Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Un sistema microfisiologico intestino/fegato per la valutazione farmacocinetica e tossicologica

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Abbiamo esposto un sistema microfisiologico (MPS) con organoidi intestinali e epatici ad acetaminofene (APAP). Questo articolo descrive i metodi per la produzione di organoidi e le valutazioni della proprietà farmacocinetica e tossicologica APAP nelle MPS. Descrive anche le analisi della funzionalità tissutale necessarie per convalidare i risultati.

Abstract

I sistemi microfisiologici (MPS) recentemente introdotti che coltivano organoidi umani dovrebbero funzionare meglio degli animali nella fase di test preclinici del processo di sviluppo dei farmaci perché sono geneticamente umani e ricapitolano l'interazione tra i tessuti. In questo studio, la barriera intestinale umana (emulata da una co-coltura di cellule Caco-2 e HT-29) e l'equivalente epatico (emulato da sferoidi fatti di cellule EpaRG differenziate e cellule stellate epatiche umane) sono stati integrati in un dispositivo microfluidico a chip a due organi (2-OC) per valutare alcune proprietà farmacocinetiche (APAP) ad acetaminofene (APAP) e tossicologiche. La MPS aveva tre gruppi: intestino solo 2-OC, fegato solo 2-OC, e intestino / fegato 2-OC con lo stesso supporto che permea entrambi gli organoidi. Per le valutazioni della chiave di piattaforma, abbiamo dosato l'APAP nel supporto a punti di tempo preimpostati dopo averli somministrati sopra la barriera intestinale (emulando la via orale) o nel supporto (emulando la via endovenosa), rispettivamente a 12 μM e 2 μM. I campioni di supporto sono stati analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione in fase invertita (HPLC). Gli organoidi sono stati analizzati per l'espressione genica, per i valori TEER, per l'espressione e l'attività proteica, e quindi raccolti, fissati e sottoposti a una serie di valutazioni morfologiche. La tecnica MTT ha funzionato bene nel valutare la fattibilità organoide, ma le analisi ad alto contenuto (HCA) sono state in grado di rilevare eventi tossici molto presto in risposta al trattamento APAP. Abbiamo verificato che il flusso del supporto non influisce in modo significativo sull'assorbimento apap, mentre migliora significativamente la funzionalità equivalente al fegato. L'assorbimento intestinale umano APAP e il metabolismo epatico potrebbero essere emulati nelle MPS. L'associazione tra i dati delle MPS e la modellazione in silico ha un grande potenziale per migliorare la prevedibilità dei metodi in vitro e fornire una migliore accuratezza rispetto ai modelli animali negli studi farmacocinetici e tossicologici.

Introduction

A causa delle differenze genomiche e proteomiche, i modelli animali hanno un valore predittivo limitato per diversi risultati umani. Inoltre, sono dispendiosi in termini di tempo, costosi ed eticamente discutibili1. Mps è una tecnologia relativamente nuova che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test precli clinici. Sono dispositivi microfluidi che coltivano organoidi (unità funzionali mimetiche artificiali di organi) sotto flusso mediatico che promuovono la comunicazione organoide-organoide. Gli organoidi composti da cellule umane aumentano la rilevanzatraslizionale 2,3,4. Ci si aspetta che le MPS funzionino meglio dei test sugli animali perché sono geneticamente umane e ricapitolano l'interazione tra i tessuti. Quando è pienamente funzionante, l'MPS fornirà risultati più significativi, a velocità più elevata e costi e rischiinferiori 4. Molti gruppi stanno sviluppando MPS per diversi scopi, in particolare modelli di malattia per testare l'efficacia del farmaco.

Il livello di esposizione è uno dei parametri più critici per valutare l'efficacia e la tossicità delfarmaco 5,6,7,8,9,10,11,12. La MPS consente un'integrazione organoide che emula l'esposizione sistemica e si prevede che funzioni meglio della tradizionale coltura di tessuti umani 2D. Questa tecnologia può migliorare significativamente la previsione dell'assorbimento intestinale composto e del metabolismoepatico 4.

Una MPS che integra un modello equivalente umano di intestino e fegato è un buon punto di partenza, considerando il ruolo centrale di questi due organi nella biodisponibilità del farmaco e nell'esposizionesistemica 13,14,15. APAP è un farmaco attraente per studiare una MPS senza un equivalente renale perché la sua metabolizzazione è fatta principalmente dal fegato16,17.

Il 2-OC è un dispositivo microfluidico a due camere adatto alla coltura di due diversi tessuti/organoidi equivalenti umani interconnessi da microcanali16. Al fine di emulare una somministrazione orale/endovenosa umana in vitro di un farmaco e valutare gli effetti del colloquio incrociato tra l'intestino e gli equivalenti epatici sulla farmacocinetica APAP, oltre alla funzionalità e alla vitalità degli organoidi, sono stati eseguiti tre diversi gruppi di MPS: (1) una "MPS intestino 2-OC" composta da un equivalente intestinale basato in un inserto di coltura contenente una cocoltura di cellule Caco-2 + HT-29, integrata nel dispositivo 2-OC; (2) una "MPS epatica a 2 OC" composta da sferoidi epatici costituiti da HepaRG + HHSteC (Cellule Stellate Epatiche Umane) integrati nel dispositivo 2-OC; e (3) una "MPS intestino/fegato 2-OC" composta dall'equivalente intestinale in un compartimento del dispositivo che comunica con l'equivalente epatico nell'altro dal flusso del fluido attraverso i canali microfluidici.

Tutti i saggi sono stati eseguiti in condizioni statiche (senza flusso) e dinamiche (con flusso) a causa dell'impatto degli stimoli meccanici (compressione, stiramento e taglio) sulla vitalità cellulare e sullefunzionalità 18,19,20. Il presente articolo descrive il protocollo per l'emulazione della somministrazione orale/endovenosa APAP e le rispettive analisi di assorbimento/metabolismo e tossicologiche nelle MPS a 2-OC contenenti modelli equivalenti all'intestino umano e al fegato.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produzione di equivalenti tissutali per la coltivazione nel 2-OC

  1. Produzione equivalente barriera intestino tenue
    1. Mantenere le cellule Caco-2 e HT-29 usando il mezzo equivalente intestino: DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina, e 1% amminoacidi non essenziali, che è chiamato come "DMEM S" in questo manoscritto.
    2. Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 1x DPBS e aggiungere 8 mL dello 0,25% di tripina/EDTA per dissociare le cellule Caco-2 coltivate in contenitori di coltura cellulare (175 cm2). Incubare per 5 minuti a 37 °C e interrompere la reazione aggiungendo almeno il doppio volume di inibitore della tripina. Eseguire la stessa procedura per le celle HT-29, regolando i volumi del reagente poiché è necessaria una quantità minore di queste cellule e vengono mantenute in contenitori più piccoli (75 cm2).
    3. Centrifugare a 250 x g per 5 minuti, rimuovere il supernatante da entrambi i tubi e rimescolare i pellet cellulari in 10 ml di cellule DMEM S. Count, garantendo una vitalità cellulare superiore all'80%. Integrare aseticamente inserti di coltura cellulare in una piastra a 24 porri precedentemente riempita con 400 μL di DMEM S per pozzo nel lato basolaterale (che rappresenta il flusso sanguigno umano).
    4. Co-coltivare cellule Caco-2 e HT-29 con un rapporto di 9:121. Utilizzare 2,25 x 105 Caco-2 e 2,5 x 104 cellule HT-29 per ogni intestino equivalente in un volume finale di 200 μL di DMEM S. Regolare il numero e il volume delle cellule in base al numero desiderato di organoidi. Mescolare con attenzione.
    5. Pipetta 200 μL di soluzione cellulare nel lato apicale di ogni inserto (che rappresenta il lato lume intestinale umano), seminando 250.000 cellule per inserto. Co-coltivare le cellule negli inserti per tre settimane22. Cambiare il mezzo almeno tre volte a settimana, aspirarlo sia dal lato apicale che basolaterale con una pipetta Pasteur sterile, facendo attenzione a non danneggiare la barriera cellulare intatta.
      NOTA: Procedere con l'aspirazione sul lato apicale, in modo da non toccare la barriera cellulare (aspirare supportando la pipetta Pasteur sul bordo di plastica dell'inserto cellulare).
    6. Controllare la stretta formazione monostrato misurando il TEER (resistenza elettrica transepiteliale) ogni tre giorni utilizzando un voltmetro23, secondo le istruzioni del produttore.
      1. Eseguire un vuoto, misurando la resistenza su un inserto di coltura cellulare senza celle, ma con lo stesso mezzo cellulare e nella stessa piastra cellulare.
      2. Calcolare la resistenza dei tessuti sottraendo la resistenza in bianco dalla resistenza equivalente al tessuto e moltiplicare per l'area superficiale effettiva della membrana filtrante (0,6 cm2). Una buona resistenza alla barriera intestinale è in un intervallo da 150 a 400 Ω-cm2.
        NOTA: Dopo 21 giorni le cellule devono essere completamente differenziate e la barriera intestinale formata, quindi gli equivalenti intestinali sono pronti per essere integrati nelle MPS.
  2. Produzione di equivalenti epatici
    1. Mantenere le cellule HepaRG utilizzando il mezzo equivalente epatico, che è il Medium E di William integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, 100 unità / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 5 μg / mL insulina umana e 5 x 10-5 M idrocortisone, ed è chiamato "Williams E S" in questo manoscritto. Rinnovare i supporti HepaRG ogni 2-3 giorni e mantenere la coltura cellulare per due settimane per iniziare la differenziazione in epatociti e conlangiociti.
    2. Dopo le prime due settimane, aggiungere il 2% di DMSO al mezzo heparg per altre due settimane per completare la differenziazionecellulare 24,25. Far crescere HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), utilizzando contenitori di coltura cellulare rivestiti in poli-L-lisina, cambiando i supporti ogni due o tre giorni.
    3. Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 1x DPBS e aggiungere 8 mL dello 0,05% di tripina/EDTA, per dissociare le cellule HepaRG coltivate in contenitori di coltura cellulare (175 cm2). Incubare per 5-10 min a 37 °C e interrompere la reazione aggiungendo almeno il doppio del volume di inibitore della tripside. Eseguire lo stesso per HHSTeC, adattando il volume del reagente poiché è necessaria una quantità minore di queste cellule e possono essere mantenute in contenitori più piccoli (75 cm2).
    4. Centrifugare entrambi a 250 x g per 5 minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare nel mezzo Williams E S. Contare le cellule, assicurando una vitalità cellulare superiore all'80%.
    5. Generare gli sferoidi epatici combinando cellule HepaRG e HHSTeC ad un rapporto di 24:1, rispettivamente, in Williams E S medium16. Aggiungere 4,8 x 104 HepaRG differenziato e 0,2 x10 4 HHSTeC per comporre ogni sferoide epatico di 50.000 cellule, in un volume di 80 μL. Regolare il numero e il volume delle cellule in base al numero desiderato di sferoidi. Mescolare con attenzione.
    6. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 80 μL del pool di celle combinate in ogni pozzo di 384 micropiatte sferoidi, che ha una geometria rotonda ben inferiore.
      NOTA: Dopo quattro giorni si formano sferoidi di circa 300 μm.
    7. Utilizzando punte a foro largo, trasferire gli sferoidi epatici su piastre di 6 potte ad attacco ultra-basso, il che consente il conteggio "uno per uno" richiesto.

2. Integrazione di equivalenti intestini e epatici in una MPS a 2 OC

  1. Assemblaggio mps intestino 2-OC per test di assorbimento
    1. Pipetta 500 μL di DMEM S nel compartimento più grande di 2-OC e 300 μL in quello più piccolo. Aspirare i mezzi basolaterali e apicali di ogni barriera intestinale equivalente nelle 24 piastre del pozzo. Utilizzando forcep sterili, integrare un inserto per circuito 2-OC, in particolare nel vano più grande. Applicare 200 μL del mezzo intestino sul lato apicale.
      NOTA: Evitare la formazione di bolle quando si integrano gli organoidi nelle MPS.
    2. Collegare l'MPS alla centralina, che deve essere collegata a un alimentatore d'aria pressurizzato. Impostare i parametri: una pressione di circa ±300 bar e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hz. Avviare il flusso 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame. Il giorno successivo, eseguire il trattamento APAP.
  2. Assemblaggio di MPS epatiche a 2-OC per il test del metabolismo
    1. Pipetta 650 μL di Williams E S nel grande compartimento e 350 μL nel compartimento più piccolo, che riceverà gli sferoidi. Nelle piastre a fissaggio ultra-basso 6 pondo, contare gli sferoidi utilizzando punte a foro largo. Ogni equivalente epatico è composto da venti sferoidi26. Integrare venti equivalenti epatici per circuito, utilizzando punte a foro largo, che consentono il trasferimento solo di organoidi, nel compartimento più piccolo di un 2-OC.
    2. Collegare l'MPS alla centralina, che deve essere collegata a un alimentatore d'aria pressurizzato. Impostare i parametri: una pressione di circa ±300 bar e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hz. Avviare il flusso 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame. Il giorno successivo, eseguire il trattamento APAP.
  3. Assemblaggio mps intestino/fegato 2-OC per assorbimento e dosaggio del metabolismo
    1. Unire i due mezzi (intestino e fegato) in proporzione 1:4, il che significa 200 μL di DMEM S nel lato apicale intestinale e 800 μL di Williams E S nel lato basolaterale. Integrare l'intestino e gli equivalenti epatici, contemporaneamente, nel 2-OC.
    2. Collegare l'MPS alla centralina, che deve essere collegata a un alimentatore d'aria pressurizzato. Impostare i parametri: una pressione di circa ±300 bar e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hz. Avviare il flusso 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame. Il giorno successivo, eseguire il trattamento APAP.
      NOTA: Per tutti gli esperimenti, eseguire ogni punto di tempo in triplice copia, il che significa tre circuiti 2-OC separati (cioè dispositivi 1 e 1/2 2-OC). Il volume totale di ogni circuiti 2-OC è di 1 mL.

3. Preparazione dell'acetaminofene (APAP)

  1. Preparare la soluzione stock APAP, sciogliendo l'APAP in etanolo assoluto. Il giorno dell'esperimento, diluire l'APAP nel rispettivo mezzo (soluzione APAP), ad una concentrazione di 12 μM per la "somministrazione orale" e 2 μM per la "somministrazione endovenosa".
  2. Assicurarsi che la concentrazione finale di etanolo nella soluzione di controllo e trattamento del veicolo sia dello 0,5% per entrambe le amministrazioni. Per il controllo positivo (APAP da 100 mM), la concentrazione di etanolo è del 2%.

4. Somministrazione di sostanze di prova e campionamento dei supporti

  1. Somministrazione "orale" APAP e campionamento dei supporti
    1. Aspirare il mezzo basolaterale e apicale di ogni barriera intestinale equivalente nella Pipetta 2-OC.
    2. Verificare la presenza di bolle e procedere con il trattamento equivalente barriera intestinale con la sostanza in esame nel lato apicico, emulando la somministrazione orale. Emulare la somministrazione "orale" APAP aggiungendo 200 μL di una soluzione APAP da 12 μM sul lato apicale degli inserti di coltura intestinale, che rappresenta il "lato lume" intestinale (Figura 1B). Collegare l'MPS all'unità di controllo.
    3. Raccogliere il volume totale da lati apicali e da lati basolaterali nei seguenti punti temporali: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h e 24 h15,27. Eseguire tutti gli esperimenti in triplice copia, in condizioni statiche e dinamiche, e raccogliere ogni campione, di ogni triplice copia, in un microtubo separato. Analizzare i campioni utilizzando HPLC/UV.
      NOTA: Separare campioni apicali e basolaterali.
  2. Amministrazione "endovenosa" APAP e campionamento dei supporti
    1. Emulare la via "endovenosa" somministrando 2 μM di soluzione APAP direttamente nel compartimento epatico. Aspirare tutto il contenuto medio 2-OC. Pipetta 650 μL di Williams E S contenente la sostanza in esame nel grande compartimento e 350 μL dello stesso supporto nel compartimento più piccolo che contiene i 20 sferoidi. Raccogli tutti i volumi nei seguenti punti di tempo: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h e 24 h27,28.
    2. Eseguire tutti gli esperimenti in triplice copia, in condizioni statiche e dinamiche. Raccogliere ogni campione, di ogni triplice copia, in un microtubo separato. Analizzare i campioni utilizzando HPLC/UV.

5. Strumentazione e condizioni cromatografiche

  1. Analisi HPLC
    1. Impostare tutti i parametri rilevanti per l'analisi HPLC in base alla tabella 1.
    2. Filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm sotto vuoto. Filtrare i campioni attraverso un filtro siringa PVDF di dimensioni dei pori da 0,22 μm (diametro 13 mm) e conservarli in un flaconcino. Avviare la misurazione.
  2. Soluzioni stock, standard di calibrazione e campioni di controllo qualità (QC)
    1. Preparare 10 mM di soluzioni stock APAP in tampone di acetato di ammonio (100 mM, pH 6,8) e diluire ulteriormente con i supporti di coltura cellulare DMEM S e Williams E S diluiti con tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) per ottenere le soluzioni di lavoro che vanno da 0,25 a 100,00 μM.
    2. Includere una serie di campioni di calibrazione in triplice copia e campioni di controllo qualità a quattro livelli in triplice copia. Preparare questi standard per diluizione seriale.
    3. Creare curve di calibrazione delle aree di picco APAP rispetto alle concentrazioni standard nominali APAP. Determinare l'adattamento di regressione lineare per ogni curva di calibrazione. Valutare la bontà di adattamento di vari modelli di calibrazione mediante ispezione visiva, coefficiente di correlazione, precisione intra-e tra-run e valori di precisione.
    4. Iniettare campioni vuoti di supporti DMEM S e Williams E S diluiti in tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) in sextuplicate. Preparare triplicati di campioni di controllo qualità nei supporti DMEM S e Williams E S diluiti con tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) per le concentrazioni APAP di 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 e 90,00 μM.
    5. Assicurarsi che i campioni di controllo qualità siano preparati da una nuova soluzione stock, diversa da quella utilizzata per generare una curva standard. Utilizzare campioni di controllo qualità per analizzare le variazioni all'interno e all'interno dell'esecuzione.
  3. Procedure di convalida
    1. Eseguire la convalida del metodo bioanalitico seguendo le procedure precedentementeriportate 29,30. Eseguire le esecuzioni cromatografiche in cinque o sei occasioni separate, considerando rispettivamente i supporti di coltura cellulare Williams E S e DMEM S.
    2. Assicurarsi che i punti di calibrazione che vanno da 0,25 a 100,00 μM di APAP, nei supporti di coltura cellulare DMEM S o Williams E S diluiti in tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v), siano tracciati in base alle aree di picco dell'APAP (asse y) rispetto alle rispettive concentrazioni nominali (asse x). Confrontare le pendenze di queste curve di taratura standard con i pendii della curva di calibrazione preparati in tampone di acetato di ammonio. Assicurarsi che tutte le curve di calibrazione abbiano un valore di correlazione di almeno 0,998.
    3. Determinare la precisione e la precisione (intra e inter-run) per l'alita nella matrice surrogata utilizzando repliche a quattro diversi livelli LLOQ, controllo basso, medio e di alta qualità in cinque o sei giorni diversi. Eseguire misurazioni di precisione e precisione intra-run lo stesso giorno nei supporti di coltura cellulare DMEM S o Williams E S diluiti in tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) contenente concentrazioni APAP 0,50, 4,50, 45,00 e 90,00 μM (n= 3).
    4. Valutare ogni serie di campioni di controllo qualità contenenti le concentrazioni apap delle curve di calibrazione ottenute di recente. Testare la selettività dei saggi per il grado di separazione del composto di interesse e possibili altri picchi cromatografici causati da componenti interferenti.
  4. Limite inferiore di quantificazione (LLOQ) e limite di rivelazione (LOD)
    1. Determinare il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) in base alla deviazione standard della risposta e all'approccio di pendenza. Calcolare utilizzando la formula 10α/S, dove α è la deviazione standard di y-intercept e S è la pendenza della linea retta ottenuta tracciando le curve dicalibrazione 29,30. Stimare il limite di rilevamento (LOD) tenendo conto 3,3 volte la deviazione standard del pezzo grezzo, diviso per la pendenza della curva dicalibrazione 29,30.

6. Vitalità/funzionalità equivalenti dei tessuti

  1. Mtt
    1. Eseguire un test MTT per valutare la fattibilità organoide in tutti i punti di tempo del saggio MPS. Come controllo negativo, usa i supporti cellulari più il veicolo. Come controllo positivo, trattare gli organoidi con APAP da 100 mM e NaOH all'1% diluito in mezzo cellulare.
    2. Trasferire i 20 sferoidi di ogni replica per singoli pozzi in una piastra di 96 pozza, e gli inserti di coltura cellulare, contenenti gli equivalenti intestinali, a 24 piastre ben cellulari, posizionando un intestino equivalente per pozzo. Lavare gli equivalenti tissutali tre volte con 1x DPBS.
    3. Aggiungere 300 μL di una soluzione di MTT da 1 mg/mL, diluita nel rispettivo mezzo cellulare, per pozzo. Incubare le piastre per 3 ore in condizioni standard di coltura cellulare.
    4. Rimuovere la soluzione MTT da ogni pozzo con attenzione tubazione. Estrarre MTT formazan dall'intestino e equivalenti epatici utilizzando 200 μL di isopropanolo per pozzo durante la notte a 4 °C.
      NOTA: Sigillare il coperchio per evitare l'evaporazione.
    5. Trasferire 200 μL di ogni supernatante al rispettivo pozzo pre-identificato in una piastra di prova micro di 96 po' . Utilizzare isopropanolo come vuoto.
    6. Leggi l'assorbanza formazan in un lettore di lastre a 570 nm. Calcolare la capacità relativa delle celle di ridurre l'MTT (%) utilizzando la densità ottica media di ogni punto di tempo, rispetto al controllo negativo, considerato come vitalità cellulare al 100%.
  2. Citochimica/Istologia
    1. Fissare l'intestino e gli equivalenti epatici, per 25 minuti a temperatura ambiente, utilizzando il 4% (w/v) di paraformaldeide in tampone fosfato-salina da 0,1 M, pH 7,4. Lavare gli organoidi 5 volte in tampone PBS per 10 minuti ogni volta. Macchiare gli equivalenti intestinali e epatici con isotiocianato-felloidina tetrametillrodamina o Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 in PBS31.
    2. Trasferirli sul mezzo di congelamento OCT per alcuni minuti per acclimatarli a RT prima di trasferirli in azoto liquido fino al congelamento completo. Eseguire criosezioni di sferoidi epatici spessi circa 10-12 μm, usando un criostato.
    3. Montare le sezioni dei tessuti in mezzo di montaggio con DAPI. Esaminarli con microscopia a fluorescenza confocale.
    4. Congelare gli organoidi dopo la fissazione per eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina secondo i protocolli stabiliti. Montare le diapositive con il supporto di montaggio dopo aver affettato il tessuto come descritto sopra e scattare immagini istologiche utilizzando un microscopio ottico.
  3. Analisi ad alto contenuto
    1. Colorazione mitocondriale e nucleare delle cellule
      1. Ricostituire la polvere liofilizzata in DMSO per creare una soluzione di brodo di colorazione mitocondriale da 1 mM (ad esempio, MitoTracker Deep Red FM). Conservare la soluzione di magazzino aliquota a -20 °C protetta dalla luce. Diluire la soluzione di 1 mM di materiale di colorazione mitocondriale alla concentrazione finale (200 nM) nel mezzo di coltura tissutale prebellica (37 °C) senza siero.
      2. Rimuovere il supporto delle impostazioni cultura delle celle. Aggiungere la soluzione di colorazione mitocondriale per coprire completamente il campione e incubare le cellule per 15-45 min a 37 °C in atmosfera umidificata con 5% di CO2.
      3. Rimuovere con cura la soluzione di lavoro di colorazione mitocondriale e sostituirla con il 2-4% di paraformaldeide fissante in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
      4. Risciacquare delicatamente le cellule fisse con PBS per 5 minuti. Ripetere il processo di lavaggio due volte.
      5. Preparare una soluzione di 10 mg/mL (16,23 M) per la colorazione dell'acido nucleico sciogliendo 100 mg di colorante Hoechst 33342 in 10 mL di acqua ultrapura.
        NOTA: La soluzione stock deve essere aliquota e conservata protetta dalla luce a -20 °C.
      6. Preparare una soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico 0,2-2,0 μg/mL in PBS e incubare le cellule fissazionate con soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico per 10 minuti a temperatura ambiente.
      7. Rimuovere la soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico e sciacquare delicatamente le cellule con PBS per 5 minuti tre volte. Le cellule devono essere conservate in PBS a 4 °C, protette dalla luce.
    2. Analisi della colorazione mitocondriale e nucleare
      1. Analizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza con set di filtri appropriati per la macchia di acido nucleico (λEx/ λEm: 361/497 nm) e la macchia mitocondriale (λEx/ λEm: 644/665 nm). Trovare le cellule per colorazione positiva dell'acido nucleico e quantificare il numero di cellule. Quantificare l'intensità della fluorescenza della macchia mitocondriale nei mitocondri.
  4. Misurazioni morfometriche (calcoli di sferoidi) in ImageJ
    1. Esportare immagini HCA (High Content Analysis) come file *.flex dal software Columbus. Importare file flex come scala di grigi in ImageJ utilizzando il plug-in Bio-Formats32: File > Importa > Biosi formati.
    2. Nella finestra Opzioni importazione selezionare Visualizzazione Hyperstack e abilitare Dividi canali in Dividi in finestre separate. Questa opzione consentirà l'accesso a tutti i file in un particolare canale (ad esempio, DAPI, mitotracker, ecc.). Non selezionare Usa stack virtuale in Gestione memoria.
      NOTA: È preferibile utilizzare il canale DAPI come "polvere" nelle immagini poiché il mezzo di coltura è ridotto nella lunghezza d'onda UV (ad esempio, 405 nm).
    3. Regolare la dimensione dei pixel( Analyze > Impostascala ) se non è stata caricata in base ai valori incorporati nel file flex. Applicare un filtro Sfocatura gaussiana per rimuovere l'eccesso di rumore ed evitare irregolarità nel contorno della forma. Processo > Filtri > Sfocatura gaussiana. Un valore elevato di Sigma (raggio) compreso tra 2,0 e 3,0 è ideale per la maggior parte dei casi. Se lo stack ha più immagini, applicatele a tutte (selezionate Sì nella finestra Stack processo).
    4. Generare un'immagine binaria per separare lo sfondo e gli organoidi (oggetti) utilizzando una soglia. Fare clic su Immagine > Regola > Soglia. Utilizzare la maschera rossa per regolare i valori in base all'intensità dell'immagine, per adattarsi alla forma organoide, mantenendo intatta la morfologia. Disabilitare lo sfondo scuro se l'immagine ha uno sfondo bianco. Fare clic su Applica.
    5. Nella finestra Converti stack in binario scegliere il metodo Threshold. Di solito, Default o Triangle sono preferiti in questo tipo di elaborazione delle immagini. Mantenere lo sfondo scuro . Selezionare Calcola soglia per ogni immagine se nello stack sono disponibili più immagini.
    6. Selezionate Processo (Process) > Binario (Binary) > Riempi fori (Fill holes). Facoltativamente, rimuovere i fori dallo sfondo. In Processo (Process) > Binario (Binary) > Opzione (Options), selezionate Sfondo nero (Black background) ed eseguite nuovamente Fill Holes. Disattivare l'opzione Sfondo nero prima di procedere al passaggio successivo.
    7. Oggetti separati. Per gli organoidi, il metodo spartiacque è una buona scelta. Selezionate Processo (Process) > Binario (Binary) > Spartiacque (Watershed). Eseguire l'analisi della forma.
      1. Selezionare Analizza > Imposta misure. Sono disponibili diverse opzioni (dettagli in https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Per gli organoidi, selezionare Area, Valore grigiomedio , Valore grigio minimo e massimo e Descrittori forma. Facoltativamente, selezionare Visualizza etichetta per identificare gli oggetti nell'immagine e Notazione scientifica. Fare clic su OK.
      2. Selezionate Analisi (Analysis) > Analizza particelle (Analyze Particles). Scegliete i limiti Dimensioni e Circolarità. Mantieni rispettivamente 0-infinito e 0,00-1,00 per misurare tutti gli oggetti nell'immagine. In Mostrascegliere Contorni in modo che gli oggetti siano identificati. Abilitare i risultati di visualizzazione per l'output dei risultati; Escludere sui bordi per escludere gli oggetti che toccano i bordi; Includere fori in modo che eventuali fori interni negli oggetti siano considerati parte della forma principale.
    8. Ripetere l'analisi delle forme per ogni stack di immagini e i risultati verranno aggiunti in un'unica tabella. Esportare la tabella dei risultati nel file > Salva con nome... come file .csv(comma separated values).
  5. PCR in tempo reale
    1. Estrarre l'RNA dagli equivalenti tissutali utilizzando una soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidina, seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire la sintesi cDNA per trascrizione inversa di 1 - 2 μg di RNA totale.
    3. Amplificare tutti gli obiettivi utilizzando primer specifici del gene (Tabella 5) per eseguire PCR quantitativi in tempo reale. Ogni qRT-PCR contiene 30 ng di RNA trascritto inversamente e 100 nM di ogni primer.
    4. Seguire le condizioni PCR: 50 °C per 3 minuti (1 ciclo); 95 °C per 5 minuti (1 ciclo); 95 °C per 30 secondi, 59 °C per 45 secondi e 72 °C per 45 secondi (35 - 40 cicli).
  6. Saggio CYP
    1. Seguire la sezione 2.2 per l'assemblaggio epatico 2-OC. I gruppi sperimentali sono il controllo no-cell, i trattamenti APAP 2 μM per 12 h, 24 ore e il controllo del veicolo. Seguire le sezioni 3.3 e 4.2 per la preparazione e il trattamento APAP 2 μM.
      NOTA: Per assicurarsi che tutti i campioni siano pronti contemporaneamente per il test CYP, iniziare il trattamento di 12 ore 12 ore dopo l'inizio del trattamento di 24 ore. Trattare il controllo no-cell dell'attività CYP con una soluzione di etanolo dello 0,5%, nonché il controllo del veicolo.
    2. Scongelare la soluzione di substrato luminogenico da 3 mM a temperatura ambiente e effettuare una diluizione 1:1000 in E S. Protect from light di William.
    3. Raccogli gli sferoidi e trasferisci ogni gruppo sperimentale in un pozzo di una piastra da 96 po '. Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 100 μL di 1x DPBS e aggiungere 80 μL di soluzione di substrato 3 μM per pozzo. Mantieni il controllo senza cellule nel mezzo E S di William. Salvare un pozzo senza sferoidi o soluzione di substrato per un controllo dello sfondo. Incubare per 30-60 min a 37 °C con 5% CO2,protetto dalla luce.
    4. Equilibrare il reagente di rilevamento della luciferina liofilizzato (LDR) utilizzando il buffer di ricostituzione con esterase. Mescolare ruotando o invertendo. Conservare il volume appropriato a temperatura ambiente fino al passaggio successivo.
      NOTA: LDR ricostituito può essere conservato a temperatura ambiente per 24 ore o a 4 °C per 1 settimana senza perdita di attività. Per lo stoccaggio a lungo termine, conservare a -20 °C.
    5. Trasferire 25 μL di supernatante intatto degli sferoidi in tre diversi pozzi di una micropiatta bianca opaca da 96 po' , dopo l'incubazione. Aggiungere 25 μL di LDR per pozzo e omogeneizzare.
    6. Incubare la piastra bianca a temperatura ambiente per 20 minuti. Leggi la luminescenza su un luminometro. Non usare un fluorometro.
    7. Calcola i segnali netti sottraendo i valori di luminescenza di fondo (controllo senza cella) dai valori del composto di prova trattato e non trattato (controllo del veicolo). Calcolare la variazione percentuale dell'attività CYP3A4 dividendo i valori netti trattati per i valori netti non trattati e moltiplicando per 100.
  7. Gonfiore occidentale
    1. Trasferire gli sferoidi epatici su un microtubo identificato da 1,5 mL. Rimuovere il mezzo e lavare due volte con 100 μL di 1x DPBS.
    2. Llysate gli sferoidi epatici in 100 μL di tampone RIPA di lysis cellulare a 4 °C per 20 min. Centrifuga per 15 min, 4 °C e 11000 giri/min. Trasferire il supernatante su un altro microtubo identificato da 1,5 mL.
    3. Quantificare la quantità di proteine ottenute attraverso il metodo di Bradford. Caricare tra i 10 e i 50 μg di proteine dal lysato cellulare quantificato per pozzo di un gel di poliacrilammide gradiente 3-15% ed eseguire un SDS-PAGE.
    4. Trasferire la proteina caricata dal gel a una membrana PVDF da 0,22 μm attraverso l'apparecchiatura del sistema semi-secco. Utilizzare una soluzione di transfernza di 50 mM Tris-HCl e 192 mM di glicina. Impostare i parametri dell'apparecchiatura in base al numero di gel da trasferire (da 1 a 2 alla volta).
    5. Blocca le interazioni non specifiche sulla membrana PVDF con una soluzione di latte scremato al 3-5% nel tampone TBS-T: Salina tris-tamponata (50 mM Tris pH 7,6, cloruro di sodio da 150 mM) integrata con lo 0,1% di Tween 20. Mantenere la membrana sotto agitazione delicatamente costante per 1 ora a temperatura ambiente.
    6. Lavare con TBS-T sotto agitazione delicatamente costante per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
    7. Diluire gli anticorpi primari di albumina e vinculina rispettivamente a 1:1000 e 1:2000 su TBS-T. Incubare la membrana con anticorpi primari durante la notte a 4 °C, sotto tremori delicatamente costanti.
      NOTA: Seguire sempre le istruzioni del produttore per diluire gli anticorpi.
    8. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare la membrana 3 volte (fase 6.7.6). Diluire l'anticorpo secondario IgG anti-topo ECL a 1:5000 su TBS-T. Incubare la membrana con un anticorpo secondario sotto scuotimento delicatamente costante per 2 ore a temperatura ambiente.
    9. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare la membrana (fase 6.7.6). Eseguire il rilevamento delle proteine utilizzando ECL Western Blotting Substrate. Esporre i film autoradiografici da 30 a 30 minuti. Eseguire il rilevamento dell'immunoblotting in triplice copia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per eseguire i test PK APAP nelle MPS a 2-OC, il primo passo è produrre l'intestino umano e gli equivalenti epatici (organoidi). Sono integrati nel dispositivo microfluidico 2-OC (Figura 1A) 24 ore prima dell'inizio del test APAP PK. Il giorno successivo, il supporto viene modificato e il modello viene esposto all'APAP. La figura 1 illustra gli equivalenti intestinali e epatici collocati all'interno del dispositivo 2-OC (Figura 1B) e del corso di tempo dell'esperimento APAP PK (Figura 1C). Abbiamo eseguito un test MTT, misurazioni TEER, HCA, PCR in tempo reale, gonfiore occidentale, istologia e microscopia a fluorescenza confocale in coltura 2D e organoidi 3D per verificare la vitalità del tessuto e rilevare possibili effetti tossici APAP. Nelle immagini della microscopia a fluorescenza confocale, i campioni equivalenti dell'intestino macchiati di DAPI e Phalloidin (rispettivamente per nuclei e actina) sono stati presentati come una barriera contigua per i campioni non trattati(figura 2A)e i campioni trattati con APAP da 12 μM(figura 2B). Come si è visto nella figura 2C, il saggio MTT ha mostrato livelli relativi di vitalità cellulare superiori al 70%, indicando l'assenza di effetti citotossici rilevanti in risposta all'esposizione all'APAP a una concentrazione di 12 μM33,34,35,36,37. Il controllo positivo (100 mM) ha indotto una morte cellulare significativa (sopravvivenza inferiore al 5%). La vitalità del Caco-2/HT-29 e la corretta differenziazione, nonché l'integrità della barriera equivalente all'intestino sono state verificate dall'evoluzione del TEER durante il periodo didifferenziazione (Figura 2D). L'APAP non ha causato alcuna modifica ai valori di TEER, come illustrato nella figura 2E. Sono state analizzate l'espressione dei trasportatori attivi di glucosio accoppiato al sodio SLC5A1, del trasportatore multifarmaco MDR1 e dell'ATPasi sodio-potassio, per verificare l'impatto del trattamento APAP sulla formazione di barriere cellulari e sulla funzionalità basale. Come dimostrato nella figura 2F–H, sia gli equivalenti intestinali non trattati che gli equivalenti dell'intestino trattato con APAP hanno mostrato un'espressione simile di SLC5A1 e NaKATPase. La somministrazione orale di 12 μM indotta da APAP ha segnato un aumento dei livelli di mRNA MDR1 negli equivalenti intestinali dopo 24 ore(Figura 2H). Abbiamo anche eseguito HCA di cambiamenti fenotipici cellulari da una miscela di coloranti al fluoroforo per nuclei e contenuto di massa mitocondriale. I controlli positivi sono stati 100 mM APAP e 1% NaOH.

Inoltre, abbiamo analizzato se 12 μM APAP potrebbero indurre citotossicità alla co-coltura 2D Caco-2/HT-29. Le immagini delle cellule intestinali acquisite con microscopia a fluorescenza mostrate nella figura 2I confermano i dati MTT, che hanno dimostrato che 12 μM APAP non hanno causato una citotossicità significativa negli equivalenti intestinali Caco-2/HT-29.

La valutazione della vitalità basale degli sferoidi epatici e della citotossicità in risposta all'APAP da 2 μM è stata effettuata mediante test MTT e analisi morfologiche mediante microscopia a fluorescenza confocale, istologia H&E e test HCA. Come mostrato nella figura 3A, il saggio MTT non è stato in grado di identificare alcuna citotossicità rilevante in risposta al trattamento APA da 2 μm in campioni prelevati dall'assemblaggio Liver 2-OC in condizioni sia statiche che dinamiche. La vitalità cellulare è diminuita ma è rimasta superiore all'80% sia per i punti di tempo di 12 ore che per 24 ore33,34,35,36,37. I trattamenti di controllo positivo (100 mM APAP e 1% NaOH) hanno indotto danni significativi ai tessuti (vitalità inferiore al 10%). Immagini confocali microscopiche indicano l'assenza di un centro necrotico negli sferoidi epatici sia in condizioni di trattamento basale che APAP, e nessuna prova di tassi di mortalità significativi(Figura 3B-C). Tuttavia, quando abbiamo analizzato più cambiamenti fenotipiche cellulari a seguito della somministrazione del veicolo o di 2 μM APAP nella cocultura 2D HepaRG/HHSteC attraverso il test HCA, utilizzando 100 mM APAP (C +) come controllo positivo, contraddicendo i risultati del saggio MTT, le cellule epatiche hanno dimostrato risposte citotossiche precoci al trattamento APAP da 2 μM (Figura 3D). Dopo 24 ore, c'è stata una diminuzione del numero di cellule, nell'area nucleare e un aumento della massa mitocondriale. Inoltre, un cocktail di colorante al fluoroforo contenente Hoechst 33342 e MitoTracker Deep Red è stato utilizzato per macchiare gli sferoidi epatici 3D (Figura 3J). Il software Fiji è stato utilizzato per valutare l'omogeneità dell'architettura sferica 3D tra diversi sferoidi (Figura 3E-I). Il grafico mostrato nella figura 3E mostra la somiglianza tra l'area totale degli sferoidi epatici. Le proporzioni (Figura 3F) intorno a 1 significano assenza di distorsione durante il processo di confezione degli sferoidi. La valutazione ha anche indicato che la maggior parte degli sferoidi erano approssimativamente arrotondati(figura 3G). La valutazione del perimetro morfologico e della distribuzione cellulare è stata effettuata rispettivamente per circolarità (figura 3I) e per calcolo della solidità (figura 3H). Abbiamo concluso che la metodologia per la fezione degli sferoidi epatici aveva generato organoidi con un perimetro liscio, compatibile con la crescita sferica, senza pregiudizi o necrosi durante il processo.

Come dimostrato nella figura 4A-B, gli sferoidi epatici hanno mostrato rispettivamente un alto livello basale relativo di albumina ed espressione di mRNA GST, indicando una corretta funzionalità basale. Tuttavia, il trattamento APAP da 2 μM per 24 ore ha indotto una diminuzione dei livelli di espressione dell'albumina e dell'mRNA GST, suggerendo compromissione funzionale degli sferoidi epatici a 24 ore di trattamento APAP.

Il rilevamento dei livelli di espressione di mRNA CYP3A4 e UGT1A1 dimostra la capacità metabolica degli equivalenti epatici. Il livello basale di mRNA CYP3A4(Figura 4C)era coerente con i rapporti precedenti6. Il trattamento APAP ha indotto una tendenza alla diminuzione sia dell'espressione cyp3A4 mRNA che dell'espressione UGT1A1 in risposta al trattamento APAP (Figura 4C-D) confermando ancora una volta l'ipotesi di compromissione funzionale degli sferoidi epatici a 24 ore dal trattamento APAP.

Inoltre, sono stati eseguiti esperimenti di gonfiore occidentale e attività enzimatica in vitro al fine di analizzare l'espressione della proteina dell'albumina, così come l'attività cyp 3A4 negli equivalenti epatici in condizioni basali e di trattamento APAP. La Corte ha riscontrato che il trattamento APAP da 2 μM eseguito presso la MPS Liver 2-OC ha indotto una riduzione dell'espressione di albumina totale equivalente al fegato a 12 ore e 24 ore in condizioni sia statiche(Figura 4E) che dinamiche (Figura 4F). D'altra parte, campioni di equivalenti epatici provenienti da condizioni dinamiche hanno dimostrato la tendenza a presentare livelli più elevati di espressione proteica dell'albumina rispetto alle condizioni statiche (Figura 4G). Il test IN VITRO CYP 3A4 eseguito su equivalenti epatici da MPS Epatica 2-OC ha dimostrato che il trattamento APAP da 2 μM per 12 h o 24 ore era in grado di indurre una compromissione robusta e significativa dell'attività del CYP 3A4 sia in condizioni statiche che dinamiche(Figura 4H-I). Più interessante, la presenza di flusso mediale (dinamico) ha indotto un significativo miglioramento dei livelli di attività degli equivalenti epatici CYP 3A4 rispetto alle condizioni in cui gli equivalenti epatici sono stati mantenuti in assenza di mezzo circolante (condizioni statiche)(Figura 4J).

Per trovare le condizioni analitiche più sensibili per quanto riguarda l'analisi HPLC, sono stati studiati diversi parametri tra cui la composizione della fase mobile, il tipo e la concentrazione di additivi. Si è scoperto che l'acetonitrile dava una migliore risoluzione del cromatogramma e un tempo di ritenzione adeguato rispetto al metanolo. La separazione rapida e riproducibile dell'APAP è stata ottenuta utilizzando una colonna in fase invertita C18. Il valore del tempo di conservazione APAP (Rt) è stato di 9,27 ± 0,19 minuti. La selettività per l'APAP è indicata dalla forma e dalla risoluzione simmetrica del picco, così come dalla mancanza di picchi interferenti dai supporti di coltura cellulare DMEM e Williams.

Per costruire le curve di calibrazione sono state utilizzate concentrazioni standard APAP nei supporti di coltura cellulare DMEM S e Williams E S diluiti con tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) che vanno da 0,25 a 100,00 μM. La linearità del metodo è stata determinata a nove livelli di concentrazione. I dati sono riportati nella tabella 2 e nella tabella 3. La relazione tra la concentrazione di APAP e le aree di picco è stata descritta dalle equazioni di regressione lineare: y = 16106*x + 3579,8 (R2=1, nel mezzo DMEM) e y = 16397*x + 2475,1 (R2=1, nel mezzo di Williams), in cui "x" è la concentrazione nominale APAP in μM e "y" è l'area di picco del cromatogramma dell'APAP in UA. Al limite superiore di quantificazione (cioè 100,00 μM), la deviazione percentuale e i valori di variabilità inter-corsa erano inferiori al 2,50%. L'accuratezza e la precisione per nove livelli di concentrazione, esclusi gli 0,50 μM (LLOQ), rientravano in un intervallo accettabile con valori DEV e C.V. inferiori al 7,00%(tabella 2 e tabella 3).

L'accuratezza e la precisione inter-e intra-run del metodo analitico, a quattro concentrazioni testate, rientravano nei criteri generalmente accettati per i saggi bioanalitici. La riproducibilità del metodo è stata valutata analizzando le repliche dei campioni di controllo qualità APAP di 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 e 90,00 μM. I risultati medi intra-run e inter-run sono riportati nella tabella 4. L'accuratezza e la precisione del saggio sono dimostrate dai valori DEV ≤ 15,00% e dai valori C.V. ≤ 7,00%, rispettivamente.

Lod è stato determinato come il campione il cui rapporto segnale-rumore (S/N) era appena maggiore di 3 e corrispondeva a un APAP da 0,25 μM. D'altra parte, il LLOQ, stimato con campioni APAP da 0,50 μM, mostrava un rapporto S/N pari a 10. Inoltre, abbiamo trovato valori di precisione (DEV%) entro il ≤ 19,00% dei valori nominali di concentrazione. Le variabilità intra e inter-run sono state dimostrate da C.V. ≤ 18,77%, come indicato nella tabella 2, tabella 3 e tabella 4)29,30.

Le analisi APAP PK sono state eseguite in tre diversi gruppi di MPS a 2-OC: 1) Intestino 2-OC, contenente solo l'equivalente intestinale; 2) Fegato 2-OC, contenente solo gli sferoidi epatici e 3) Intestino/Fegato 2-OC con barriera intestinale e sferoidi epatici.

Per gli studi di assorbimento, la via orale è stata mimickata dalla somministrazione di 12 μM APAP sul lato apicico equivalente dell'intestino. Le concentrazioni di APAP sono state misurate da HPLC/UV, nei campioni medi, raccolti da lati apicali e basolaterali equivalenti intestinali, sia in condizioni statiche che dinamiche. La cinetica APAP nel mezzo raccolto dai lati apicali e basolaterali ha dimostrato che il modello intestinale era in grado di assorbire l'APAP. Vi è stata una progressiva diminuzione della concentrazione di APAP nel lato apicali (Figura 5A) in concomitanza con l'aumento della concentrazione di APAP sul lato basolaterale intestinale (Figura 5B). Le concentrazioni massime (Cmax) nel mezzo erano di circa 2 μM sia per le condizioni statiche che dinamiche, dopo 12 ore di somministrazione (Tmax).

Per gli studi sul metabolismo, la somministrazione endovenosa è stata minato dall'applicazione di 2 μM APAP nel mezzo del compartimento epatico. La cinetica di concentrazione APAP nel supporto in condizioni sia statiche che dinamiche indicava che solo alle condizioni dinamiche potevano essere rilevate le diminuzioni della concentrazione di APAP, raggiungendo 0,87 μM APAP 12 h dopo 2 μM di somministrazione APAP (T1/2 = 12 h). Gli equivalenti epatici hanno mostrato un'efficienza metabolica minima in condizioni statiche(figura 5C). La concentrazione di APAP ha raggiunto 1,7 μM 12 h dopo la somministrazione di APAP. La valutazione integrata, sistemica come l'assorbimento apap e il metabolismo è stata eseguita nel modello intestino/fegato 2-OC. L'APAP è stato somministrato sul lato apicico dell'equivalente intestinale, emulando la via orale. Campioni medi sono stati raccolti da entrambi i lati intestinali e anche dal compartimento epatico. La figura 5D mostra il progressivo decadimento della concentrazione apap sul lato apicico sia in condizioni statiche che dinamiche.

La figura 5E mostra fasi di assorbimento e metabolismo distinguibili. Il flusso ha anche avuto un impatto sull'assorbimento intestinale. L'APAP Cmax nel mezzo è cambiato da 2 μM sull'assieme "Intestino 2-OC" (Figura 5B) a 1,7 μM per il dinamico "Intestino/Fegato 2-OC" (Figura 5E). La figura 5F mostra un confronto diretto tra il profilo concentrazione-tempo dell'APAP nel nostro sistema microfisiologico dinamico "Intestino/Fegato 2-OC" (curva rossa e asse y) e un profilo rappresentativo ottenuto nell'uomo dopo una singola dose orale di 1000 mg (curva nera e asse y).

Figure 1
Figura 1: Compilazione schematica dei gradini per gli studi PK nelle MPS 2-OC. A) Disegno schematico della MPS a 2 OC, che mostra gli equivalenti del tessuto umano intestinale ed epatico nella vista dal basso verso l'alto. B)Fotografia MPS a 2 OC con gli equivalenti intestinali e epatici integrati nel dispositivo in vista bottom-up, con immagini di microscopia ottica rappresentative. C) Cronologia delle fasi di preparazione degli equivalenti tissutali, trattamento APAP e raccolta dei mezzi di coltura per la produzione di organoidi e valutazioni farmacocinetiche e tossicologiche. Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fattibilità e valutazione tossicologica degli equivalenti intestinali. A) Immagini rappresentative di microscopia a fluorescenza confocale di cellule Caco-2/HT-29 non trattate macchiate di nuclei cellulari e filamenti di actina colorante fluorescente (rispettivamente DAPI e Phalloidin); Ingrandimento 63x, zoom 2.6. B)Immagini rappresentative di microscopia a fluorescenza confocale di cellule Caco-2/HT-29 trattate con APAP da 12 μM per 24 ore, macchiate di nuclei e filamenti di actina colorante fluorescente (rispettivamente DAPI e Phalloidin); Ingrandimento 63x, zoom 2.6. C)La valutazione della redditività dell'intestino equivalente mediante saggio MTT in condizioni sia statiche che dinamiche. I valori rappresentati dalle barre nel grafico sono calcolati in percentuale rispetto al controllo del veicolo (punto di tempo denominato 0)*P<0,05 0 rispetto al trattamento. D)Evoluzione del TEER durante i 21 giorni di differenziazione. *P<0,05 giorno 1 rispetto ad altri giorni. E) Valori TEER dopo somministrazione APAP nell'intestino 2-OC MPS in condizioni dinamiche. Espressione genica nell'intestino equivalenti. Il potenziale di assorbimento della barriera intestinale e i possibili effetti di 12 μM APAP per 24 h in condizioni dinamiche sono stati verificati dall'espressione SLC5A1 (F), Na-K-ATPasi (G) e MDR1 (H). I valori rappresentano la ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Il risultato è espresso come rapporto con le pulizie GAPDH. *P<0.05 veicolo vs APAP. I) HCA basato su immagini Operetta eseguita dal Columbus® 2.4.0. Software. Immagini rappresentative della co-coltura dell'intestino 2D in diversi punti di tempo dopo il trattamento APAP da 12 μM. I controlli negativi erano medi (0 h) o veicoli (0,5% di etanolo). Controlli positivi mostrati qui è l'APAP da 100 mM. Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Fattibilità e valutazione tossicologica degli equivalenti epatici. A)Valutazione della fattibilità equivalente al fegato mediante saggio MTT in condizioni sia statiche che dinamiche. I valori rappresentati dalle barre nel grafico vengono calcolati in percentuale rispetto al controllo del veicolo (punto di tempo denominato 0) *P<0,05 0 rispetto al trattamento. B)Rappresentanti immagini confocali catturate dal veicolo e sferoidi epatici trattati con 2 μM APAP 24 ore da una sezione interna. C)Rappresentanti H&E (colorazione ematossilina ed eosina) catturate dal veicolo e sferoidi epatici trattati da 2 μM APAP 24 ore da una sezione interna. Barra di scala = 50 μm. D) Immagini rappresentative della cocoltura epatica 2D in diversi punti di tempo dopo 2 μM di trattamento APAP. In queste analisi sono stati presi in considerazione campioni trattati con veicolo e con APAP da 2 μM. La miscela di coloranti al fluoroforo include Hoechst per la colorazione nucleare e Mitotracker Deep Red per la colorazione di massa dei mitocondri. I controlli negativi erano medi (0 h) o veicoli (0,5% di etanolo). I controlli positivi sono stati di 100 mM APAP. Le misurazioni di intere immagini di sferoidi catturate sono state eseguite utilizzando il software Fiji. E) Distribuzioni di frequenza dell'area F) proporzioni, G) rotondità, H) solidità, I) circolarità. N = 85. *p < 0,05. J) Immagini rappresentative di sferoidi epatici 3D acquisiti dall'Operetta utilizzando l'obiettivo LWD 10x. Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: La vitalità/funzionalità epatica e i possibili effetti di 2 μM APAP in condizioni statiche e dinamiche su di esso sono stati verificati dall'espressione genica e proteica e dall'attività enzimatica. A) espressione genica dell'albumina. B)Espressione genica GSTA2. La capacità epatica di eseguire il metabolismo di fase I e fase II e i possibili effetti di 2 μM APAP per 24 h in condizioni dinamiche su di esso sono stati verificati rispettivamente dall'espressione genica di CYP3A4 (C) e da UGT1A1 (D). E) Espressione totale della proteina dell'albumina in condizioni statiche. F) Espressione totale delle proteine dell'albumina in condizioni dinamiche. Condizione. G)Grafico comparativo che illustra la differenza nell'espressione totale dell'albumina negli equivalenti epatici coltivati e trattati in condizioni statiche o dinamiche. H) CYP 3A4 attività enzimatica in vitro in condizioni statiche. I) CYP 3A4 attività enzimatica in vitro in condizioni dinamiche. J)Grafico comparativo che illustra la differenza nell'attività del CYP 3A4 negli equivalenti epatici coltivati e trattati in condizioni statiche o dinamiche. I valori rappresentano la ± SEM di tre esperimenti indipendenti. I dati dell'espressione genica sono espressi come rapporto con le pulizie GAPDH. I dati dell'espressione proteica sono espressi come rapporto con la proteina della vinculina. *P<0.05 trattamento veicolo vs APAP. Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi della farmacocinetica APAP nelle MPS a 2-OC. Profilo di assorbimento APAP dopo somministrazione apap da 12 μM sul lato apicico della preparazione delle MPS intestine 2-OC. La barriera intestinale era fatta di una cocoltura di linee cellulari Caco-2/HT-29 (A) Concentrazioni apap statiche e dinamiche nel mezzo dal lato apicale (che rappresenta il lato del lume intestinale umano). (B) Concentrazioni di APAP statiche e dinamiche nel mezzo dal lato basolaterale (che rappresentano il lato del flusso sanguigno intestinale umano). *P<0.05 condizioni statiche e dinamiche. C) Profilo del metabolismo APAP nelle MPS epatiche 2-OC da sferoidi epatici HepaRG/HHSTeC. Confronto delle condizioni statiche e dinamiche dopo una somministrazione APAP di 2 μM nel mezzo. *P<0.05 0h vs 6 h, 12 h e 24 h trattamento APAP. Profilo di assorbimento e metabolismo APAP dopo somministrazione di 12 μM sul lato apicale della barriera intestinale della preparazione della MPS intestino/fegato 2-OC. Questo emula la via orale. La barriera intestinale era fatta di linee cellulari Caco-2/HT-29 e l'equivalente epatico fatto di sferoidi di linee cellulari HepaRG/HHSTeC. (D) Concentrazioni intestinali/epatiche 2-OC APAP nel lato apicico della barriera intestinale in condizioni statiche e dinamiche. (E) Concentrazioni di APAP intestinali/epatiche 2-OC nel mezzo in condizioni statiche e dinamiche. *P<0.05 condizioni statiche e dinamiche. (F) Confronto tra il profilo concentrazione-tempo dell'APAP nel nostro sistema microfisiologico (curva rossa e asse y) e un profilo rappresentativo ottenuto nell'uomo dopo una singola dose orale di 1000 mg (curva nera e asse y). I dati sono stati estratti dai grafici utilizzando WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sistema HPLC Waters Alliance 2695 (Milford, MA, USA), equipaggiato con pompa quaternaria, gestore di campioni e degasser
Rivelatore Waters 2996 Uv-Vis impostato in intervallo 210-400 nm
Controllo del sistema, acquisizione ed elaborazione dei dati Software di cromatografia Waters Empower 2002
Colonna Luna C18 in fase invertita
(150 x 4,6 mm D.C.; dimensione delle particelle di 5 mm)
Fenomeno
Colonna di guardia Luna C18 in fase invertita (4 x 3 mm)
Fenomeno
Fase mobile Solvente A- Acetonitrile
Solvente B- acetato di ammonio 0,10 M, pH 6,8
Condizioni isocratiche Ore A (%) B (%)
(min.)
15 5 95
Flusso 1,0 mL/min
Volume di iniezione 25 μL
Temperatura 25 °C
Rilevamento APAP UV a 243 e 254 nm
Fase di esecuzione 15 minuti

Tabella 1: Condizioni e parametri da utilizzare per le analisi HPLC-UV di APAP in matrici medie di coltura.

Concentrazione nominale Concentrazione di APAP calcolata (μM) Media (μM) S.D.b C.v. Dev
(μM) (Triplice copia di ogni concentrazione) (μM) (%)e (%)d
Numero del saggio 1 2 3 4 5 6
0,25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46,05
0,50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17,08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0,09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0,03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tabella 2: Variazione inter-corsa : precisione, precisione e linearità dei campioni di curva standard preparati in una miscela di mezzo DMEM con tampone di acetato di ammonio da 0,10 M (1:1, v/v) da sei saggi separati. A
A Una curva lineare è stata adattata ai dati per una risposta(APAP)rispetto alla concentrazione teorica come descritto in Experimental. La concentrazione calcolata è stata ricavata dalla lettura della risposta per ciascun campione standard rispetto alla curva di taratura. Ogni voce (saggio 1-6) corrisponde al valore medio dell'analisi del tripliceto.
b SD= Deviazione standard.
c C.V. (coefficiente di variazione. precisione).
d Precisione (DEV %) = deviazione della concentrazione calcolata dal valore nominale.
Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Concentrazione nominale Concentrazione di APAP calcolata (μM) Nella media S.D.b C.v. Dev
(μM) (Triplice copia di ogni concentrazione) (μM) (μM) (%)e (%)d
Numero del saggio 1 2 3 4 5
0,25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26.03
0,50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14,97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6,85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1,56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0,01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0,05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tabella 3: Variazione inter-corsa – precisione, precisione e linearità dei campioni di curva standard preparati in una miscela di mezzo Williams con tampone di acetato di ammonio da 0,10 M (1:1, v/v) da sei saggi separati. A
A Una curva lineare è stata adattata ai dati per una risposta(APAP)rispetto alla concentrazione teorica come descritto in Experimental. La concentrazione calcolata è stata ricavata dalla lettura della risposta per ciascun campione standard rispetto a una curva di calibrazione. Ogni voce (saggio 1-5) corrisponde al valore medio dell'analisi del triplicato.
b SD= Deviazione standard.
c C.V. (coefficiente di variazione. precisione).
d Precisione (DEV %) = deviazione della concentrazione calcolata dal valore nominale.
Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Media Williams Concentrazione nominale Concentrazione misurata S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-esecuzione (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1,77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8,37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8,57
Inter-run (n=15) 0,50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14,97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2,99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5,88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5,31
Supporto DMEM Concentrazione nominale Concentrazione misurata S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-esecuzione (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6,35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1,04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1,69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4,00
Inter-run (n=12) 0,50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7,75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tabella 4: Precisione e precisione intra-run e inter-run per l'APAP nei campioni di controllo qualità. A
A I dati sono mostrati come medie. SD (deviazione standard). C.V. (coefficiente di variazione. precisione) e precisione (deviazione percentuale. Dev%).
Questa cifra è stata modificata da Marin et al. Assorbimento e metabolismo dell'acetaminofene in un sistema microfisiologico intestino/fegato. Chem Biol Interact. 299, 59-76 (2019).

Primer (5' → 3')
fazzoletto Gene Avanti Invertire
Intestino SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgACggT
Na-K-ATPasi ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC CAgCggTCATCCCAgTCC
MDR1 TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTTgg
Fegato Albumina TgCAAggCTgATAAggAg TTTAgACAgggTgTTggCTTTACAC
GSTA2 CTgAggAACAAgATgCCAAgC AgCAgAgggAaggCTggAAATAAg
CPY3A4 ggAAggTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgTgAAggCTggAg

Tabella 5: Primer qPCR in tempo reale per valutare la trascrizione genica a livello di mRNA nelle colture a 2-OC per tessuti intestini e epatici

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La valutazione accurata e affidabile delle proprietà farmacologiche dei nuovi farmaci investigativi è fondamentale per ridurre il rischio nelle seguenti fasi di sviluppo. L'MPS è una tecnologia relativamente nuova, che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test preclinici. Il nostro gruppo sta avanzando nella valutazione delle proprietà farmacocinetiche e tossicologiche per lo più necessarie per l'ottimizzazione del piombo. Abbiamo lavorato con il dispositivo microfluidico 2-OC, che ha due camere, consentendo l'integrazione di due organoidi. APAP è stato scelto perché ha molti dati umani di alta qualità, è per lo più metabolizzato dal fegato e mostra anche proprietà epatotossiche. Il protocollo di studio mirava ad emulare alcune fasi dello studio clinico di fase I umana, in cui un farmaco viene somministrato per via orale ai volontari, e vengono prelevati campioni di sangue periodici per valutare la concentrazione dei farmaci per conoscere le proprietà farmacocinetiche e vengono raccolti parametri biochimici e clinici per valutare la sicurezza e la tollerabilità. Pertanto, quando l'MPS si evolve abbastanza da fornire previsioni affidabili, ridurrà significativamente il rischio di fallimento nello studio di fase I. Aggiungendo i modelli di malattia in futuro, la stessa ipotesi si applicherà eventualmente alle fasi II e III degli studi clinici.

Tutti gli studi sono stati eseguiti in tre modelli: Intestino 2-OC (somministrazione orale APAP), Fegato 2-OC (somministrazione endovenosa) e Intestino/Fegato 2-OC (somministrazione orale). Il primo modello isola l'assorbimento, il secondo il metabolismo e il terzo integra entrambi. Abbiamo prima prodotto gli organoidi e incorporato nel dispositivo microfluidico, in secondo luogo somministrato l'APAP e raccolto i campioni di supporto, e per ultimo eseguito una serie di test per valutare la vitalità e la funzionalità cellulare e l'impatto tossicologico dell'esposizione APAP. Per gli studi farmacocinetici, abbiamo sviluppato e convalidato un metodo cromatografico per la quantificazione APAP nel mezzo. La convalida è stata conforme alle Linee Guida sulla Validazione del Metodo Bioanalitico per quanto riguarda la specificità, la linearità, il limite di quantificazione (LOQ), il limite di rilevamento (LOD), l'effetto matrice, la precisione e l'accuratezza, come delineato dalla FDA29,30. La specificità è stata stabilita con campioni biologici vuoti, raggruppati e individuali provenienti da due diverse fonti. Il metodo ha funzionato in modo abile durante l'analisi e i dati hanno confermato la capacità di una semplice fase mobile isocratica di separare e quantificare l'APAP.

La vitalità/funzionale degli organoidi dell'intestino e del fegato è stata valutata con diverse tecniche. Per l'equivalente intestinale, la microscopia a fluorescenza confocale (Figura 2A-B), il saggio MTT (Figura 2C), la valutazione dell'espressione genica (Figura 2D-F) o l'esperimento HCA, non ha rilevato alcuna tossicità 24 ore dopo l'esposizione all'APAP. Allo stesso modo, il saggio MTT non ha rilevato insulti tossici indotti dall'APAP in equivalenti epatici (Figura 3A). Tuttavia, la tecnica HCA ha aggiunto la possibilità di rilevare eventi tossici molto precoci (24 ore dopo l'esposizione apap) per le cellule del fegato, mediante l'osservazione di cambiamenti fenotipici cellulari, con alcuni indizi meccanicistici(Figura 3D). D'altro canto, la microscopia a fluorescenza confocale(figura 3B)e l'istologia(figura 3C)si sono dimostrate un utile strumento complementare nello studio dello stato di vitalità degli equivalenti del tessuto umano. Per le cellule del fegato, l'uso simultaneo di diverse tecniche è stato molto vantaggioso. Il saggio MTT, come accennato in precedenza, non è stato in grado di rilevare la citotossicità APAP rilevata dall'HCA 24 ore dopo l'esposizione apap. Le analisi dell'espressione genica hanno valutato la funzionalità dell'intestino(figura 2D-F)e degli organoidiepatici(figura 4A-D ) sia a livello basale che a 24 ore dopo il trattamento con APAP. In condizioni basali, c'erano normali livelli di marcatori intestinali e specifici del fegato, suggerendo una corretta funzionalità. Dopo 24 ore di esposizione all'APAP, c'è stata una downregolazione dell'albumina, livelli di mRNA GST e una tendenza a ridurre l'espressione genica CYP3A4 nei tessuti equivalenti al fegato, indicando la citotossicità precoce apap. Confermando questi risultati, gli esperimenti western di gonfiore hanno dimostrato che la riduzione dell'espressione genica è stata accompagnata anche da una robusta riduzione dell'espressione totale delle proteine dell'albumina epatica in risposta al trattamento APAP (Figura 4E-F), confermando gli insulti tossici imposti al tessuto epatico dall'esposizione all'APAP. Di conseguenza, gli esperimenti di attività enzimatica in vitro hanno mostrato una riduzione robusta e progressiva dei livelli di attività del CYP 3A4 indotti dal trattamento APAP, in equivalenti epatici(figura 4H-I).

Le statistiche morfometriche degli organoidi sono state eseguite sull'immagine J (Figura 3E-I). L'area rivela quanto sia vicina la dimensione 2D a tutti gli organoidi analizzati, che potrebbero essere utilizzati come standardizzazione in questo protocollo in modo che possa essere prodotto un risultato imparziale. I «descrittori di forma» rivelano statistiche corrispondenti precisamente alla morfologia della forma. L'Aspect Ratio è un indice che utilizza l'asse maggiore e minore, quindi i risultati intorno a 1 non indicano alcuna distorsione (cioè una crescita preferenziale) durante la formazione organoide. I valori di rotondità (4 ×[area]/ (π × [asse principale]2)) sono molto sensibili a una crescita preferenziale, che si rivelerebbe come un asse principale. La solidità ([area]/ ([area convessa])) è essenziale per mostrare la morfologia grossolana in quanto non è influenzata da irregolarità nei bordi poiché utilizza l'area convessa (=busta). Le distribuzioni centrato intorno a 1,0 indicano una crescita sferica putativa. Al contrario, la circolarità (4× π [area]/[perimetro]2) è molto sensibile a un perimetro complesso, quindi "cavità" o "tasche" avrebbero un impatto su questo indice. Pertanto, la circolarità intorno a 1 conferma anche la crescita sferica putativa, compatibile con una corretta funzionalità organoide.

I risultati analitici hanno mostrato che le MPS potevano emulare le proprietà di assorbimento e metabolismo dell'APAP, isolate o integrate in una curva paragonabile a quella prodotta in vivo(figura 5F)senza la fase di escrezione. L'assorbimento apap è stato simile dopo somministrazione orale sia ai modelli di MPS intestino che intestino/fegato, sia in condizioni statiche che dinamiche (Figura 5A-B, Figura 5D-E). In entrambi, c'è stata una concentrazione apap diminuisce sul lato apicali concomitante al suo aumento sul lato basolaterale, senza differenze significative per le condizioni statiche e dinamiche. Al contrario, il metabolismo epatico APAP differiva in queste condizioni. I mezzi circolanti nelle MPS sembravano migliorare la capacità metabolica organoide(figura 5C e figura 5E). C'è stato un significativo sottoflusso di decadimento APAP non visto senza flusso. È interessante notare che, invitro, gli esperimenti di attività CYP3A4 confermano l'ipotesi che la presenza di flusso nel sistema aumenti la funzionalità degli equivalenti epatici umani. Come mostrato nel grafico nella figura 4J, l'attività di CYP 3A4 è stata significativamente più elevata negli equivalenti epatici mantenuti sotto flusso sia in condizioni di trattamento basale che APAP. Allo stesso modo, gli equivalenti epatici tenuti sotto flusso (dinamico) hanno mostrato una tendenza ad aumentare l'espressione proteica dell'albumina rispetto a quelli mantenuti senza flusso (statico) sia al basale che alle condizioni trattate con APAP(Figura 4G).

Rispetto al profilo concentrazione-tempo dopo la somministrazione orale di APAP all'uomo, il nostro sistema microfisiologico mostra t1/2 molto più grande (tempo di emifano)(Figura 5F). Questo accade, come accennato in precedenza, perché mentre abbiamo un sistema a due organi con equivalenti intestini e epatici in grado di assorbire e metabolizzare il farmaco, non esiste un rene equivalente all'APAP espellono e ai suoi metaboliti dalcompartimento plasmatico 38. Inoltre, il sistema microfisiologico mostra Cmax (picco di concentrazione plasmatica) più piccolo e tmax più grande (tempo per raggiungere Cmax) rispetto a quello tipicamente osservato per l'uomo(Figura 5F). Questa è una conseguenza delle differenze nella portata degli esperimenti in vitro e in vivo. Nel complesso, ci sono tre principali differenze tra il profilo concentrazione-tempo ottenuto utilizzando il sistema microfisiologico e i profili ottenuti dopo la somministrazione orale di APAP all'uomo: t1/2più grande, Cmax più piccolo e t max piùgrande (Figura 5F). Mentre il t1/2 più grande è dovuto all'assenza di un rene equivalente all'APAP escreto e i suoi metaboliti dall'equivalente plasmatico, Cmax più piccolo e t max piùgrande sono conseguenze della piccola scala dell'esperimento rispetto al corpo umano. Le migliori strategie di scala per la costruzione e il funzionamento di sistemi microfisiologici sono ancora un'area attiva di ricerca ed è improbabile che un unico approccio sia ottimale per tutti isistemi 39. Inoltre, la modellazione matematica o l'apprendimento automatico possono essere utilizzati per applicare correzioni o imparare la mappatura dalla micro scala a scala completa al fine di estrapolare i dati in vitro ottenuti con i sistemi microfisiologici al comportamento in vivo osservatonell'uomo 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Grazie alla Dott.ssa Christie Guguen-Guillouzo, al Dott. Philippe Gripon dell'Unità 522 INSERM e al Dott. Christian Trepo dell'Unità 271 INSERM per l'utilizzo del Materiale Biologico (Cellule Hepa RG) e per averci messo a disposizione per svolgere la ricerca accademica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. User Guide Millicell® ERS-2 Electrical Resistance System. Millipore. , Available from: http://www.merckmillipore.com/BR/pt/life-sciencee-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 6-10 (2016).
  24. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  25. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  26. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  27. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  28. Dollery, C. Therapeutic Drugs. , Churchill Livingstone. London. (1999).
  29. Food and Drug Administration Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-bioanalytical-4252fnl.pdf (2013).
  30. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  31. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  34. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  35. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, OECD guidelines for the testing of chemicals (2018).
  36. OECD, O. E. C. D. OECD. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, OECD guidelines for the testing of chemicals (2016).
  37. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, OECD guidelines for the testing of chemicals (2015).
  38. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  39. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  40. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Tags

Chimica Numero 166 Sistema Microfisiologico Acetaminofene ADMETox Organoidi
Un sistema microfisiologico intestino/fegato per la valutazione farmacocinetica e tossicologica
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter