelden en valideerden we een chromatografische methode voor APAP-kwantificering in het medium. De validatie voldeed aan de richtlijn bioanalytische methode validatie met betrekking tot specificiteit, lineariteit, de limiet van kwantificering (LOQ), de limiet van detectie (LOD), matrix effect, precisie, en nauwkeurigheid, zoals beschreven door FDA29,30. De specificiteit werd vastgesteld met blanco, samengevoegde en individuele biologische monsters uit twee verschillende bronnen. De methode uitgevoerd aanvaardbaar tijdens de analyse, en de gegevens bevestigd het vermogen van een eenvoudige isocratische mobiele fase te scheiden en te kwantificeren APAP.

De levensvatbaarheid/functioneel van de darm en leverorganoïden werd beoordeeld met verschillende technieken. Voor het darm-equivalent heeft de confocale fluorescentiemicroscopie(figuur 2A-B),de MTT-test (figuur 2C),genexpressiebeoordeling (figuur 2D-F) of HCA-experiment, geen toxiciteit 24 uur na APAP-blootstelling gedetecteerd. Evenzo heeft MTT-test geen toxische beledigingen gedetecteerd die door APAP in leverequivalenten(figuur 3A )werden veroorzaakt. Echter, de HCA techniek toegevoegd de mogelijkheid van detectie van zeer vroege toxische voorvallen (24 uur na APAP blootstelling) voor levercellen, door de observatie van celfenotypische veranderingen, met een aantal mechanistische aanwijzingen (Figuur 3D). Anderzijds bleken de confocale fluorescentiemicroscopie(figuur 3B)en histologie (figuur 3C) een nuttig aanvullend instrument te zijn in het onderzoek naar de levensvatbaarheidsstatus van de equivalenten van het menselijk weefsel. Voor de levercellen was het gelijktijdige gebruik van verschillende technieken zeer voordelig. De MTT-test, zoals eerder vermeld, was niet in staat om de APAP cytotoxiciteit gedetecteerd door de HCA 24 uur na APAP blootstelling te detecteren. De genexpressieanalyses beoordeelden de functionaliteit van de darm (figuur 2D-F) en leverorganoïden (figuur 4A-D) zowel basaal als 24 uur na APAP-behandeling. Onder basale omstandigheden waren er normale niveaus van darm- en leverspecifieke markers, wat de juiste functionaliteit suggereert. Na 24 uur apap blootstelling, was er een downregulation van albumine, GST mRNA niveaus, en een neiging om de CYP3A4 genexpressie in lever equivalent weefsels te verminderen, wat aangeeft APAP vroege cytotoxiciteit. Bevestigend deze bevindingen, westelijk blotting experimenten toonden aan dat de vermindering van de genexpressie ging ook gepaard met een robuuste vermindering van de lever totale albumine eiwitexpressie in reactie op APAP behandeling (Figuur 4E-F), bevestiging van de giftige beledigingen opgelegd aan leverweefsel door blootstelling aan APAP. Bijgevolg toonden experimenten met in vitro enzymatische activiteit een robuuste en progressieve vermindering van de CYP 3A4-activiteitsniveaus die werden veroorzaakt door APAP-behandeling, in leverequivalenten (figuur 4H-I).

Morfometrische statistieken van organoïden werden uitgevoerd op afbeelding J (figuur 3E-I). Het gebied laat zien hoe dicht de 2D-grootte is voor alle geanalyseerde organoïden, die kunnen worden gebruikt als standaardisatie in dit protocol, zodat een onbevooroordeeld resultaat kan worden geproduceerd. De 'shape descriptors' onthullen statistieken die precies overeenkomen met de vormmorfologie. De aspect ratio is een index die gebruik maakt van de grote en kleine as, dus resultaten rond 1 geven geen bias (dat wil zeggen, preferentiële groei) tijdens organoïde vorming. De waarden van rondheid (4 ×[oppervlakte]/ (π × [belangrijke as]2)) zijn zeer gevoelig voor een preferentiële groei, die als een belangrijke as zou worden onthuld. De soliditeit ([gebied]/ ([bolle gebied])) is essentieel voor het tonen van grove morfologie, aangezien deze niet wordt beïnvloed door onregelmatigheden in de grenzen, aangezien het bolvormig gebied (=enveloppen) gebruikt. De verdelingen rond 1,0 wijzen op een putatieve sferische groei. Omgekeerd is Circulariteit (4× π [gebied]/[perimeter]2)zeer gevoelig voor een complexe omtrek, dus "gaatjes" of "zakken" zouden van invloed zijn op deze index. Zo bevestigt circulariteit rond 1 ook putatieve bolvormige groei, compatibel met de juiste organoïde functionaliteit.

De analytische resultaten toonden aan dat de MPS de APAP-absorptie- en metabolismeeigenschappen kon emuleren, zowel geïsoleerd als geïntegreerd in een curve die vergelijkbaar is met die in vivo(figuur 5F)zonder de uitscheidingsfase. De APAP absorptie was vergelijkbaar na orale toediening aan zowel Darm MPS of Darm / Lever MPS modellen, onder zowel statische en dynamische omstandigheden (Figuur 5A-B, Figuur 5D-E). In beide was er een APAP concentratie afneemt aan apicale kant gelijktijdig aan de toename aan de basolaterale kant, zonder significant verschil voor statische en dynamische omstandigheden. In tegenstelling, de APAP hepatische metabolisme verschilde onder deze omstandigheden. De circulerende media in MPS leek de organoïde metabolische vermogen te verbeteren(figuur 5C en figuur 5E). Er was een aanzienlijke APAP verval onderstroom niet gezien zonder stroom. Interessant, in vitro, CYP3A4 activiteit experimenten bevestigen de hypothese dat de aanwezigheid van stroom in het systeem verhoogt de functionaliteit van menselijke lever equivalenten. Zoals blijkt uit de grafiek in figuur 4J,was de activiteit van CYP 3A4 aanzienlijk hoger in leverequivalenten die onder stroom werden gehouden bij zowel basale als APAP-behandelingsomstandigheden. Evenzo vertoonden de onder stroom gehouden leverequivalenten de neiging om de eiwitexpressie van albumine te verhogen in vergelijking met die welke zonder stroom (statisch) worden gehouden, zowel bij aanvang als bij APAP behandelde omstandigheden(figuur 4G).

In vergelijking met het concentratietijdprofiel na orale toediening van APAP aan de mens, vertoont ons microfysiologisch systeem veel grotere t1/2 (halfademtijd)(figuur 5F). Dit gebeurt, zoals eerder vermeld, want terwijl we een twee-orgaan systeem met darm-en lever-equivalenten die kunnen absorberen en metaboliseren van het geneesmiddel, is er geen nier gelijk aan APAP en zijn metabolieten uit het plasmacompartiment38uitscheiden. Daarnaast toont het microfysiologisch systeem kleinere Cmax (piekplasmaconcentratie) en grotere tmax (tijd om Cmax te bereiken) dan wat typisch wordt waargenomen voor mensen(figuur 5F). Dit is een gevolg van de verschillen in de omvang van de in vitro en in vivo experimenten. Over het geheel genomen zijn er drie belangrijke verschillen tussen het concentratie-tijdprofiel verkregen met behulp van het microfysiologische systeem en profielen verkregen na orale toediening van APAP aan de mens: grotere t1/2, kleinere Cmax en grotere tmax (Figuur 5F). Terwijl de grotere t1/2 is te wijten aan de afwezigheid van een nier gelijk aan APAP en zijn metabolieten uit het plasma-equivalent uit te scheiden, kleinere Cmax en grotere tmax zijn gevolgen van de kleine schaal van het experiment in vergelijking met het menselijk lichaam. De beste schaalstrategieën voor het bouwen en bedienen van microfysiologische systemen zijn nog steeds een actief onderzoeksgebied en het is onwaarschijnlijk dat een enkele aanpak optimaal is voor alle systemen39. Bovendien kan wiskundige modellering of machine learning worden gebruikt om correcties toe te passen of de mapping van de microschaal op ware schaal te leren om in vitro gegevens verkregen met de microfysiologische systemen te extrapoleren naar het in vivo gedrag waargenomen bij mensen40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon bij Unit 522 INSERM en dr. Christian Trepo bij Unit 271 INSERM voor het gebruik van het biologisch materiaal (Hepa RG cellen) en voor het beschikbaar stellen van vervolgens voor ons om het academisch onderzoek uit te voeren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Tags

Chemie Microfysiologisch Systeem Paracetamol ADMETox Organoïden
Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter