Summary
该方法涉及利用前列腺癌患者的临床诊断数据,以指导采样程序,当生物银行组织遵循根治前列腺切除术。这克服了以前发布的方法中有关为更广泛的下游应用提供新鲜组织的效率和可用性的问题。
Abstract
以前的生物库前列腺组织方法,在根前列腺切除术后,通常涉及随机抽样。为了提高效率,使更广泛的下游应用,开发了一种更有针对性的前列腺组织取样方法。在这里,我们使用磁共振成像 (MRI) 和活检数据来定位器官的特定区域进行采样。该方法涉及使用先前公布的前列腺切片装置,从前列腺预定区域去除5毫米横向切片,然后从该切片的预定区域去除6毫米冲孔活检。这些样品可以冷冻储存或固定用于生物库目的,或立即使用新鲜肿瘤含量的70%的置信度,而随机抽样方法的置信度为10%。这使得所有标准的下游技术,如基因组学,蛋白质组学或组织学工作,但也工作需要新鲜组织,如活组织成像或前体培养。
Introduction
获得高质量的人类前列腺癌组织是推动该领域有效研究的关键要求。有许多现有的方法样本前列腺组织后,根治前列腺切除术的研究。通常,这些涉及使用冲床活检从新鲜、冷冻或固定的前列腺组织切片中随机抽取样本,并追溯性地确认每个样本中是否存在由血氧林和欧辛 (H&E) 评估的肿瘤。泌尿科医生1,2,3,4,5。最近的一项审查汇编了这些现有方法的概述6。这些方法对于某些下游应用非常有用,在哪些应用中,组织可以储存和评估肿瘤含量,例如大规模基因组分析,如国际癌症基因组联盟 (ICGC) 和癌症基因组图谱 (TCGA)4,7.然而,如果我们使用磁共振成像(MRI)和/或活检数据来定位前列腺的特定区域进行取样,这些方法就可以改进。这将从两个方面改进方法;首先,通过减少采集的组织样本数量,提高效率,减轻病理科室的压力和储存成本;其次,允许立即使用新鲜组织,而无需立即确认肿瘤含量,用于新的先进技术下游技术,如活组织成像、有机体生成或体外培养。这一研究需要导致了PEOPLE(PatiEntprstatesamPLesresearch)方法的发展,并且前84例使用PEOPLE的生物库的结果最近发表在8。该方法的变体也已出版与三维(3D)打印切片装置和患者专用模具,以方便在固定前和固定后组织9,10的体外MRI。
Protocol
该协议符合当地准则,并经 UCL/UCLC 生物库研究伦理委员会批准(参考 15/YH/0311)。
注:由于这种方法涉及人体组织的取样,因此在开始议定书之前必须遵守所有有关伦理和同意的当地程序。如果手术前有MRI和活检数据,肿瘤直径为5毫米,则可包括根治性前列腺切除术病例。如果指数病变未明确定义,则应排除病例,即MRI只能看到扩散变化。
1. 前列腺切片装置
- 购买前列腺切片器械(材料表)。或者,使用以前发布的10中的 3D 打印机打印刀片句柄。
注:此处使用的设备和一次性刀片是在英国伦敦癌症研究所根据材料转移协议购买的。
2. 肿瘤靶向
- 查看临床笔记,以确定诊断活检(例如左后背)指示的指数病变。
- 查看 MRI 图像以测量上述肿瘤的位置。
- 找出肿瘤在轴向平面上最可见的序列,例如T2加权。
- 滚动轴向图像,查找肿瘤最大的图像,并打印图像供参考。
- 在相应的日冕图像中,测量从前列腺底部到所选轴向位置的距离,以及前列腺从顶点到基(mm)的全长,并打印以供参考。
3. 普波里普的收集
- 检查患者说明,确保此程序及任何下游研究应用已获得适当的知情同意。
- 在进行激进的前列腺切除术后,将前列腺收集在干锅中。确保前列腺没有添加形式性或其他固定剂。
- 转移到适当的无菌位置进行取样,例如,病理实验室的层流罩。
- 如果需要新鲜组织,请尽快进行取样。
注:对于某些应用(例如,评估不应像RNA一样迅速降解的DNA),第二天冷藏标本并取样可能合适。
4. 标本制备
- 使用无菌技术,根据局部净化程序制备层流罩和前列腺切片装置。在这里,喷洒 70% 乙醇并擦拭所有表面。使用无菌一次性针头和手术刀。使用切片机刀片最多三次;每次在热肥皂水中清洗后,然后用70%乙醇喷雾和擦拭。
- 使用标准刻度称量前列腺 (g)。
- 墨水前列腺。用蓝色墨水画左侧,用黑色墨水绘制右侧。用墨水覆盖整个胶囊和精囊,以稍后表示手术边缘。
注:墨迹书写过程可能因当地而异,并可以相应地修改。
5. 前列腺切片
- 通过将壁垂直插入支架底部来组装切片设备(图 1A)。
- 放置前列腺,使基和顶点朝向对面的墙壁,后侧向下和前向上。在前列腺周围放置金针。如有必要,将前列腺稍微向内推,以获得舒适的配合,这将在切片期间支持前列腺。
- 使用标尺测量从基础到顶点的前列腺长度,并与 MRI 测量的前列腺长度进行比较。如果前列腺收缩,则对从基片到目标横向切片的预期距离进行临时校正。例如,如果 MRI 图像中的前列腺全长为 50 mm,但此时使用标尺测量时,其收缩至 45 mm,则预期切片位置减少 10%。
- 从基片到所需横向切片的测量。选择最接近此测量值的针脚进行切片。
- 戴链式手套,以防止受伤,按住切片装置(图1B),放置刀片两侧的识别针,并使用垫片保持刀片5毫米分开。用长笔划缓慢而坚定地向下、向前和向后移动刀片(图 1C)。在拆卸设备之前,确保已分离完整切片。
- 取下墙壁和别针,用手套小心地将切片取出到软木板无菌片上。
6. 组织取样
- 目视检查横向切片并与轴向 MRI 图像进行比较。在某些情况下,肿瘤区域可能比周围组织显得苍白。
- 轻轻拍打横向切片。在某些情况下,肿瘤可能比周围组织感觉更牢固。
- 使用轴向 MRI 图像作为参考,选择一个或多个采样区域。
-
对所需组织区域进行活检。
- 使用 6 mm 冲孔,向下推到所需的组织区域。
- 将组织冲孔当场和向下扭在软木塞上,以确保完全分离,必要时使用锋利的手术刀进行分离。
- 使用柱塞弹出,根据需要拆下冲孔并放入管/模具中。
- 根据需要对进一步的肿瘤和良性样本重复上述步骤,并单独使用无菌活检冲孔。用红色墨水打孔的孔。
- 注意每个冲头的位置以及前列腺的重量以及组织颜色/硬度的任何观察。
7. 提交前列腺进行局部诊断
- 在固定前用无菌一次性针头将前列腺固定在软木塞上,以防止组织收缩和翘曲,从而改变手术边缘的外观。
- 固定在软木塞后,将前列腺提交组织病理学部门进行标准临床诊断。
8. 设备净化
- 丢弃所有一次性设备,并丢弃当地指定的生物医学废物流和/或锐化容器。
- 根据适合人体组织的局部风险评估(例如,用 70% EtOH 喷涂和擦拭),对层状流罩和前列腺切片设备进行净化。
Representative Results
使用PEOPLE方法取样的新鲜前列腺组织可用于各种下游技术,包括基因组测序和外生培养。使用此方法抽样的前 59 个案例以前已发布,与该方法的早期版本相比,以及初始下游数据8。从第一次切片前列腺到冷冻/固定这里的冲孔活检的时间约为1分钟,这是保持到最低限度,以避免RNA的降解。从切除前列腺到前列腺切片的时间也应保持在最低限度,尽管这里花了大约20分钟,因为我们的手术室和病理实验室在不同的地点。
根据下游应用,通常至少采集两个样本:一个来自预期肿瘤组织区域,另一个来自预期良性组织区域。取样方法本身成功的关键衡量标准是评估给定样本中的肿瘤含量。
要进入100,000个基因组项目,H&E染色组织部分必须由泌尿病理学家评估,并且样本必须包含至少40%的肿瘤细胞。如果样本成功地进行了宏解剖,则含有少于 40% 肿瘤的样本仍可能包含在项目中。在首批92例中,64%的病例至少含有40%的肿瘤,并提交到10万个基因组计划,没有大解剖。脱氧核糖核酸(DNA)被提取,在所有情况下均具有足够的产量和质量(表1)。与较早的方法8相比,这些样本中的59个样本的初始子集已经发布。
对于前体培养,匹配的肿瘤和良性组织必须有足够的质量来承受72小时培养,而不会显著降解。从总共3名患者身上的多个组织样本中成功培养8。
图1:前列腺切片装置。该仪器是根据癌症研究所的材料转移协议获得的。(A) 壁垂直于底座,金针插入前列腺周围的底座(前列腺未图所示)。(B) 可更换的平行刀片插入刀片手柄。(C) 刀片在金针之间穿过,以切割前列腺的 5 mm 部分。请点击此处查看此图的较大版本。
n (%) | |
命中(>40%肿瘤) | 59 (64%) |
部分命中(5-30%肿瘤) | 6 (7%) |
错过 (0% 肿瘤) | 27 (29%) |
总 | 92 (100%) |
表1:肿瘤命中率。肿瘤的命中率是由一位专门研究前列腺癌的顾问病理学家在对H&E染色组织进行审查后确定的。根据英国基因组学指南,确定大于40%的肿瘤细胞含量适合纳入100,000个基因组计划。
Discussion
该协议中的关键步骤包括确定用于取样的肿瘤区域、测量前列腺和组织取样。首先,测量 MRI 以确定采样的正确区域是关键。我们在随附的视频中演示了此方法;但是,我们也建议首先与放射科医生确认测量结果。清晰的临床笔记,将研究人员指向包含索引病变的 MRI 图像区域是理想的。其次,应谨慎测量前列腺,确保标尺以一定角度测量从基到顶的全长,与前列腺前部平行。第三,在取样前应确认肿瘤区域,通过目视检查与原始MRI图像相关的组织切片,对组织进行触觉(在某些情况下,肿瘤区域可以感觉更密集),并目视评估组织的颜色(在某些病例肿瘤会比周围的良性组织显得更苍白)。
该协议已由非临床博士后研究人员、病理学研究员、病理学顾问和研究技术人员在 UCL/UCLH 全面执行。根据我们的经验,无论技术背景如何,在十种情况下都可以学习到协议的所有步骤。但是,我们建议放射科医生进行 MRI 测量培训,病理学家首先进行切片培训。该协议可以使用 3D 打印切片句柄进行修改,如之前发布的10。
该技术的潜在局限性包括妨碍诊断的风险。切前列腺是一个关键步骤,如果做错,可能会妨碍分级或正保证金率。这里有两个潜在的问题。首先,如果所有指数病变被移除并立即用于新鲜组织实验,则不会针对该病变进行常规临床诊断,并且患者可能被误诊为患有低级癌症。为了避免这种情况,研究人员应与顾问病理学家讨论取样计划,顾问病理学家将在取样之前定期审查病例,并商定要采集的样本的数量和位置。因此,小肿瘤可能局部排除。其次,如果在固定前未正确固定前列腺胶囊固定在软木板上,这可能允许内部组织在固定过程中向外凸起,从而改变手术边缘。这可能导致假阳性边缘,其中剩余的肿瘤似乎驻留在胶囊纯粹由于组织扭曲。
该技术在现有方法上的意义主要在于肿瘤靶向。迄今为止,已经公布了一系列对激进前列腺切除术标本进行取样的方法;然而,这些都依赖于完全或部分随机抽样方法1,2,3,4,5,6,7。使用活检,特别是MRI数据,提高了效率,允许减少采样与获得肿瘤组织8的信心。
与以前的取样方法相比,这种方法的未来应用允许采用更广泛的下游技术。例如,具有高肿瘤概率的新鲜组织的可用性意味着可以使用更昂贵和/或劳动密集型的新鲜组织技术,因为不需要许多样本来确保肿瘤的存在。这可以包括但不限于前体培养、前体 MRI、高级成像和转录组学。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢前列腺癌英国资助SH在前列腺癌英国卓越中心和旅行奖奖学金(TLD-PF16-004)和惠普根据INNOVATE (PG14-018-TR2)。这项工作得到了英国国家卫生研究院伦敦医院生物医学研究中心的研究人员的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 mm biopsy punch | Fisher Scientific | 13404607 | Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples |
Black Ink | Leica Biosystems | 3801753 | Tissue marking & margin dye |
Blue Ink | Leica Biosystems | 3801751 | Tissue marking & margin dye |
Chainmail hand glove | Arco | 1456803 | Chainmail gloves to protect hand during slicing |
Cork board | Fisher Scientific | 12396447 | Cork board for pinning prostate to following sampling procedure |
Needles | SLS (Scientific Laboratory supplies) | SYR6112 | Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling |
Prostate slicing aparatus | Insitute of Cancer Research, London | NA - must be obtained under MTA | A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins |
References
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