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Chemistry

Un système microphysiologique intestinal/hépatique pour l’évaluation pharmacocinétique et toxicologique des médicaments

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60184
Automatic Translation
1, 4, 1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1
1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Summary

Nous avons exposé un système microphysiologique (MPS) avec des organoïdes intestinaux et hépatiques à l’acétaminophène (APAP). Cet article décrit les méthodes de production d’organoïdes et d’évaluations des biens pharmacocinétiques et toxicologiques de l’APAP dans le SPM. Il décrit également les analyses de fonctionnalité tissulaire nécessaires pour valider les résultats.

Abstract

On s’attend à ce que les systèmes microphysiologiques (MPS) récemment introduits cultivant des organoïdes humains obtiennent de meilleurs résultats que les animaux dans la phase de tests précliniques du processus de développement de médicaments parce qu’ils sont génétiquement humains et récapitulent l’interaction entre les tissus. Dans cette étude, la barrière intestinale humaine (imitée par une co-culture des cellules Caco-2 et HT-29) et l’équivalent hépatique (imité par des sphéroïdes faits de cellules hepaRG différenciées et de cellules stellates hépatiques humaines) ont été intégrées dans un dispositif microfluidique à puce à deux organes (2 OC) pour évaluer certaines propriétés pharmacocinétiques (PK) et toxicologiques de l’acétaminophène (APAP). Le MPS a eu trois assemblées : intestin seulement 2-OC, foie seulement 2-OC, et intestin/foie 2-OC avec le même média perfusant les deux organoïdes. Pour les évaluations pk, nous avons dosé l’APAP dans les médias à des points de temps prédéfinis après l’avoir administré soit au-dessus de la barrière intestinale (émulation de la voie orale) ou dans les médias (émulsionnant la voie intraveineuse), à 12 μM et 2 μM respectivement. Les échantillons de médias ont été analysés par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) en phase inversée. Des organoïdes ont été analysés pour l’expression de gène, pour des valeurs de TEER, pour l’expression et l’activité de protéine, et puis rassemblés, fixés, et soumis à un ensemble d’évaluations morphologiques. La technique MTT a bien fonctionné dans l’évaluation de la viabilité organoïde, mais les analyses à haute teneur (HCA) ont pu détecter des événements toxiques très tôt en réponse au traitement d’APAP. Nous avons vérifié que le flux de médias n’affecte pas significativement l’absorption apap alors qu’il améliore considérablement la fonctionnalité équivalent foie. L’absorption intestinale humaine d’APAP et le métabolisme hépatique pourraient être imités dans le MPS. L’association entre les données MPS et dans la modélisation silico a un grand potentiel pour améliorer la prévisibilité des méthodes in vitro et fournir une meilleure précision que les modèles animaux dans les études pharmacocinétiques et toxicologiques.

Introduction

En raison des différences génomiques et protéomiques, les modèles animaux ont une valeur prédictive limitée pour plusieurs résultats humains. En outre, ils sont longs, coûteux et éthiquement discutables1. MPS est une technologie relativement nouvelle qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Ce sont des dispositifs microfluidiques cultivant des organoïdes (unités fonctionnelles mimétiques artificielles d’organes) sous flux médiatique qui favorise la communication organoïde-organoïde. Les organoïdes faits de cellules humaines augmentent la pertinencetranslationnelle 2,3,4. On s’attend à ce que mps exécute mieux que les essais animaux parce qu’ils sont génétiquement humains et récapitulent l’interaction entre les tissus. Lorsqu’il sera pleinement fonctionnel, le SPM fournira des résultats plus significatifs, à une vitesse plus élevée et à des coûts et à des risquesmoins élevés 4. De nombreux groupes développent le SPM à plusieurs fins, en particulier des modèles de maladies pour évaluer l’efficacité du médicament.

Le niveau d’exposition est l’un des paramètres les plus critiques pour évaluer l’efficacité et latoxicité des médicaments 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS permet l’intégration organoïde qui imite l’exposition systémique et devrait être plus performante que la culture traditionnelle des tissus humains 2D. Cette technologie peut améliorer considérablement la prédiction de l’absorption intestinale composée et du métabolisme defoie 4.

Un MPS intégrant le modèle équivalent humain de l’intestin et du foie est un bon point de départ, considérant le rôle central de ces deux organes dans la biodisponibilité de drogue et l’expositionsystémique 13,14,15. APAP est un médicament attrayant pour l’étude d’un MPS sans équivalent rénal parce que sa métabolisation se fait principalement par lefoie 16,17.

Le 2-OC est un dispositif microfluidique à deux chambres adapté à la culture de deux tissus/organoïdes équivalents humains différents interconnectés par des microcanaux16. Afin d’imiter une administration orale/intraveineuse humaine in vitro d’un médicament et d’évaluer les effets de la conversation croisée entre l’intestin et les équivalents hépatiques sur la pharmacocinétique APAP, outre la fonctionnalité et la viabilité des organoïdes, trois assemblages MPS différents ont été réalisés : (1) un « Intestin 2-OC MPS » composé d’un équivalent intestinal basé dans un insert culturel contenant une coculture de cellules Caco-2 + HT-29, intégré dans le dispositif 2-OC ; (2) un « Liver 2-OC MPS » composé de sphéroïdes hépatiques faits d’HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) intégré dans le dispositif 2-OC; et (3) un « Intestin/Foie 2-OC MPS » composé de l’équivalent intestinal dans un compartiment de dispositif communiquant avec l’équivalent hépatique dans l’autre par le flux médiatique par les canaux microfluidiques.

Tous les analyses ont été effectuées dans des conditions statiques (sans flux) et dynamiques (avec flux) en raison de l’impact des stimuli mécaniques (compression, étirement et cisaillement) sur la viabilité et les fonctionnalitéscellulaires 18,19,20. Le présent article décrit le protocole pour l’émulation orale/intraveineuse d’administration d’APAP et l’absorption/métabolisme respectif et les analyses toxicologiques dans le MPS 2-OC contenant l’intestin humain et les modèles équivalents de foie.

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Protocol

1. Production d’équivalents tissulaires pour la culture dans le 2-OC

  1. Production équivalente de barrière d’intestin grêle
    1. Maintenir les cellules Caco-2 et HT-29 à l’aide du milieu équivalent intestinal : DMEM complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline et de streptomycine, et 1 % d’acides aminés non essentiels, qui est nommé « DMEM S » dans ce manuscrit.
    2. Retirer le milieu, laver deux fois avec 1x DPBS et ajouter 8 mL de 0,25% trypsine/EDTA pour dissocier les cellules Caco-2 cultivées dans des flacons de culture cellulaire (175 cm2). Incuber pendant 5 min à 37 °C et arrêter la réaction en ajoutant au moins le double volume d’inhibiteur de la trypsine. Effectuez la même procédure pour les cellules HT-29, en ajustant les volumes de réaccente puisqu’une plus petite quantité de ces cellules est nécessaire et qu’elles sont maintenues dans des flacons plus petits (75 cm2).
    3. Centrifugeuse à 250 x g pendant 5 min, enlever le supernatant des deux tubes, et resuspendre les granulés cellulaires dans 10 mL de cellules DMEM S. Count, assurant une viabilité cellulaire supérieure à 80%. Intégrer aseptiquement des inserts de culture cellulaire dans une plaque de 24 puits précédemment remplie de 400 μL de DMEM S par puits dans le côté basolateral (qui représente la circulation sanguine humaine).
    4. Co-cultiver caco-2 et HT-29 cellules à un ratio de 9:121. Utilisez 2,25 x 105 Caco-2 et 2,5 x 104 cellules HT-29 à chaque équivalent intestinal dans un volume final de 200 μL de DMEM S. Ajustez les numéros et le volume des cellules en fonction du nombre souhaité d’organoïdes. Mélanger délicatement.
    5. Pipette 200 μL de solution cellulaire dans le côté apical de chaque insert (qui représente le côté lumen intestinal humain), ensemencement 250.000 cellules par insert. Co-cultiver les cellules dans les inserts pendant trois semaines22. Changez le milieu au moins trois fois par semaine, en l’aspirant des côtés apical et basolateral avec une pipette pasteur stérile, en prenant soin de ne pas endommager la barrière cellulaire intacte.
      REMARQUE: Procéder à l’aspiration sur le côté apical, afin de ne pas toucher la barrière cellulaire (aspirer en soutenant la pipette Pasteur sur le bord en plastique de l’insert cellulaire).
    6. Vérifiez la formation de monocouches étanches en mesurant le TEER (résistance électrique transepithelial) tous les trois jours à l’aide d’un voltmètre23,selon les instructions du fabricant.
      1. Effectuez un blanc, mesurant la résistance à travers un insert de culture cellulaire sans cellules, mais avec le même milieu cellulaire et à la même plaque cellulaire.
      2. Calculer la résistance des tissus en soustrayant la résistance vierge de la résistance équivalente aux tissus, et multiplier par la surface efficace de la membrane filtrante (0,6 cm2). Une bonne résistance de barrière d’intestin est dans une gamme de 150 à 400 Ω-cm2.
        REMARQUE : Après 21 jours, les cellules doivent être complètement différenciées et la barrière intestinale formée, de sorte que les équivalents intestinaux sont prêts à être intégrés dans mps.
  2. Production d’équivalents hépatiques
    1. Maintenir les cellules HepaRG à l’aide du milieu équivalent hépatique, qui est l’E moyen de William complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline humaine et 5 x 10-5 M d’hydrocortisone, et s’appelle « Williams E S » dans ce manuscrit. Renouveler les médias HepaRG tous les 2-3 jours et maintenir la culture cellulaire pendant deux semaines pour initier la différenciation dans les hépatocytes et les cholangiocytes.
    2. Après les deux premières semaines, ajouter 2% DMSO au milieu de HepaRG pendant deux semaines supplémentaires pour compléter la différenciation cellulaire24,25. Cultivez HHSTeC dans Stellate Cell Media (SteC CM), à l’aide de flacons de culture cellulaire recouverts de poly-L-lysine, changeant les médias tous les deux ou trois jours.
    3. Retirer le milieu, laver deux fois avec 1x DPBS et ajouter 8 mL de 0,05% trypsine/EDTA, pour dissocier les cellules HepaRG cultivées dans des flacons de culture cellulaire (175 cm2). Incuber de 5 à 10 min à 37 °C et arrêter la réaction en ajoutant au moins le double du volume d’inhibiteur de la trypsine. Effectuez la même chose pour HHSTeC, en adaptant le volume du reagent puisqu’une plus petite quantité de ces cellules sont nécessaires et qu’elles peuvent être maintenues dans des flacons plus petits (75 cm2).
    4. Centrifugeuse à la fois à 250 x g pendant 5 min, enlever le supernatant et resuspendre les granulés cellulaires dans Williams E S moyen. Comptez les cellules, assurant une viabilité cellulaire supérieure à 80%.
    5. Générer les sphéroïdes du foie combinant les cellules HepaRG et HHSTeC à un rapport de 24:1, respectivement, dans Williams E S moyen16. Ajouter 4,8 x 104 HépaRG différenciés et 0,2 x 104 HHSTeC pour composer chaque sphéroïde hépatique de 50 000 cellules, dans un volume de 80 μL. Ajuster le nombre et le volume des cellules en fonction du nombre souhaité de sphéroïdes. Mélanger délicatement.
    6. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 80 μL de la piscine cellulaire combinée dans chaque puits de 384 microplaques sphéroïdes, dont la géométrie du fond rond est bien inférieure.
      REMARQUE : Après quatre jours, des sphéroïdes d’environ 300 μm se forment.
    7. À l’aide de pointes à alésage large, transférer les sphéroïdes hépatiques dans des plaques de puits ultra-à faible fixation 6, ce qui permet le comptage « un par un » requis.

2. Intégration d’équivalents intestinaux et hépatiques dans un MPS 2-OC

  1. Assemblage intestin 2-OC MPS pour l’analyse d’absorption
    1. Pipette 500 μL de DMEM S dans le compartiment plus grand de 2-OC et 300 μL dans le plus petit. Aspirer le média basolateral et apical de chaque équivalent de barrière intestinale dans les 24 plaques de puits. À l’aide de forceps stériles, intégrer un insert par circuit 2-OC, spécifiquement dans le compartiment plus grand. Appliquer 200 μL du milieu de l’intestin sur le côté apical.
      REMARQUE : Évitez la formation de bulles lors de l’intégration des organoïdes dans le MPS.
    2. Connectez le MPS à l’unité de commande, qui doit être reliée à un approvisionnement en air pressurisé. Définissez les paramètres : une pression d’environ 300 ± et une fréquence de pompage de 0,3 Hz. Démarrez le débit 24 h avant l’administration de la substance d’essai. Le lendemain, effectuez le traitement APAP.
  2. Assemblage de MPS de foie 2-OC pour l’essai de métabolisme
    1. Pipette 650 μL de Williams E S dans le grand compartiment et 350 μL dans le compartiment plus petit, qui recevra les sphéroïdes. Dans les plaques de puits ultra-à faible fixation, comptez les sphéroïdes à l’aide de pointes à alésage large. Chaque équivalent hépatique est composé de vingt sphéroïdes26. Intégrer vingt équivalents hépatiques par circuit, à l’aide de pointes à alésage large, ce qui permet le transfert d’organoïdes seulement, dans le compartiment plus petit d’un 2-OC.
    2. Connectez le MPS à l’unité de commande, qui doit être reliée à un approvisionnement en air pressurisé. Définissez les paramètres : une pression d’environ 300 ± et une fréquence de pompage de 0,3 Hz. Démarrez le débit 24 h avant l’administration de la substance d’essai. Le lendemain, effectuez le traitement APAP.
  3. Assemblage intestin/foie 2-OC MPS pour l’absorption et l’analyse du métabolisme
    1. Combiner les deux supports (intestin et foie) dans une proportion de 1:4, ce qui signifie 200 μL de DMEM S dans le côté apical de l’intestin et 800 μL de Williams E S dans le côté basolateral. Intégrer l’intestin et les équivalents hépatiques, simultanément, dans le 2-OC.
    2. Connectez le MPS à l’unité de commande, qui doit être reliée à un approvisionnement en air pressurisé. Définissez les paramètres : une pression d’environ 300 ± et une fréquence de pompage de 0,3 Hz. Démarrez le débit 24 h avant l’administration de la substance d’essai. Le lendemain, effectuez le traitement APAP.
      REMARQUE : Pour toutes les expériences, effectuez chaque point de temps en triplicate, ce qui signifie trois circuits séparés de 2 OC (c.-à-d. 1 et 1/2 dispositifs 2-OC). Le volume total de chaque circuit de 2 OC est de 1 mL.

3. Préparation à l’acétaminophène (APAP)

  1. Préparer la solution de stock APAP, en dissolvant apap dans l’éthanol absolu. Le jour de l’expérience, diluer l’APAP dans le milieu respectif (solution APAP), à une concentration de 12 μM pour « administration orale » et de 2 μM pour « administration intraveineuse ».
  2. Assurez-vous que la concentration finale d’éthanol dans la solution de contrôle et de traitement des véhicules est de 0,5 % pour les deux administrations. Pour le contrôle positif (APAP de 100 mM), la concentration d’éthanol est de 2%.

4. Tester l’administration de substances et l’échantillonnage des médias

  1. Administration « orale » de l’APAP et échantillonnage des médias
    1. Aspirer le milieu basolateral et apical de chaque équivalent de barrière intestinale dans le 2-OC. Pipette 500 μL du milieu de culture approprié dans le grand compartiment du côté basolateral organoïde et 300 μL dans le petit compartiment.
    2. Vérifiez les bulles et procédez avec le traitement équivalent de barrière intestinale avec la substance d’essai dans le côté apical, imitant l’administration orale. Émuler l’administration « orale » de l’APAP en ajoutant 200 μL d’une solution APAP de 12 μM du côté apical des inserts de culture intestinale, qui représente le « côté lumen » intestinal (figure 1B). Connectez le MPS à l’unité de contrôle.
    3. Recueillir le volume total à partir de côtés apical et basolateral aux points de temps suivants: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, et 24 h15,27. Effectuez toutes les expériences en triplicate, dans des conditions statiques et dynamiques, et recueillez chaque échantillon, de chaque triplicate, dans un microtube séparé. Analyser les échantillons à l’aide de HPLC/UV.
      REMARQUE : Séparez les échantillons apical et basolateral.
  2. Administration « intraveineuse » de l’APAP et échantillonnage des médias
    1. Émulez la voie « intraveineuse » en administrant la solution APAP de 2 μM directement dans le compartiment hépatique. Aspirez tout le contenu moyen 2-OC. Pipette 650 μL de Williams E S contenant la substance d’essai dans le grand compartiment et 350 μL du même média dans le compartiment plus petit qui contient les 20 sphéroïdes. Recueillir tous les volumes aux points de temps suivants: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h, et 24 h27,28.
    2. Effectuez toutes les expériences en triplicate, dans des conditions statiques et dynamiques. Recueillir chaque échantillon, de chaque triplicate, dans un microtube séparé. Analyser les échantillons à l’aide de HPLC/UV.

5. Instrumentation et conditions chromagraphiques

  1. Analyse HPLC
    1. Définissez tous les paramètres pertinents pour l’analyse HPLC selon le tableau 1.
    2. Filtrer la phase mobile à travers un filtre membranaire de 0,45 μm sous vide. Filtrer les échantillons à travers un filtre à seringues PVDF de 0,22 μm de taille pore (diamètre 13 mm) et les conserver dans un flacon. Démarrez la mesure.
  2. Solutions de stock, normes d’étalonnage et échantillons de contrôle de la qualité (QC)
    1. Préparez 10 mM de solutions de stock APAP dans le tampon d’acétate d’ammonium (100 mM, pH 6,8) et diluez davantage avec les supports de culture cellulaire DMEM S et Williams E S dilués avec tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v) pour atteindre les solutions de travail allant de 0,25 à 100,00 μM.
    2. Inclure un ensemble d’échantillons d’étalonnage en triplicate ainsi que des échantillons de contrôle de la qualité à quatre niveaux en triplicate. Préparez ces normes par dilution en série.
    3. Créer des courbes d’étalonnage des zones de pointe apap par rapport aux concentrations standard nominales APAP. Déterminez la régression linéaire adaptée à chaque courbe d’étalonnage. Évaluer la qualité de l’ajustement de divers modèles d’étalonnage par inspection visuelle, coefficient de corrélation, précision et valeurs de précision intra-et inter-run.
    4. Injecter des échantillons vierges de DMEM S et Williams E S médias dilués dans tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/ v) en sextuplicate. Préparer des triplicates d’échantillons de contrôle de la qualité dans les supports DMEM S et Williams E S dilués avec tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v) pour les concentrations apap de 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 et 90,00 μM.
    5. Assurez-vous que les échantillons de contrôle de la qualité sont préparés à partir d’une nouvelle solution de stock, différente de celle utilisée pour générer une courbe standard. Utilisez des échantillons de contrôle de la qualité pour étudier les variations intra-et inter-run.
  3. Procédures de validation
    1. Effectuer la validation de la méthode bioanalytique suivant les procédures précédemmentsignalées 29,30. Effectuez les séries chromagraphiques à cinq ou six reprises distinctes, compte tenu des médias de culture cellulaire Williams E S et DMEM S, respectivement.
    2. Assurez-vous que les points d’étalonnage allant de 0,25 à 100,00 μM d’APAP, dans les médias de culture cellulaire DMEM S ou Williams E S dilués dans le tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v), sont tracés en fonction des zones de pointe de l’APAP (axe y) par rapport aux concentrations nominales respectives (axe x). Comparez les pentes de ces courbes d’étalonnage standard avec les pentes de courbe d’étalonnage préparées en tampon d’acétate d’ammonium. Assurez-vous que toutes les courbes d’étalonnage ont une valeur de corrélation d’au moins 0,998.
    3. Déterminez la précision et la précision (intra et inter-run) de l’analyte dans la matrice de substitution à l’aide de répliques à quatre niveaux différents LLOQ, contrôle faible, moyen et de haute qualité sur cinq ou six jours différents. Effectuez des mesures de précision et de précision intra-run le même jour dans les médias de culture cellulaire DMEM S ou Williams E S dilués dans un tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v) contenant des concentrations de 0,50, 4,50, 45,00 et 90,00 μM APAP (n = 3).
    4. Évaluer chaque ensemble d’échantillons de contrôle de la qualité contenant les concentrations d’APAP à partir de courbes d’étalonnage récemment obtenues. Testez la sélectivité des essais par le degré de séparation du composé d’intérêt et d’autres pics chromatographiques possibles causés par les composants interférants.
  4. Limite inférieure de quantification (LLOQ) et limite de détection (LOD)
    1. Déterminer la limite inférieure de quantification (LLOQ) en fonction de l’écart type de la réponse et de l’approche en pente. Calculer à l’aide de la formule 10α/S, où la α est l’écart type de y-intercept et S est la pente de la ligne droite obtenue en traçant les courbes d’étalonnage29,30. Estimer la limite de détection (LOD) en tenant compte 3,3 fois l’écart type du blanc, divisé par la pente de la courbe d’étalonnage29,30.

6. Équivalents tissulaires viabilité/fonctionnalité

  1. Mtt
    1. Effectuez un test MTT pour évaluer la viabilité organoïde dans tous les points de temps de l’essai MPS. Comme le contrôle négatif, utiliser les médias cellulaires plus véhicule. Comme le contrôle positif, traiter les organoïdes avec 100 mM APAP et 1% NaOH dilué dans le milieu cellulaire.
    2. Transférer les 20 sphéroïdes de chaque réplique pour les puits individuels dans une plaque de puits 96, et les inserts de culture cellulaire, contenant les équivalents intestinaux, à 24 plaques cellulaires bien, plaçant un équivalent intestin par puits. Lavez les équivalents tissulaires trois fois avec 1x DPBS.
    3. Ajouter 300 μL d’une solution MTT de 1 mg/mL, diluée dans le milieu cellulaire respectif, par puits. Incuber les plaques pendant 3 h dans des conditions de culture cellulaire standard.
    4. Retirez soigneusement la solution MTT de chaque puits par pipetting. Extraire le mtt formazan de l’intestin et des équivalents hépatiques à l’aide de 200 μL d’isopropanol par puits pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Scellez le couvercle pour éviter l’évaporation.
    5. Transférer 200 μL de chaque supernatant au puits pré-identifié respectif dans une plaque d’essai de 96 micro puits. Utilisez l’isopropanol comme blanc.
    6. Lire l’absorption formazan dans un lecteur de plaques à 570 nm. Calculer la capacité relative des cellules à réduire le MTT (%) en utilisant la densité optique moyenne de chaque point de temps, par rapport au contrôle négatif, considéré comme 100% viabilité cellulaire.
  2. Cytochimie/Histologie
    1. Fixer l’intestin et les équivalents hépatiques, pendant 25 min à température ambiante, en utilisant 4% (w/ v) paraformaldéhyde dans 0,1 M phosphate-saline tampon, pH 7,4. Lavez les organoïdes 5 fois dans le tampon PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Tacher l’intestin et les équivalents hépatiques avec la tétraméthylrhodamine isothiocyanate-phalloidin ou Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 dans PBS31.
    2. Transférez-les au milieu de congélation oct pendant quelques minutes pour les acclimater à rt avant de les transférer à l’azote liquide jusqu’à ce que la congélation complète. Effectuer des cryosections de sphéroïdes hépatiques d’environ 10-12 μm d’épaisseur, à l’aide d’un cryostat.
    3. Monter les sections de tissus dans le milieu de montage avec DAPI. Examinez-les par microscopie de fluorescence confoccale.
    4. Congeler les organoïdes après fixation pour effectuer la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine selon les protocoles établis. Montez les diapositives avec le milieu de montage après avoir tranché le tissu tel que décrit ci-dessus et prenez des images histologiques à l’aide d’un microscope optique.
  3. Analyse de contenu élevé
    1. Coloration mitochondrique et nucléaire des cellules
      1. Reconstituer la poudre lyophilisée dans DMSO pour faire une solution de stock de coloration mitochondriale de 1 mM (p. ex., MitoTracker Deep Red FM). Conserver la solution de stock aliquoted à -20 °C à l’abri de la lumière. Diluer la solution de stock de coloration mitochondriale de 1 mM à la concentration finale (200 nM) dans le milieu de culture tissulaire préchauré (37 °C) sans sérum.
      2. Retirez les supports de culture cellulaire. Ajouter la solution de coloration mitochondriale pour couvrir complètement l’échantillon et incuber les cellules pendant 15-45 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2.
      3. Retirez soigneusement la solution de travail de coloration mitochondriale et remplacez-la par un fixatif de paraformaldéhyde de 2 à 4 % dans le PBS pendant 15 minutes à température ambiante.
      4. Rincer délicatement les cellules fixes avec du PBS pendant 5 minutes. Répétez le processus de lavage deux fois.
      5. Préparer une solution de 10 mg/mL (16,23 M) de stock de colorant acide nucléique en dissolvant 100 mg de colorant Hoechst 33342 dans 10 mL d’eau ultrapure.
        REMARQUE : La solution de stock doit être aliquoted et stockée protégée de la lumière à -20 °C.
      6. Préparez une solution de travail de coloration de l’acide nucléique de 0,2 à 2,0 μg/mL dans PBS et incubez les cellules fixées avec une solution de travail de coloration de l’acide nucléique pendant 10 minutes à température ambiante.
      7. Retirer la solution de travail de coloration de l’acide nucléique et rincer les cellules doucement avec PBS pendant 5 minutes trois fois. Les cellules doivent être conservées en PBS à 4 °C, à l’abri de la lumière.
    2. Analyse des taches mitochondriales et nucléaires
      1. Analyser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence avec des ensembles de filtres appropriés à la tache d’acide nucléique (νEx/νEm : 361/497 nm) et à la tache mitochondriale (νEx/νEm : 644/665 nm). Trouver des cellules par l’acide nucléique tache positive et quantifier le nombre de cellules. Quantifier l’intensité de fluorescence des taches mitochondriales dans les mitochondries.
  4. Mesures morphométriques (calculs sphéroïdes) dans ImageJ
    1. Export High Content Analysis (HCA) images comme *.flex fichiers à partir du logiciel Columbus. Importer .flex fichiers comme une échelle grise dans ImageJ en utilisant Bio-Formats plugin32: Fichier > Importation > Bio-Formats.
    2. Dans la fenêtre Options d’importation, sélectionnez visualisation Hyperstack et activez les canaux split sous Split en fenêtres séparées. Cette option permettra l’accès à tous les fichiers d’un canal particulier (p. ex., DAPI, mitotracker, etc.). Ne sélectionnez pas Utilisez la pile virtuelle sous gestion de mémoire.
      REMARQUE : Il est préférable d’utiliser le canal DAPI comme « poussière » dans les images, car le milieu de culture est réduit en longueur d’onde UV (p. ex., 405 nm).
    3. Ajuster la taille des pixels (Analyser > Set Scale) si elle n’a pas été chargée en fonction des valeurs intégrées dans le fichier .flex. Appliquez un filtre Gaussian Blur pour éliminer l’excès de bruit et éviter les irrégularités dans le contour de la forme. Processus > Filtres > Gaussian Blur. Une valeur élevée de Sigma (rayon) entre 2,0 et 3,0 est idéale pour la plupart des cas. Si la pile a plusieurs images, appliquez-les à toutes (sélectionnez Oui dans la fenêtre Stack de processus).
    4. Générer une image binaire pour séparer l’arrière-plan et les organoïdes (objets) à l’aide d’un seuil. Cliquez sur l’image > Ajuster > Seuil. Utilisez le masque rouge pour ajuster les valeurs en fonction de l’intensité de l’image, pour s’adapter à la forme organoïde, en gardant la morphologie intacte. Désactiver fond sombre si l’image a un fond blanc. Cliquez sur Appliquer.
    5. Dans la fenêtre Convertir la pile en fenêtre binaire, choisissez la méthode Threshold. Habituellement, par défaut ou triangle sont préférés dans ce genre de traitement d’image. Gardez l’arrière-plan comme sombre. Sélectionnez Calculer le seuil pour chaque image s’il y a plusieurs images dans la pile.
    6. Sélectionnez Processus > Binaire > Remplir les trous. En option, retirez les trous de l’arrière-plan. Dans Process > Binary > Options, sélectionnez fond noir et exécuter fill holes à nouveau. Désactiver l’option d’arrière-plan noir avant de passer à l’étape suivante.
    7. Objets séparés. Pour les organoïdes, la méthode du bassin versant est un bon choix. Cliquez sur Processus > Binaire > Watershed. Exécutez l’analyse de forme.
      1. Sélectionnez Analyser > Définir les mesures. Plusieurs options sont disponibles (détails dans https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Pour les organoïdes, sélectionnezZone , Valeur grise moyenne, Valeur grise min & max et descripteurs de forme. En option, sélectionnez l’étiquette Display pour identifier les objets dans l’image et la notation scientifique. Cliquez sur OK.
      2. Sélectionnez Analyse > Analyser les particules. Choisissez les limites de taille et de circularité. Gardez 0-infini et 0.00-1.00, respectivement pour mesurer tous les objets dans l’image. Dans Afficher, choisissez les contours de sorte que les objets seront identifiés. Activer les résultats d’affichage aux résultats de sortie; Exclure sur les bords pour exclure les objets touchant les bordures; Inclure des trous de sorte que les trous intérieurs éventuels dans les objets sont considérés comme faisant partie de la forme principale.
    8. Répétez l’analyse de forme pour chaque pile d’images et les résultats seront annexés dans une seule table. Tableau des résultats d’exportation dans file > Save As... comme virgule valeurs séparées (.csv) fichier.
  5. PCR en temps réel
    1. Extraire l’ARN des équivalents tissulaires à l’aide d’une solution monophasique de phénol et d’isothiocyanate de guanidine, suivant les instructions du fabricant.
    2. Effectuez la synthèse cDNA par transcription inverse de 1 à 2 μg d’ARN total.
    3. Amplifiez toutes les cibles à l’aide d’amorces spécifiques aux gènes (tableau 5) pour effectuer un PCR quantitatif en temps réel. Chaque qRT-PCR contient 30 ng d’ARN transcrit inversé et 100 nM de chaque amorce.
    4. Suivez les conditions PCR : 50 °C pendant 3 minutes (1 cycle); 95 °C pendant 5 minutes (1 cycle); 95 °C pendant 30 secondes, 59 °C pendant 45 secondes et 72 °C pendant 45 secondes (35 à 40 cycles).
  6. Analyse CYP
    1. Suivez la section 2.2 pour l’assemblage foie 2-OC. Les groupes expérimentaux sont le contrôle sans cellule, les traitements APAP 2 μM pour 12 h, 24 h et le contrôle du véhicule. Suivez les sections 3.3 et 4.2 pour la préparation et le traitement apap 2 μM.
      REMARQUE : Pour s’assurer que tous les échantillons seront prêts en même temps pour l’analyse du CYP, commencez le traitement de 12 h 12 heures après le début du traitement de 24 h. Traitez le contrôle sans cellule de l’activité CYP avec une solution éthanol à 0,5 %, ainsi que le contrôle du véhicule.
    2. Décongeler la solution de bouillon de substrat luminogène de 3 mM à température ambiante et faire une dilution de 1/1000 dans William’s E S. Protégez-vous de la lumière.
    3. Recueillir les sphéroïdes et transférer chaque groupe expérimental dans un puits d’une plaque de 96 puits. Retirer le milieu, laver deux fois avec 100 μL de 1x DPBS et ajouter 80 μL de solution de substrat de 3 μM par puits. Gardez le contrôle sans cellule dans le milieu E S de William. Enregistrez un puits sans sphéroïdes ni solution de substrat pour un contrôle de fond. Incuber pendant 30-60 min à 37 °C avec 5% de CO2,protégé de la lumière.
    4. Équilibrate lyophilisé Luciferin Detection Reagent (LDR) à l’aide du tampon de reconstitution avec esterase. Mélanger en tourbillonnant ou en inversant. Conservez le volume approprié à température ambiante jusqu’à l’étape suivante.
      REMARQUE : Le LDR reconstitué peut être stocké à température ambiante pendant 24 heures ou à 4 °C pendant 1 semaine sans perte d’activité. Pour un stockage à long terme, conserver à -20 °C.
    5. Transférer 25 μL de supernatant intact des sphéroïdes dans trois puits différents d’une microplaque blanche opaque de 96 puits, après incubation. Ajouter 25 μL de LDR par puits et homogénéiser.
    6. Incuber la plaque blanche à température ambiante pendant 20 minutes. Lisez la luminescence sur un luminomètre. N’utilisez pas de fluoromètre.
    7. Calculez les signaux nets en soustrayant les valeurs de luminescence de fond (contrôle sans cellule) des valeurs d’essai traitées par composé et non traitées (contrôle du véhicule). Calculer le pourcentage de variation de l’activité CYP3A4 en divisant les valeurs nettes traitées par les valeurs nettes non traitées et en multipliant par 100.
  7. Ballonnement occidental
    1. Transférer les sphéroïdes hépatiques sur un microtube identifié de 1,5 mL. Retirer le milieu et laver deux fois avec 100 μL de 1x DPBS.
    2. Lysate les sphéroïdes du foie dans 100 μL de lyse cellulaire RIPA tampon à 4 °C pendant 20 min. Centrifugeuse pendant 15 min, 4 °C et 11 000 rpm. Transférez le supernatant à un autre microtube identifié de 1,5 mL.
    3. Quantifier la quantité de protéines obtenue par la méthode Bradford. Chargez entre 10 et 50 μg de protéines du lysate de cellules quantifiées par puits d’un gel polyacrylamide gradient 3-15% et effectuez un SDS-PAGE.
    4. Transférez la protéine chargée du gel à une membrane PVDF de 0,22 μm à travers l’équipement du système semi-sec. Utilisez une solution de transfert de 50 mM Tris-HCl et 192 mM de glycine. Définissez les paramètres de l’équipement en fonction du nombre de gels à transférer (1 à 2 à la fois).
    5. Bloquer les interactions non spécifiques sur la membrane PVDF avec une solution de lait écrémé de 3 à 5 % dans le tampon TBS-T : Saline à tampon tris (50 mM tris pH 7,6, chlorure de sodium de 150 mM) complétée par 0,1 % de Tween 20. Gardez la membrane sous une secousse doucement constante pendant 1 heure à température ambiante.
    6. Laver avec le TBS-T sous une secousse doucement constante pendant 3-5 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage deux fois.
    7. Diluer l’albumine et les anticorps primaires de vinculine à 1:1000 et 1:2000 respectivement sur TBS-T. Incuber la membrane avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C, sous des secousses doucement constantes.
      REMARQUE : Suivez toujours les instructions du fabricant pour diluer les anticorps.
    8. Retirez l’anticorps primaire et la membrane de lavage 3 fois (étape 6.7.6). Diluer l’anti-souris ECL anticorps secondaire IgG à 1:5000 sur TBS-T. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire sous une secousse doucement constante pendant 2 heures à température ambiante.
    9. Retirer l’anticorps secondaire et laver la membrane (étape 6.7.6). Effectuez la détection des protéines à l’aide du substrat de blotting occidental ECL. Exposer les films autoradiographiques pendant 30 s à 30 min. Effectuez la détection d’immunoblotting en triplicate.

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Representative Results

Pour effectuer les tests PK APAP dans le MPS 2-OC, la première étape consiste à fabriquer l’intestin humain et les équivalents hépatiques (organoïdes). Ils sont intégrés dans le dispositif microfluidique 2-OC (Figure 1A) 24 h avant le début de l’essai PK APAP. Le lendemain, le support est modifié, et le modèle est exposé à l’APAP. La figure 1 illustre l’intestin et les équivalents hépatiques placés à l’intérieur du dispositif 2-OC (figure 1B) et le cours du temps d’expérience APAP PK (Figure 1C). Nous avons effectué un test MTT, des mesures TEER, HCA, PCR en temps réel, blotting occidental, histologie, et microscopie de fluorescence confocal dans la culture 2D et organoïdes 3D pour vérifier la viabilité du tissu et détecter les effets toxiques possibles d’APAP. Dans les images de microscopie de fluorescence confoccale, les échantillons équivalents intestinaux tachés de DAPI et de Phalloidin (pour les noyaux et l’actine respectivement) ont été présentés comme une barrière contiguë pour les échantillons non traités (figure 2A) et les échantillons traités par APAP de 12 μM (figure 2B). Comme on le voit à la figure 2C, l’analyse MTT a montré des niveaux relatifs de viabilité cellulaire supérieurs à 70 %, ce qui indique l’absence d’effets cytotoxiques pertinents en réponse à l’exposition au PAAP à 12 concentrations de μM33,34,35,36,37. Le contrôle positif (100 mM) a induit la mort cellulaire significative (survie au-dessous de 5%). La viabilité caco-2/HT-29 et la différenciation appropriée ainsi que l’intégrité de la barrière équivalente intestinale ont été vérifiées par l’évolution du TEER au cours de la période de différenciation (figure 2D). L’APAP n’a pas modifié les valeurs teer comme le montre la figure 2E. L’expression des transporteurs actifs de glucose couplés au sodium SLC5A1, du transporteur multirésistant MDR1 et de l’ATPase sodium-potassium a été analysée, afin de vérifier l’impact du traitement apap sur la formation de barrières cellulaires et la fonctionnalité basale. Comme l’a démontré la figure 2F-H, les équivalents intestinaux traités non traités et apap ont montré une expression similaire de SLC5A1 et NaKATPase. L’administration orale de 12 μM APAP induite a marqué une augmentation des niveaux d’ARNm MDR1 dans les équivalents intestinaux après 24 h (Figure 2H). Nous avons également exécuté HCA des changements phénotypiques cellulaires par un mélange de colorant de fluorophore pour des noyaux et la teneur en masse mitochondrique. Les contrôles positifs étaient 100 mM APAP et 1% NaOH.

En outre, nous avons analysé si 12 μM APAP pourrait induire la cytotoxicité à la co-culture 2D Caco-2/HT-29. Les images de cellules intestinales acquises avec la microscopie de fluorescence montrées dans la figure 2I corroborent les données de MTT, qui ont démontré que 12 μM APAP n’ont pas causé la cytotoxicité significative dans les équivalents intestinaux de Caco-2/HT-29.

L’évaluation de la viabilité basale des sphéroïdes hépatiques et de la cytotoxicité en réponse à l’APAP de 2 μM a été faite par l’essai de MTT et les analyses morphologiques par microscopie confocale de fluorescence, histologie de H&E, et analyses de HCA. Comme le montre la figure 3A, l’essai MTT n’a pas été en mesure d’identifier une cytotoxicité pertinente en réponse au traitement apa de 2 μm dans des échantillons prélevés sur l’assemblage du foie 2-OC dans des conditions statiques et dynamiques. La viabilité cellulaire a diminué, mais est restée plus de 80% pour les deux 12 h et 24 h temps-points33,34,35,36,37. Les traitements de contrôle positifs (APAP de 100 mM et 1% NaOH) ont induit des dommages significatifs de tissu (viabilité au-dessous de 10%). Les images confocales microscopiques indiquent l’absence d’un centre nécrotique dans les sphéroïdes hépatiques dans les conditions de traitement basales ou APAP, et aucune preuve de taux de mortalité significatifs (Figure 3B-C). Cependant, quand nous avons analysé les changements phénotypiques cellulaires multiples suivant le véhicule ou l’administration de 2 μM APAP dans la coculture 2D d’HépaRG/HHSteC par l’essai de HCA, utilisant 100 mM APAP (C+) comme contrôle positif, contredisant les résultats de l’essai de MTT, les cellules hépatiques ont démontré des réponses cytotoxiques tôt à 2 μM APAP traitement (figure 3D). Après 24 h, il y avait une diminution du nombre de cellules, dans la zone nucléaire et une augmentation de la masse mitochondrique. En outre, un cocktail de colorant fluorophore contenant Hoechst 33342 et MitoTracker Deep Red a été utilisé pour tacher les sphéroïdes hépatiques 3D (Figure 3J). Le logiciel fidjien a été utilisé pour évaluer l’homogénéité de l’architecture sphérique 3D entre plusieurs sphéroïdes (Figure 3E-I). Le graphique montré dans la figure 3E montre la similitude entre la superficie totale des sphéroïdes hépatiques. Le rapport d’aspect (figure 3F) autour de 1 signifie une absence de biais pendant le processus de confection des sphéroïdes. L’évaluation a également indiqué que la majorité des sphéroïdes étaient à peu près arrondis( figure 3G). L’évaluation du périmètre de morphologie et de la distribution cellulaire s’est faite par circularité (figure 3I) et par calcul de solidité (figure 3H), respectivement. Nous avons conclu que la méthodologie de confection des sphéroïdes hépatiques avait généré des organoïdes avec un périmètre lisse, compatible avec la croissance sphérique, aucun biais, ou nécrose pendant le processus.

Comme démontré dans la figure 4A-B, les sphéroïdes hépatiques ont montré un niveau élevé basal relatif d’expression d’albumine et d’ARNm de TPS respectivement, indiquant la fonctionnalité basale appropriée. Néanmoins, le traitement APAP de 2 μM pendant 24 h a induit une diminution des niveaux d’expression d’albumine et d’ARNm de TPS, suggérant l’affaiblissement des sphéroïdes de foie fonctionnellement au point de temps de 24 h du traitement d’APAP.

La détection des niveaux d’expression de l’ARNm CYP3A4 et UGT1A1 démontre la capacité métabolique des équivalents hépatiques. Le niveau basal de l’ARNm CYP3A4 (figure 4C) était conforme aux rapports précédents6. Le traitement APAP a induit une tendance à une diminution de l’ARNm CYP3A4 et de l’expression UGT1A1 en réponse au traitement apap (figure 4C-D) corroborant une fois de plus l’hypothèse de l’affaiblissement des sphéroïdes hépatiques fonctionnellement au point de temps de 24 h du traitement d’APAP.

En outre, des expériences de ballonnement occidental et d’activité enzymatique in vitro ont été exécutées afin d’analyser l’expression de protéine d’albumine, aussi bien que, l’activité de CYP 3A4 dans des équivalents de foie aux conditions basales et à des conditions de traitement d’APAP. Nous avons constaté que le traitement APAP 2 μM effectué au Liver 2-OC MPS, induit une réduction de l’expression totale de l’albumine équivalente hépatique à 12 h et 24 h de temps à la fois statique (Figure 4E) et dynamique (Figure 4F) conditions. D’autre part, des échantillons d’équivalents hépatiques provenant de conditions dynamiques ont démontré une tendance à présenter des niveaux plus élevés d’expression protéique de l’albumine par rapport aux conditions statiques(figure 4G). L’essai in vitro CYP 3A4 effectué à des équivalents hépatiques du Liver 2-OC MPS a montré que le traitement APAP de 2 μM pendant 12 h ou 24 h était capable d’induire une déficience robuste et significative de l’activité CYP 3A4 à des conditions statiques et dynamiques(figure 4H-I). Plus intéressant encore, la présence d’un flux médiatique (dynamique) a entraîné une amélioration significative des niveaux d’activité cyp 3A4 équivalents hépatiques par rapport aux conditions dans lesquelles les équivalents hépatiques ont été conservés en l’absence de milieu circulant (conditions statiques) (Figure 4J).

Pour trouver l’état analytique le plus sensible concernant l’analyse HPLC, plusieurs paramètres ont été étudiés, y compris la composition de la phase mobile, le type et la concentration des additifs. Il a été constaté que l’acétyltrile donnait une meilleure résolution de chromatogramme et un temps de rétention approprié que le méthanol. La séparation rapide et reproductible de l’APAP a été obtenue à l’aide d’une colonne de phase inversée C18. La valeur du temps de rétention apap (Rt) était de 9,27 ± 0,19 minutes. La sélectivité de l’APAP est indiquée par la forme et la résolution symétrique du pic, ainsi que par l’absence de pics interférants provenant des médias de culture cellulaire DMEM et Williams.

Des concentrations standard apap dans les médias de culture cellulaire DMEM S et Williams E S diluées avec tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v) allant de 0,25 à 100,00 μM ont été utilisées pour construire les courbes d’étalonnage. La linéarité de la méthode a été déterminée à neuf niveaux de concentration. Les données sont affichées dans les tablements 2 et 3. La relation entre la concentration de l’APAP et les zones de pointe a été décrite par les équations linéaires de régression : y = 16106*x + 3579,8 (R2=1, dans le milieu DMEM) et y = 16397*x + 2475,1 (R2=1, dans le milieu Williams), dans lequel « x » est la concentration nominale APAP en μM et « y » est la zone de pointe chromatogramme de l’APAP dans l’UA. À la limite supérieure de quantification (c.-à-d. 100,00 μM), l’écart en pourcentage et les valeurs de variabilité entre les cours étaient inférieures à 2,50 %. La précision et la précision de neuf niveaux de concentration, à l’exclusion des valeurs de 0,50 μM (LLOQ), se trouvaient dans une fourchette acceptable avec des valeurs DEV et C.V. inférieures à 7,00 %(tableau 2 et tableau 3).

La méthode analytique de précision et de précision inter-et intra-run, à quatre concentrations testées, s’inscrit dans les critères généralement acceptés pour les analyses bioanalytiques. La reproductibilité de la méthode a été évaluée en analysant des répliques d’échantillons de contrôle de la qualité apap de 0,50 (LLOQ), 4,50, 45,00 et 90,00 μM. Les résultats moyens intra-run et inter-run sont rapportés dans le tableau 4. La précision et la précision de l’analyse sont démontrées par les valeurs DEV ≤ 15,00% et par les valeurs C.V. ≤ 7,00%, respectivement.

Le LOD a été déterminé comme l’échantillon dont le rapport signal-bruit (S/N) était juste supérieur à 3 et correspondait à un APAP de 0,25 μM. D’autre part, le LLOQ, estimé à 0,50 μM d’échantillons apap, affichait un rapport S/N égal à 10. De plus, nous avons trouvé des valeurs d’exactitude (DEV%) ≤ 19,00 % des valeurs nominales de concentration. Les variabilités intra-et inter-run ont été démontrées par C.V. ≤ 18,77 %, comme le montrent les tableurs 2, 3 et 4)29,30.

Les analyses de PK d’APAP ont été exécutées dans trois assemblées différentes de MPS de 2-OC : 1) intestin 2-OC, contenant l’équivalent d’intestin seulement ; 2) Foie 2-OC, contenant les sphéroïdes de foie seulement et 3) Intestin/Foie 2-OC avec la barrière intestinale et les sphéroïdes de foie.

Pour des études d’absorption, la voie orale a été imitée par l’administration de 12 APAP de μM sur le côté apical équivalent d’intestin. Les concentrations d’APAP ont été mesurées par HPLC/UV, dans les échantillons moyens, prélevés sur les côtés des équivalents intestinaux apical et basolateral, dans des conditions statiques et dynamiques. La cinétique APAP dans le milieu recueilli sur les côtés apical et basolateral a démontré que le modèle d’intestin était capable d’absorber l’APAP. Il y a eu une diminution progressive de la concentration d’APAP dans le côté apical (figure 5A) concomitante à l’augmentation de concentration d’APAP du côté basolateral intestinal (figure 5B). Les concentrations maximales (Cmax) dans le milieu étaient d’environ 2 μM pour les conditions statiques et dynamiques, après 12 h de l’administration (Tmax).

Pour des études de métabolisme, l’administration intraveineuse a été imitée par l’application de 2 μM APAP dans le milieu du compartiment hépatique. La cinétique de concentration apap dans les médias dans des conditions statiques et dynamiques a indiqué que ce n’est qu’aux conditions dynamiques que les diminutions de la concentration d’APAP ont pu être détectées, atteignant 0,87 μM APAP 12 h après 2 μM apap administration (T1/2 = 12 h). Les équivalents hépatiques ont montré une efficacité métabolique minimale dans des conditionsstatiques ( Figure 5C). La concentration d’APAP a atteint 1,7 μM 12 h après l’administration de l’APAP. L’évaluation intégrée, systémique comme l’absorption et le métabolisme d’APAP a été exécutée dans le modèle d’intestin/foie 2-OC. L’APAP a été administré sur le côté apical de l’équivalent d’intestin, imitant la voie orale. Des échantillons moyens ont été prélevés des deux côtés intestinaux et aussi du compartiment hépatique. La figure 5D montre la décomposition progressive de la concentration d’APAP sur le côté apical dans des conditions statiques et dynamiques.

La figure 5E montre des phases d’absorption et de métabolisme distinguables. Le flux a également eu un impact dans l’absorption intestinale. L’APAP Cmax dans le milieu est passé de 2 μM sur l’assemblage « Intestin 2-OC »(figure 5B)à 1,7 μM pour la dynamique « Intestin/Foie 2-OC » (Figure 5E). La figure 5F montre une comparaison directe entre le profil concentration-temps de l’APAP dans notre système microphysiologique dynamique « Intestin/Foie 2-OC » (courbe rouge et axe y) et un profil représentatif obtenu chez l’homme après une seule dose orale de 1 000 mg (courbe noire et axe y).

Figure 1
Figure 1 : Compilation d’étapes schématiques pour les études pk dans le MPS 2-OC. A) Dessin schématique du MPS 2-OC, montrant les équivalents intestinaux et hépatiques de tissu humain dans la vue ascendante. B) photographie MPS 2-OC avec les équivalents intestinaux et hépatiques intégrés dans l’appareil en vue ascendante, avec des images de microscopie optique représentatives. C) Chronologie de la préparation des équivalents tissulaires, du traitement apap et des phases de collecte moyenne de culture pour la fabrication d’organoïdes, et des évaluations pharmacocinétiques et toxicologiques. Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Viabilité et évaluation toxicologique des équivalents intestinaux. A) Images confocales représentatives de microscopie de fluorescence de cellules Caco-2/HT-29 non traitées tachées de noyaux cellulaires et de filaments d’actine colorant fluorescent (DAPI et Phalloidin respectivement); 63x Grossissement, zoom 2.6. B) Images représentatives de microscopie de fluorescence confoccale des cellules Caco-2/HT-29 traitées avec 12 μM APAP pendant 24 h, tachées de noyaux et de filaments d’actine colorant fluorescent (DAPI et Phalloidin respectivement); 63x Grossissement, zoom 2.6. C) Évaluation de viabilité des équivalents intestinaux par essai MTT dans des conditions statiques et dynamiques. Les valeurs représentées par les barres du graphique sont calculées en pourcentage par rapport au contrôle du véhicule (point de temps nommé comme 0)*P<0,05 0 vs traitement. D) évolution TEER au cours des 21 jours de différenciation. *P<0.05 jour 1 vs autres jours. E) Valeurs TEER après administration APAP dans l’Intestin 2-OC MPS dans des conditions dynamiques. Expression génique dans les équivalents intestinaux. Le potentiel d’absorption de la barrière intestinale et les effets possibles de 12 μM APAP pendant 24 h dans un état dynamique ont été vérifiés par l’expression SLC5A1 (F), Na-K-ATPase (G) et MDR1 (H). Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Le résultat est exprimé comme un rapport à l’entretien ménager GAPDH. *P<0.05 véhicule vs APAP. I) Opérette basée sur l’image HCA effectué par le Columbus® 2.4.0. Logiciel. Images représentatives de la co-culture de l’intestin 2D à différents moments après un traitement APAP de 12 μM. Les contrôles négatifs étaient moyens (0 h) ou véhicules (0,5 % d’éthanol). Contrôles positifs montrés ici est le 100 mM APAP. Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Viabilité et évaluation toxicologique des équivalents hépatiques. A)Évaluation de viabilité des équivalents hépatiques par essai MTT dans des conditions statiques et dynamiques. Les valeurs représentées par les barres dans le graphique sont calculées en pourcentage par rapport au contrôle du véhicule (point de temps nommé comme 0) *P<0,05 0 vs traitement. B) Représentants images confocal capturées à partir du véhicule et 2 μM APAP 24 h traités sphéroïdes du foie à partir d’une section intérieure. C) Représentants H&E (taches d’hématoxyline et d’éosine) capturées à partir du véhicule et 2 μM APAP 24 h traités sphéroïdes hépatiques à partir d’une section interne. Barre d’échelle = 50 μm. D) Images représentatives de la co-culture hépatique 2D à différents moments après un traitement APAP de 2 μM. Des échantillons traités avec le véhicule et avec 2 μM APAP ont été pris en compte dans ces analyses. Le mélange de colorant fluorophore comprend Hoechst pour la coloration nucléaire et Mitotracker Deep Red pour la coloration de masse des mitochondries. Les contrôles négatifs étaient moyens (0 h) ou véhicules (0,5 % d’éthanol). Les contrôles positifs étaient de 100 mM APAP. Des mesures d’images sphéroïdes entières capturées ont été effectuées à l’aide d’un logiciel fidjien. E) Distributions de fréquence de la zone F) rapport d’aspect, G) rondeur, H) solidité, I) circularité. N = 85. *p < 0,05. J) Images représentatives de sphéroïdes hépatiques 3D acquis par l’Opérette à l’aide de l’objectif LWD 10x. Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : La viabilité/fonctionnalité hépatique et les effets possibles de 2 μM APAP dans des conditions statiques et dynamiques au-dessus ont été vérifiés par l’expression des gènes et des protéines et par l’activité enzymatique. A) expression du gène de l’albumine. B) Expression du gène GSTA2. La capacité hépatique d’effectuer le métabolisme de phase I et de phase II et les effets possibles de 2 μM APAP pendant 24 h dans un état dynamique au-dessus ont été vérifiés par l’expression génétique de CYP3A4 (C) et par UGT1A1 (D) respectivement. E) Expression totale de protéine d’albumine dans l’état statique. F) Expression totale des protéines de l’albumine dans des conditions dynamiques. Condition. G) Graphique comparatif illustrant la différence dans l’expression totale de l’albumine dans les équivalents hépatiques cultivés et traités dans des conditions statiques ou dynamiques. H) Activité enzymatique in vitro CYP 3A4 dans des conditions statiques. I) CYP 3A4 activité enzymatique in vitro dans des conditions dynamiques. J) Graphique comparatif illustrant la différence d’activité du CYP 3A4 dans les équivalents hépatiques cultivés et traités dans des conditions statiques ou dynamiques. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Les données de l’expression des gènes sont exprimées comme un rapport à l’entretien ménager GAPDH. Les données de l’expression des protéines sont exprimées comme un rapport à la protéine vinculine. *P<0.05 véhicule vs traitement APAP. Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Analyse de la pharmacocinétique apap dans le SPM 2-OC. Profil d’absorption d’APAP après administration d’APAP de 12 μM du côté apical de la préparation de MPS d’intestin 2-OC. La barrière intestinale a été faite d’une coculture des lignes cellulaires caco-2/HT-29 (A) concentrations statiques et dynamiques d’APAP dans le milieu du côté apical (représentant le côté intestinal humain de lumen). (B) Concentrations statiques et dynamiques d’APAP dans le milieu du côté basolateral (représentant le côté intestinal humain de circulation sanguine). *P<0.05 statique vs conditions dynamiques. C) Profil du métabolisme APAP dans le foie 2-OC MPS par HepaRG / HHSTeC sphéroïdes du foie. Comparaison des conditions statiques et dynamiques après une administration APAP de 2 μM dans le milieu. *P<0.05 0h vs 6 h, 12 h, et 24 h apap traitement. Profil d’absorption et de métabolisme d’APAP après administration de 12 μM sur le côté apical de barrière intestinale de la préparation de MPS d’intestin/foie 2-OC. Cela émule la voie orale. La barrière intestinale a été faite des lignes cellulaires de Caco-2/HT-29 et de l’équivalent de foie fait des sphéroïdes des lignes cellulaires d’HepaRG/HHSTeC. (D) Concentrations d’APAP intestinales/hépatiques 2-OC dans le côté apical de la barrière intestinale dans des conditions statiques et dynamiques. (E) Concentrations d’APAP intestinales/hépatiques 2-OC dans le milieu dans des conditions statiques et dynamiques. *P<0.05 statique vs conditions dynamiques. (F) Comparaison entre le profil concentration-temps de l’APAP dans notre système microphysiologique (courbe rouge et axe y) et un profil représentatif obtenu chez l’homme après une seule dose orale de 1000 mg (courbe noire et axe y). Les données ont été extraites de parcelles à l’aide de WebPlotDigitizer 4.2 (https://automeris.io/WebPlotDigitizer). Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Système HPLC Waters Alliance 2695 (Milford, MA, É.-U.), équipé d’une pompe quaternaire, d’un gestionnaire d’échantillons et d’un dégasser
Détecteur Waters 2996 Uv-Vis se déroule dans une portée de 210-400 nm
Contrôle du système, acquisition et traitement des données Waters Empower 2002 logiciel de chromatographie
Colonne Phase inversée Luna C18
(150 x 4,6 mm D.I.; taille des particules de 5 mm)
Phénoménex ( Phenomenex )
Colonne de garde Phase inversée Luna C18 (4 x 3 mm)
Phénoménex ( Phenomenex )
Phase mobile Solvant A- Acetonitrile
Solvant B- 0,10 M d’acétate d’ammonium, pH 6,8
Conditions isocratiques Heure A (%) B (%)
(min.)
15 5 95
Flux 1,0 mL/min
Volume d’injection 25 μL
Température 25 °C
Détection APAP UV @ 243 et 254 nm
Temps d’exécuter 15 minutes

Tableau 1 : Conditions et paramètres à utiliser pour les analyses HPLC-UV de l’APAP dans les matrices moyennes de culture.

Concentration nominale Concentration calculée d’APAP (μM) Moyenne (μM) S.D.b C.v. Dev
(μM) (Triplicate de chaque concentration) (μM) (%)c (%)d
Numéro d’analyse 1 2 3 4 5 6
0,25 (LOD) 0.02 0.08 0.21 0.14 0.08 0.27 0.13 0.11 84.96 + 46,05
0,50 (LLOQ) 0.31 0.36 0.29 0.47 0.42 0.65 0.41 0.05 12.72 + 17.08
1.00 0.87 0.87 0.80 1.04 1.02 1.01 0.93 0.04 3.76 + 6,65
2.50 2.44 2.61 2.52 2.42 2.56 2.54 2.52 0.04 1.54 -0.62
5.00 5.02 4.99 5.06 5.01 5.01 5.05 5.02 0.09 1.88 -0.45
10.00 10.21 10.13 9.96 10.25 10.08 10.21 10.14 0.10 0.97 -1.41
25.00 25.33 25.28 25.20 25.13 25.14 24.92 25.17 0.36 1.45 -0.67
50.00 50.30 50.04 50.51 49.70 49.98 49.19 49.95 0.86 1.71 +0,09
100.00 99.75 99.90 99.70 100.09 99.97 100.40 99.97 0.69 0.69 +0,03
R2 1.00 1.00 0.9999 1.00 1.00 0.9999

Tableau 2 : Variation inter-course – précision, précision et linéarité des échantillons de courbe standard préparés dans un mélange de milieu DMEM avec tampon d’acétate d’ammonium de 0,10 M (1:1, v/v) à partir de six analyses distinctes. a
a Une courbe linéaire a été adaptée aux données pour une réponse (APAP) par rapport à la concentration théorique telle que décrite dans Experimental. La concentration calculée a été dérivée de la lecture de la réponse pour chaque échantillon standard par rapport à la courbe d’étalonnage. Chaque entrée (analyse 1-6) correspond à la valeur moyenne de l’analyse du triplicate.
b SD= Écart type.
c C.V. (coefficient de variation. précision).
d d Exactitude (DEV %) = écart de la concentration calculée par rapport à la valeur nominale.
Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019).

Concentration nominale Concentration calculée d’APAP (μM) Moyenne S.D.b C.v. Dev
(μM) (Triplicate de chaque concentration) (μM) (μM) (%)c (%)d
Numéro d’analyse 1 2 3 4 5
0,25 (LOD) 0.34 0.12 0.30 0.16 0.00 0.18 0.08 45.46 +26,03
0,50 (LLOQ) 0.36 0.44 0.49 0.43 0.40 0.43 0.02 5.84 +14,97
1.00 0.87 0.98 1.04 0.94 0.83 0.93 0.04 4.67 +6,85
2.50 2.41 2.46 2.49 2.52 2.43 2.46 0.06 2.39 +1,56
5.00 5.00 4.99 5.12 5.10 5.14 5.07 0.15 3.00 -1.38
10.00 10.08 10.01 9.93 10.10 10.29 10.08 0.18 1.80 -0.81
25.00 25.14 25.18 24.96 25.32 25.35 25.19 0.45 1.78 -0.76
50.00 50.19 50.23 49.83 49.56 50.17 49.99 0.87 1.75 +0,01
100.00 99.87 99.84 100.10 100.13 99.80 99.95 2.12 2.12 +0,05
R2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

Tableau 3 : Variation inter-course – précision, précision et linéarité des échantillons de courbe standard préparés dans un mélange de milieu Williams avec tampon d’acétate d’ammonium de 0,10 M (1:1, v/v) à partir de six analyses distinctes. a
a Une courbe linéaire a été adaptée aux données pour une réponse (APAP) par rapport à la concentration théorique telle que décrite dans Experimental. La concentration calculée a été dérivée de la lecture de la réponse pour chaque échantillon standard par rapport à une courbe d’étalonnage. Chaque entrée (analyse 1-5) correspond à la valeur moyenne de l’analyse du triplicate.
b SD= Écart type.
c C.V. (coefficient de variation. précision).
d d Exactitude (DEV %) = écart de la concentration calculée par rapport à la valeur nominale.
Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019).

Williams moyen Concentration nominale Concentration mesurée S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-run (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.49 0.08 15.55 +1,77
4.50 4.59 0.23 5.10 -2.06
45.00 41.23 0.76 1.85 +8,37
90.00 82.29 1.75 2.13 +8,57
Inter-run (n=15) 0,50 (LLOQ) 0.43 0.05 10.99 +14,97
4.50 4.37 0.19 4.42 +2,99
45.00 42.35 0.82 1.93 +5,88
90.00 85.22 2.25 2.65 +5,31
DMEM moyen Concentration nominale Concentration mesurée S.d. C.v. Dev
(μM) (μM) (μM) (%) (%)
Intra-run (n=3) 0,50 (LLOQ) 0.47 0.09 18.77 +6,35
4.50 4.45 0.30 6.63 +1,04
45.00 44.24 1.59 3.58 +1,69
90.00 86.40 4.09 4.73 +4,00
Inter-run (n=12) 0,50 (LLOQ) 0.46 0.08 17.81 +7,75
4.50 5.16 0.27 5.31 -14.68
45.00 48.99 2.10 4.29 -8.86
90.00 96.18 4.47 4.65 -6.86

Tableau 4 : Précision et précision intra-et inter-exécuter pour APAP dans les échantillons de contrôle de la qualité. a
a Les données sont indiquées en moyenne. SD (écart type). C.V. (coefficient de variation. précision) et précision (écart en pourcentage. DEV%).
Ce chiffre a été modifié à partir de Marin et coll. Absorption et métabolisme de l’acétaminophène dans un système microphysiologique intestin/foie. Chem Biol Interagir. 299, 59-76 (2019).

Primer (5e → 3e)
Tissu Gène Avant Inverse
Intestin SGLT1/SLC5A1 gAgCCCAgCAACTgTCCCAC CAggCTCCAACACAgACggt
NA-K-ATPase ACCgCCCAgAAATCCCAAAAC CAgcggtCATCCCAgTCC
MDR1 (en) TggATgTTTCCggTTTggAg TgTgggCTgCTgATATTTTgg TgTgggCTTTTgg TgGggCTGTATATTTgg TgGGTATATTgg T
Foie Albumine TgCAAggCTgATAAggAg TTTAgACAgggTtTggCTTTACAC TTTAgACAgggTTGGCTTTACAC TTTAgACAgggTTGGCTTTACAC TTTAgACAgggT
GSTA2 (en) CTgAggAACAAgATgCCAAgC AgCAgAgggaggCTggAAATAAg AgCAgAgagAgagagAgagAg
CPY3A4 (en) ggAAggTggACCCAgAAACTgC TTACggTgCCATCCCTTgAC
UGT1A1 (en) ATgCAAAgCgCATggAgAC ggTCCTTgTgAggCTggAg

Tableau 5 : Amorce qPCR en temps réel pour évaluer la transcription des gènes au niveau de l’ARNm dans les cultures 2-OC pour les tissus intestinaux et hépatiques

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Discussion

L’évaluation précise et fiable des propriétés pharmacologiques des nouveaux médicaments d’investigation est essentielle pour réduire le risque dans les étapes de développement suivantes. Le MPS est une technologie relativement nouvelle, qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Notre groupe progresse dans l’évaluation des propriétés pharmacocinétiques et toxicologiques principalement nécessaires à l’optimisation du plomb. Nous avons travaillé avec le dispositif microfluidique 2-OC, qui a deux chambres, permettant l’intégration de deux organoïdes. APAP a été choisi parce qu’il a beaucoup de données humaines de haute qualité, est principalement métabolisé par le foie, et affiche également des propriétés hépatiques. Le protocole d’étude visait à imiter certaines étapes de l’essai clinique de phase I humaine, où un médicament est administré par voie orale à des volontaires, et des échantillons de sang périodiques sont prélevés pour évaluer la concentration des médicaments afin de connaître les propriétés pharmacocinétiques et les paramètres biochimiques et cliniques sont recueillis pour évaluer l’innocuité et la tolérabilité. Par conséquent, lorsque le SPM évolue suffisamment pour fournir des prédictions fiables, il réduira considérablement le risque d’échec dans l’essai de phase I. En ajoutant les modèles de maladies à l’avenir, la même hypothèse s’appliquera éventuellement aux essais cliniques de phases II et III.

Toutes les études ont été exécutées dans trois modèles : intestin 2-OC (administration orale d’APAP), foie 2-OC (administration intraveineuse), et intestin/foie 2-OC (administration orale). Le premier modèle a isolé l’absorption, le second le métabolisme, et le troisième intégré les deux. Nous avons d’abord produit les organoïdes et incorporé dans le dispositif microfluidique, ensuite administré l’APAP et recueilli les échantillons de médias, et dernière effectué une série de tests pour évaluer la viabilité cellulaire et la fonctionnalité et l’impact toxicologique de l’exposition APAP. Pour les études pharmacocinétiques, nous avons développé et validé une méthode chromatographique pour la quantification apap dans le milieu. La validation s’est conformée à la Directive sur la validation des méthodes bioanalytiques concernant la spécificité, la linéarité, la limite de quantification (LOQ), la limite de détection (LOD), l’effet matriciel, la précision et la précision, tel que décrit par fda29,30. La spécificité a été établie avec des échantillons biologiques vierges, mis en commun et individuels provenant de deux sources différentes. La méthode a été effectuée de façon acceptable au cours de l’analyse, et les données ont confirmé la capacité d’une phase mobile isocratique simple de séparer et de quantifier l’APAP.

La viabilité/fonctionnellement de l’intestin et des organoïdes de foie a été évaluée par différentes techniques. Pour l’équivalent intestinal, la microscopie confocale de fluorescence (figure 2A-B), l’essai de MTT (figure 2C), l’évaluation d’expression de gène (figure 2D-F)ou l’expérience de HCA, n’a détecté aucune toxicité 24 h après exposition d’APAP. De même, le test MTT n’a pas détecté d’insultes toxiques induites par l’APAP dans les équivalents hépatiques (Figure 3A). Toutefois, la technique HCA a ajouté la possibilité de détection d’événements toxiques très précoces (24 h après exposition à l’APAP) pour les cellules hépatiques, par l’observation de changements phénotypiques cellulaires, avec quelques indices mécanistes (Figure 3D). D’autre part, la microscopie confoccale de fluorescence (figure 3B) et l’histologie (figure 3C) se sont montrées être un outil complémentaire utile dans l’étude de l’état de viabilité des équivalents du tissu humain. Pour les cellules hépatiques, l’utilisation simultanée de différentes techniques était très avantageuse. L’analyse MTT, comme mentionné précédemment, n’a pas été en mesure de détecter la cytotoxicité APAP détectée par le HCA 24 h après l’exposition à l’APAP. Les analyses de l’expression génétique ont évalué la fonctionnalité de l’intestin (figure 2D-F) et des organoïdes hépatiques (figure 4A-D) à la fois basale et 24 h après le traitement APAP. Dans des conditions basales, il y avait des niveaux normaux des marqueurs intestinaux et foie-spécifiques, suggérant la fonctionnalité appropriée. Après 24 h d’exposition à l’APAP, il y a eu une baisse de la régulation de l’albumine, des niveaux d’ARNm de TPS et une tendance à réduire l’expression du gène CYP3A4 dans les tissus équivalents au foie, ce qui indique une cytotoxicité précoce de l’APAP. Corroborant ces résultats, les expériences occidentales de blotting ont prouvé que la réduction de l’expression de gène a été également accompagnée d’une réduction robuste de l’expression totale de protéine d’albumine de foie en réponse au traitement d’APAP (figure 4E-F),confirmant les insultes toxiques imposées sur le tissu de foie par exposition à APAP. Par conséquent, les expériences d’activité enzymatique in vitro ont montré une réduction robuste et progressive des niveaux d’activité CYP 3A4 induits par le traitement apap, dans les équivalents hépatiques (Figure 4H-I).

Des statistiques morphométriques des organoïdes ont été réalisées sur l’image J( figure 3E-I). La zone révèle à quel point la taille 2D est proche de tous les organoïdes analysés, qui pourraient être utilisés comme normalisation dans ce protocole afin qu’un résultat impartial puisse être produit. Les « descripteurs de forme » révèlent des statistiques correspondant précisément à la morphologie de la forme. Le rapport d’aspect est un indice qui utilise l’axe majeur et mineur, de sorte que les résultats autour de 1 n’indiquent aucun biais (c.-à-d., croissance préférentielle) pendant la formation organoïde. Les valeurs de rondeur (4 ×[zone]/ (π × [axe majeur]2)) sont très sensibles à une croissance préférentielle, qui serait révélée comme un axe majeur. La solidité ([zone]/ ([zone convexe])) est essentielle pour montrer une morphologie brute car elle n’est pas affectée par des irrégularités dans les frontières puisqu’elle utilise la zone convexe (=enveloppe). Les distributions centrées autour de 1,0 indiquent une croissance sphérique putative. Inversement, circularité (4× π [zone]/[périmètre]2) est très sensible à un périmètre complexe, de sorte que les « cavités » ou les « poches » auraient un impact sur cet indice. Ainsi, la circularité autour de 1 corrobore également la croissance sphérique putative, compatible avec la fonctionnalité organoïde appropriée.

Les résultats analytiques ont montré que le MPS pouvait imiter les propriétés d’absorption et de métabolisme de l’APAP, à la fois isolées ou intégrées dans une courbe comparable à celle produite in vivo (figure 5F) sans la phase d’excrétion. L’absorption d’APAP était semblable après administration orale aux modèles de MPS d’intestin ou d’intestin/foie, dans des conditions statiques et dynamiques (figure 5A-B, figure 5D-E). Dans les deux cas, il y avait une diminution de la concentration apap du côté apical simultanément à son augmentation du côté basolateral, sans différence significative pour des conditions statiques et dynamiques. En revanche, le métabolisme hepatic d’APAP a différé dans ces conditions. Les médias circulants dans MPS semblaient améliorer la capacité métabolique organoïde (figure 5C et figure 5E). Il y avait un afflux important de décomposition apap pas vu sans flux. Fait intéressant, in vitro, expériences d’activité CYP3A4 corroborer l’hypothèse que la présence de flux dans le système augmente la fonctionnalité des équivalents hépatiques humains. Comme le montre le graphique de la figure 4J, l’activité du CYP 3A4 était significativement plus élevée chez les équivalents hépatiques maintenus sous débit dans les conditions de traitement basales et apap. De même, les équivalents hépatiques maintenus sous flux (dynamique) ont montré une tendance à augmenter l’expression protéique de l’albumine par rapport à ceux maintenus sans flux (statique) à la fois à la ligne de base ou dans des conditions traitées par APAP (figure 4G).

Par rapport au profil concentration-temps après administration orale de l’APAP à l’homme, notre système microphysiologique montre beaucoup plus grand t1/2 (temps de demi-vie) (Figure 5F). Cela se produit, comme mentionné précédemment, parce que tandis que nous avons un système à deux organes avec l’intestin et les équivalents hépatiques qui peuvent absorber et métaboliser le médicament, il n’y a pas d’équivalent rénal pour excréter APAP et ses métabolites du compartimentplasmatique 38. En outre, le système microphysiologique montre plus petit Cmax (concentration plasmatique maximale) et plus grand tmax (temps d’atteindre Cmax) que ce qui est généralement observé pour les humains (Figure 5F). C’est une conséquence des différences dans l’échelle des expériences in vitro et in vivo. Dans l’ensemble, il existe trois principales différences entre le profil concentration-temps obtenu à l’aide du système microphysiologique et les profils obtenus après l’administration orale de l’APAP à l’homme : plus grand t1/2,plus petit C max et plus grand tmax (Figure 5F). Alors que le plus grand t1/2 est dû à l’absence d’un rein équivalent à excrétion APAP et ses métabolites de l’équivalent plasmatique, plus petit Cmax et plus grand tmax sont des conséquences de la petite échelle de l’expérience par rapport au corps humain. Les meilleures stratégies d’échelle pour la construction et l’exploitation de systèmes microphysiologiques sont toujours un domaine de recherche actif et il est peu probable qu’une approche unique soit optimale pour tous lessystèmes 39. En outre, la modélisation mathématique ou l’apprentissage automatique peuvent être utilisés pour appliquer des corrections ou apprendre la cartographie de la micro-échelle à la pleine échelle afin d’extrapoler les données in vitro obtenues avec les systèmes microphysiologiques au comportement in vivo observé chez l’homme40.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Christie Guguen-Guillouzo, le Dr Philippe Gripon de l’Unité 522 INSERM et le Dr Christian Trepo de l’Unité 271 INSERM pour l’utilisation du matériel biologique (cellules Hepa RG) et pour nous avoir mis à notre disposition afin d’effectuer la recherche universitaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Fisher Scientific 14190235 No calcium, no magnesium
2-OC TissUse GmbH Two-organ chip
384-well Spheroid Microplate Corning 3830 Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% Paraformaldehyde Use to fix cell
Acetaminophen Sigma Aldrich A7085 Use to MPS assays
Acetonitrile Tedia Used to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidin Thermo Fisher Scientific confocal experiment
Ammonium acetate Sigma Aldrich Used to perform HPLC
Caco-2 cells Sigma Aldrich 86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasks Sarstedt
Confocal Fluorescence microscope Leica DMI6000
Cryostat Leica CM1950
DMEM high glucose Thermo Fisher Scientific 12800017 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSO Sigma Aldrich D4540 Add 2% to HepaRG media
Ethanol Synth
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12657029
Freezing medium OCT Tissue-Tek Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cells Biopredic International HPR101 Undifferentiated cells
HHSTeC ScienCell Research Laboratories 5300 Cells and all culture supplements
Hoechst 33342 HCA experiments
HT-29 cells Sigma Aldrich 85061109
Human Insulin Invitrogen - Thermo Fisher Scientific 12585014
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Isopropanol Merck 278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamine Thermo Fisher Scientific A2916801
Luna C18 guard column SS Phenomenex Used to perform HPLC
Microscope Leica DMi4000
Microtome Leica RM2245
Millicell 0.4 µm pore size inserts Merck PIHP01250
Millicell ERS-2 meter Merck MERS00002 Used to TEER measurement
MitoTracker Deep Red HCA experiments
MTT Thermo Fisher Scientific M6494
MX3000P system Agilent Technologies
Neubauer chamber Counting cells
Operetta High Content Imaging System Perkin Elmer Used to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA Promega Cat.# V9001
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063 Cell culture
Permount Thermo Fisher Scientific Histology
Primers RT-qPCR
PVDF membrane BioRad
PVDF Syringe filter 0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 column Phenomenex Used to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) IKA Works GmbH & Co 2819000 Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM) ScienCell 5301 Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific
TRizol TM reagent Thermo Fisher Scientific Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solution Thermo Fisher Scientific R001100
Ultra-low-attachment plates Corning CLS3471-24EA 6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well Microplate PerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams E Pan Biotech P04-29510 Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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References

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Chimie Numéro 166 Système microphysiologique Acétaminophène ADMETox Organoïdes
Un système microphysiologique intestinal/hépatique pour l’évaluation pharmacocinétique et toxicologique des médicaments
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Marin, T. M., Indolfo, N. d. C.,… More

Marin, T. M., Indolfo, N. d. C., Rocco, S. A., de Carvalho, M., Dias, M. M., Vasconcelos Bento, G. I., Bortot, L. O., Schuck, D. C., Lorencini, M., Pagani, E. An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment. J. Vis. Exp. (166), e60184, doi:10.3791/60184 (2020).

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