Summary
この方法は、ラジカル前立腺切開術後のバイオバンキング組織のサンプリング手順を導くために前立腺癌患者の臨床診断データの利用を含む。これにより、より広範な下流アプリケーション向けの新鮮な組織の効率性と可用性に関する以前に公開された方法の問題を克服できます。
Abstract
前立腺組織をバイオバンキングするための以前の方法は、ラジカル前立腺切開術に続いて、一般的にランダムサンプリングを伴う。効率を高め、より広範な下流アプリケーションを可能にするために、前立腺組織をサンプリングするより標的化された方法が開発された。ここでは、磁気共鳴イメージング(MRI)と生検データの両方を使用して、サンプリングのために臓器の特定の領域を標的にします。この方法は、前立腺の所定の領域から5mmの横スライスを除去する以前に公開された前立腺スライス装置の使用を含み、続いて、このスライスの所定の領域から6mmのパンチ生検を除去する。これらのサンプルは、バイオバンキングの目的で凍結または固定保存することも、ランダムサンプリングアプローチからの10%の信頼度と比較して、腫瘍含有量の70%の信頼度ですぐに新鮮に使用することができます。これにより、ゲノミクス、プロテオミクス、組織学的研究などの標準的な下流技術を使用できますが、生組織イメージングや生体内培養などの新鮮な組織を必要とする作業も可能になります。
Introduction
高品質のヒト前立腺癌組織へのアクセスは、現場で効果的な研究を推進するための重要な要件です。研究のための根本的な前立腺切開術後に前立腺組織をサンプリングする既存の方法の数があります。通常、これらは、前立腺組織の新鮮な、凍結または固定されたスライスからランダムなサンプルを採取するためにパンチ生検を使用し、ヘマトキシリン&エオシン(H&E)によって評価された各サンプルに腫瘍が存在するかどうかを遡及的に確認することを含む。泌尿器科医1,2,3,4,5.最近のレビューでは、これらの既存のメソッドの概要をまとめた6.これらの方法は、国際がんゲノムコンソーシアム(ICGC)やがんゲノムアトラス(TCGA)のような大規模なゲノム解析など、後日組織を保存して腫瘍含有量を評価できる特定の下流アプリケーションに役立ちます。4,7.しかし、磁気共鳴イメージング(MRI)や生検データを使用してサンプリングのために前立腺の特定の領域を標的にする場合、これらの方法は改善される可能性があります。これにより、2 つの方法で方法論が改善されます。第一に、採取した組織サンプルの数を減らすことで、効率を高め、病理学部門への圧力を低減し、第二に、新鮮な組織を即時に確認することなくすぐに使用できるようにすることで、腫瘍含有量は、生組織イメージング、オルガノイド生成またはex vivo培養などの最先端の下流技術の新しい状態のために。この研究の必要性は、PEOPLE(rEsearchのためのPatiEnt prOstate samPr)法の開発につながり、PEOPLEを用いてバイオバンクされた最初の84症例の結果が最近8に発表された。この方法のバリエーションはまた、3次元(3D)印刷スライス装置および患者特異的金型で公表されており、固定前および後固定組織9、10上のex vivo MRIを容易にするために。
Protocol
このプロトコルは現地のガイドラインに準拠しており、UCL/UCLCバイオバンク研究倫理委員会(参考文献15/YH/0311)によって承認されています。
注:この方法はヒト組織のサンプリングを伴うので、倫理と同意に関するすべての局所的な手順は、プロトコルを開始する前に観察されなければならない。MRIと生検の両方のデータが手術前に利用可能である場合、腫瘍直径≥5mmの場合は、指数病変が十分に定義されていない場合、すなわち、MRIによって見られる拡散変化のみが除外されるべきである場合には、根本的な前立腺切除術を含むことがある。
1. 前立腺スライス装置
- 前立腺スライス装置(材料の表)を購入します。または、以前に公開された10として 3D プリンターを使用してブレード ハンドルを印刷します。
注:ここで使用される装置および使い捨てブレードは、英国ロンドン癌研究所から材料移転契約の下で購入された。
2. 腫瘍標的
- 臨床ノートを確認して、診断生検で示されるインデックス病変を特定します。
- MRI画像を確認して、上記の腫瘍の位置を測定します。
- 腫瘍が軸面で最も見える配列を見つける(例えば、T2重み付け)。
- 軸画像をスクロールして、腫瘍が最も大きい画像を見つけ、参照用の画像を印刷します。
- 対応する冠状画像では、前立腺の基部から選択された軸位置までの距離、および頂点からベース(mm)までの前立腺の全長を測定し、参照用に印刷する。
3. プロステートのコレクション
- 患者のメモをチェックして、この手順および下流の研究アプリケーションに対して適切なインフォームド コンセントが取得されていることを確認します。
- 根本的な前立腺の前立腺を引き起し、乾いたポットで前立腺を集める。ホルマリンやその他の固定剤が前立腺に追加されていないことを確認します。
- サンプリングのための適切な滅菌場所、例えば、病理実験室の層流フードへの転移。
- 新鮮な組織が必要な場合は、できるだけ早くサンプリングに進みます。
注:特定の用途(例えば、RNAほど速く分解してはならないDNAの評価)については、検体を冷蔵し、翌日サンプルを採取することが適切な場合があります。
4. 試料調製
- 無菌技術を使用して、地元の除染手順に従って層流フードと前立腺スライス装置を準備します。ここでは、70%のエタノールをスプレーし、すべての表面にわたって拭きます。滅菌の単一使用の針およびメスを使用する。スライサーブレードを最大3回使用してください。熱い石鹸水で使用するたびに洗浄し、スプレーし、70%エタノールで拭きます。
- 標準スケールを使用して前立腺(g)の重量を量る。
- 前立腺にインクを塗る。左側を青いインクで塗り、右側を黒インクで塗ります。完全なカプセルと精液をインクで覆い、後で外科的余裕を示します。
注:インクの手順はローカルで異なる場合があり、それに応じて変更できます。
5. 前立腺スライス
- 壁をスタンドの基部に垂直に挿入してスライス装置を組み立てる(図1A)。
- ベースと頂点が反対側の壁に向き合い、後側を下にして前駆を上にして、前立腺を配置します。前立腺の周りに金のピンを配置します。スライス中に前立腺をサポートするぴったりフィットを得るために必要に応じて、前立腺をわずかに内側に押します。
- 定規を使用して、ベースから頂点までの前立腺の長さを測定し、MRIで測定した前立腺長と比較します。前立腺が縮小している場合は、ベースからターゲット横スライスまでの予想距離にアドホック補正を適用します。たとえば、MRI 画像内の前立腺の全長が 50 mm の場合、この時点で定規で測定した場合は 45 mm に縮小し、予想されるスライス位置を 10% 減少させます。
- ベースから目的の横スライスまで測定します。この測定値に最も近いピンを選択してスライスします。
- 怪我を防ぐためにチェーンメール手袋を着用し、スライス装置(図1B)を保持し、識別されたピンの両側にブレードを配置し、スペーサーを使用してブレードを5mm離します。長いストロークでブレードをゆっくりとしっかりと動かしてスライスを取ります(図1C)。装置を分解する前に、完全なスライスが分離されていることを確認します。
- 壁やピンを取り外し、手袋を使用してコルク板の無菌シートにスライスを慎重に取り出します。
6. 組織サンプリング
- 横スライスを目視で検査し、軸MRI画像と比較します。場合によっては、腫瘍領域が周囲の組織よりも淡く見えることがある。
- 横のスライスをそっと触れなさい。場合によっては、腫瘍が周囲の組織よりも強く感じることがある。
- 軸 MRI イメージをガイドとして使用して、サンプリング用の 1 つ以上の領域を選択します。
-
組織の所望の領域の生検パンチを取る。
- 6 mm のパンチを使用して、組織の所望の領域を押し下げる。
- 完全な分離を確保し、必要に応じて分離するために鋭いメスを使用するために、その場でティッシュパンチをその場で、下にねじります。
- パンチを取り外し、プランジャーを使用して排出することにより、必要に応じてチューブ/モールドに配置します。
- 別々の滅菌生検パンチで、必要に応じてさらに腫瘍および良性サンプルを繰り返す。パンチが赤で撮影された穴をインクします。
- 前立腺の重量と組織の色/堅さに関する任意の観察と一緒に各パンチの位置に注意してください。
7. 局所診断のための前立腺の提出
- 前立腺を、手術の余白の外観を変える可能性のある組織の収縮および反りを防ぐために、固定前に無菌の単一使用針でコルクにピン留めします。
- コルクにピン留めした後、標準的な臨床診断のための前立腺を病理学部門に提出する。
8. 装置の除染
- バイオメディカル廃棄物の流れやシャープ容器内のすべての使い捨て機器は、現地で指定されているように廃棄します。
- 人間の組織に適した局所的なリスク評価に従って層流フードおよび前立腺スライス装置を除染する(例えば、70%EtOHと拭き取ることによって)。
Representative Results
PEOPLE法を用いてサンプリングされた新鮮な前立腺組織は、ゲノムシーケンシングおよびex vivo培養を含む様々な下流技術に使用することができる。このメソッドを使用してサンプリングされた最初の 59 件のケースは、以前のバージョンのメソッドと比較して、初期のダウンストリーム データ8と共に公開されています。前立腺を最初にスライスしてからここでパンチ生検を凍結/固定するまでの時間は約1分であり、RNAの劣化を避けるために最小限に抑えられました。前立腺の除去から前立腺スライスまでの時間も最小限に抑える必要がありますが、ここでは劇場と病理学の研究室が異なる場所にあるため、約20分かかりました。
下流の適用に応じて、典型的には少なくとも2つのサンプルが採取される:1つは予想される腫瘍組織の領域から、もう1つは予想される良性組織の領域から採取される。サンプリング方法自体の成功の重要な尺度は、所定のサンプル中の腫瘍含有量を評価することです。
100,000ゲノムプロジェクトに参入するには、H&E染色組織セクションを泌尿器科医によって評価する必要があり、サンプルには少なくとも40%の腫瘍細胞が含まれている必要があります。腫瘍の40%未満を含むサンプルは、正常にマクロ解剖された場合、プロジェクトに含まれる可能性があります。この方法でサンプリングされた最初の92症例のうち、64%は少なくとも40%の腫瘍を含み、マクロ解剖なしで100,000ゲノムプロジェクトに提出された。DNAを抽出し、すべての場合において十分な収率と品質であった(表1)。これらのサンプルの59の初期サブセットは、以前の方法8と比較して以前に公開されました。
生体内培養の場合、一致した腫瘍および良性組織は、著しい分解なしに72h培養に耐える十分な品質でなければならない。合計3人の患者からの複数の組織サンプルを正常に培養した8.
図1:前立腺スライス装置。本装置は、がん研究所から物質的移転契約を受けて取得した。(A)壁はベースに垂直に挿入され、金のピンは前立腺を取り囲むベースに挿入されます(前立腺は描かれていない)。(B)交換可能なパラレルブレードがブレードハンドルに挿入されます。(C)ブレードは前立腺の5mmのセクションをスライスするために金のピンの間を通過する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| n (%) | |
| ヒット (>40% 腫瘍) | 59 (64%) |
| 部分的なヒット (5-30% 腫瘍) | 6 (7%) |
| ミス(0%腫瘍) | 27 (29%) |
| 合計 | 92 (100%) |
表1:腫瘍ヒット率。腫瘍ヒット率は、H&E染色組織のレビューに続いて、前立腺癌を専門とするコンサルタント病理学者によって決定された。>40%の腫瘍細胞含有量は、ゲノミクス・イングランドのガイドラインに基いえ、100,000ゲノムプロジェクトに含めるのに適していると判断された。
Discussion
このプロトコル内の重要なステップには、サンプリングのための腫瘍領域の同定、前立腺の測定、および組織サンプリングが含まれます。まず、サンプリングの正しい領域を識別するためのMRIの測定が重要である。この方法は、付属のビデオで示します。ただし、最初のインスタンスでは放射線科医による測定値の確認もお勧めします。インデックス病変を含むMRI画像の領域に向かって研究者を指す明確な臨床ノートが理想的です。第二に、前立腺の測定は注意して行われるべきであり、定規は前立腺の前平に平行に、ベースから頂点までの全長を測定する角度で保持されることを保証する。第三に、腫瘍領域は、元のMRI画像に関連して組織スライスを視覚的に検査し、組織を触診し(場合によっては腫瘍領域がより密に感じられる)、組織の色を視覚的に評価することによって、サンプリング前に確認する必要があります(一部の場合)。腫瘍が周囲の良性組織よりも青白く見える場合)。
このプロトコルは、非臨床ポストドクター研究者、病理学フェロー、病理学コンサルタント、および研究技術者によってUCL/UCLHで完全に実施されています。私たちの経験では、プロトコルのすべてのステップは、技術的な背景に関係なく、10のケースの下で学ぶことができます。しかし、最初のインスタンスでのスライスに関する病理学者からのMRI測定とトレーニングに関する放射線科医からのトレーニングをお勧めします。プロトコルは、以前に公開された10のように、3D 印刷されたスライス ハンドルを使用して変更できます。
技術の潜在的な制限は、診断を妨げるリスクが含まれます。前立腺のスライスは重要なステップであり、間違って行われた場合、グレーディングまたは正のマージンレートを妨げる可能性があります。ここには 2 つの潜在的な問題があります。第一に、すべてのインデックス病変を除去し、すぐに新鮮な組織実験に使用した場合、定期的な臨床診断はこの病変に対して行われず、患者は低グレードの癌を有すると誤診される可能性がある。これを回避するために、研究者は、サンプリングの前に定期的にケースをレビューし、採取するサンプルの数と場所に合意するコンサルタント病理学者とサンプリング計画について話し合う必要があります。小さな腫瘍は、この理由から局所的に除外されてもよい。第二に、前立腺カプセルが固定前にコルク板に正しく固定されていない場合、これは、内組織が固定中に外側に膨らみ、外科的マージンを変更することができます。これは偽陽性マージンにつながる可能性があります, 残りの腫瘍は、組織のワープのために純粋にカプセルに存在するように見えます.
既存の方法に関するこの技術の重要性は、主に腫瘍標的に関する。ラジカル前立腺腫瘍標本をサンプリングするための方法の範囲は、現在までに公開されています。しかし、これらはすべて、完全または部分的にランダムなサンプリングアプローチ1、2、3、4、5、6、7に依存しています。生検および特にMRIデータの使用は、効率を改善し、腫瘍組織8を得ることの信頼性を高めたサンプリングの減少を可能にした。
この方法の将来のアプリケーションは、以前のサンプリング方法よりも広い範囲のダウンストリーム技術を採用することを可能にします。例えば、腫瘍である可能性が高い新鮮な組織の可用性は、腫瘍の存在を確保するために多くのサンプルが必要とされないので、より高価で、または労働集約的な新鮮な組織技術を利用できることを意味する。これには、ex vivo培養、ex vivo MRI、高度なイメージングおよびトランスクリプトミクスが含まれ、これらに限定されない。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、前立腺癌英国優秀・旅行賞フェローシップ(TLD-PF16-004)およびHPの下で前立腺癌英国の資金調達のために英国前立腺癌を認めたいと考えています(PG14-018-TR2)。この研究は、国立衛生研究所カレッジロンドン病院生物医学研究センターの研究者によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm biopsy punch | Fisher Scientific | 13404607 | Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples |
| Black Ink | Leica Biosystems | 3801753 | Tissue marking & margin dye |
| Blue Ink | Leica Biosystems | 3801751 | Tissue marking & margin dye |
| Chainmail hand glove | Arco | 1456803 | Chainmail gloves to protect hand during slicing |
| Cork board | Fisher Scientific | 12396447 | Cork board for pinning prostate to following sampling procedure |
| Needles | SLS (Scientific Laboratory supplies) | SYR6112 | Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling |
| Prostate slicing aparatus | Insitute of Cancer Research, London | NA - must be obtained under MTA | A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins |
References
- Sooriakumaran, P., Henderson, A., Denham, P., Langley, S. E. A novel method of obtaining prostate tissue for gene expression profiling. International Journal of Surgical Pathology. 17 (3), 238-243 (2009).
- Jhavar, S. G., et al. Processing of radical prostatectomy specimens for correlation of data from histopathological, molecular biological, and radiological studies: a new whole organ technique. Journal of Clinical Pathology. 58 (5), 504-508 (2005).
- Wheeler, T. M., Lebovitz, R. M. Fresh tissue harvest for research from prostatectomy specimens. The Prostate. 25 (5), 274-279 (1994).
- Esgueva, R., et al. Next-generation prostate cancer biobanking: toward a processing protocol amenable for the International Cancer Genome Consortium. Diagnostic Molecular Pathology. 21 (2), 61-68 (2012).
- Dev, H., et al. Biobanking after robotic-assisted radical prostatectomy: a quality assessment of providing prostate tissue for RNA studies. Journal of Translational Medicine. 9, 121 (2011).
- Tolkach, Y., et al. Blind Biobanking of the Prostatectomy Specimen: Critical Evaluation of the Existing Techniques and Development of the New 4-Level Tissue Extraction Model With High Sampling Efficacy. The Prostate. 77 (4), 396-405 (2017).
- Warren, A. Y., et al. Method for sampling tissue for research which preserves pathological data in radical prostatectomy. The Prostate. 73 (2), 194-202 (2013).
- Heavey, S., et al. PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch, a tissue collection pathway utilizing magnetic resonance imaging data to target tumor and benign tissue in fresh radical prostatectomy specimens. The Prostate. 79 (7), 768-777 (2019).
- Bailey, C., et al. VERDICT MRI validation in fresh and fixed prostate specimens using patient-specific moulds for histological and MR alignment. NMR in Biomedicine. 32 (5), 4073 (2019).
- Bourne, R. M., et al. Apparatus for Histological Validation of In Vivo and Ex Vivo Magnetic Resonance Imaging of the Human Prostate. Frontiers in Oncology. 7, 47 (2017).
