Summary
Denne metoden innebærer utnyttelse av kliniske diagnostiske data for prostata kreftpasienter for å veilede prøvetaking prosedyrer, når biobanking vev etter radikale prostatektomi. Dette overvinner problemer med tidligere publiserte metoder rundt effektivitet og tilgjengelighet av friskt vev for et bredere spekter av nedstrøms applikasjoner.
Abstract
Tidligere metoder for biobanking prostata vev, etter radikale prostatektomi, generelt involvert tilfeldig prøvetaking. For å øke effektiviteten, og muliggjøre et større spekter av nedstrøms applikasjoner, en mer målrettet metode for prøvetaking prostata vev ble utviklet. Her bruker vi både magnetisk resonans imaging (MRI) og biopsi data for å målrette bestemte områder av orgelet for prøvetaking. Metoden innebærer bruk av en tidligere publisert prostata kutting enhet som fjerner en 5 mm tverrgående skive fra en forhåndsbestemt område av prostata, etterfulgt av fjerning av 6 mm punch biopsier fra forhåndsbestemte områder av denne sektoren. Disse prøvene kan lagres frosset eller fast for biobanking formål, eller brukes friskt umiddelbart med 70% tillit til tumor innhold, sammenlignet med 10% tillit fra tilfeldig prøvetaking tilnærming. Dette gjør det mulig å bruke alle standard nedstrøms teknikker som Genomics, Proteomikk eller histologiske arbeid, men også arbeid som krever friskt vev som levende vev Imaging eller ex vivo kultur.
Introduction
Tilgang til høy kvalitet menneskelig prostata kreft vev er et viktig krav for å drive effektiv forskning på feltet. Det finnes en rekke eksisterende metoder for å prøve prostata vev etter radikale prostatektomi for forskning. Karakteristisk disse innvolvere benytter punsj biopsier å ta tilfeldig eksemplar fra en frisk, frosset eller bestemt skive av prostata tissue, og ettertid bekreftende hvorvidt eller ikke svulst er gave inne hver eksemplar av hematoksylin & eosin (H & E) idet vurdert av en uropathologist1,2,3,4,5. En fersk gjennomgang har samlet en oversikt over disse eksisterende metodene6. Disse metodene er nyttige for visse nedstrøms applikasjoner, hvor vev kan lagres og vurderes for tumor innhold på et senere tidspunkt, slik som stor skala genomisk analyser som International Cancer Genova Consortium (ICGC) og The Cancer Genova Atlas (TCGA) 4,7. Imidlertid kan disse metodene bli bedre på i hvis vi skulle bruke magnetisk resonans imaging (MRI) og/eller biopsi data for å målrette bestemte områder av prostata for prøvetaking. Dette vil forbedre metodikken på to måter; for det første, ved å redusere antall vevsprøver samlet, øke effektiviteten og redusere presset på patologi avdelinger og kostnader for lagring, og for det andre, ved å tillate friskt vev skal brukes umiddelbart uten behov for umiddelbar bekreftelse av tumor innhold, for ny state of the art nedstrøms teknologier som levende vev Imaging, organoid generasjon eller ex vivo kultur. Denne forskningen trenger har ført til utviklingen av PEOPLE (pasient prostata prøver for forskning) metoden, og resultatene fra de første 84 tilfellene biobanked bruker PEOPLE ble nylig utgitt8. En variant av denne metoden har også blitt publisert med en tredimensjonal (3D) trykt kutting apparat og pasient-spesifikk mold, for å lette ex vivo MRI på pre-og post-fiksering tissue9,10.
Protocol
Protokollen overholder lokale retningslinjer og er godkjent av UCL/UCLC biobank forskningskomité (referanse 15/YH/0311).
Merk: Ettersom denne metoden innebærer prøvetaking av menneskelig vev, må alle lokale prosedyrer om etikk og samtykke observeres i forkant av begynnelsen av protokollen. Radikale prostatektomi tilfeller kan inkluderes hvis både MRI og biopsi data er tilgjengelig i forkant av kirurgi, med tumor diameter ≥ 5 mm. saker bør utelukkes hvis indeksen lesjon er ikke godt definert, det vil si, bare diffuse endringer er synlig av MRI.
1. prostata kutting apparater
- Kjøp prostata skjære apparatet (tabell av materialer). Du kan også skrive ut et blad håndtak med en 3D-skriver som tidligere publisert10.
Merk: Enheten og engangsblader brukt her ble kjøpt under materiell overføring avtale fra Institute of Cancer Research, London, UK.
2. tumor målretting
- Review kliniske notater for å identifisere indeksen lesjon som indikert av diagnostisk biopsi, for eksempel venstre bakre.
- Se gjennom MRI-bilder for å måle plasseringen av svulsten som er nevnt ovenfor.
- Finn sekvensen der svulsten er mest synlig i aksial planet, for eksempel, T2-vektet.
- Bla gjennom aksial bilder for å finne bildet der svulsten er størst og Skriv ut bildet som referanse.
- I den tilsvarende koronale bildet, måle avstanden fra bunnen av prostata til den valgte aksial posisjon, og den fulle lengden av prostata fra Apex til Base (mm), og skrive ut for referanse.
3. innsamling av pProstate
- Sjekk pasient merknadene for å sikre at passende informert samtykke er innhentet for denne prosedyren og eventuelle nedstrøms forskningsprogrammer.
- Etter radikale prostatektomi, samle prostata i en tørr gryte. Sørg for at ingen formalin eller andre bindemiddel er lagt til prostata.
- Overfør til et egnet sterilt sted for prøvetaking, f. eks, en laminær Flow hette i et patologi laboratorium.
- Fortsett til prøvetaking så snart som mulig hvis ferskt vev er nødvendig.
Merk: For visse applikasjoner (f.eks. vurdering av DNA som ikke bør forringes så raskt som RNA), kan det være hensiktsmessig å kjøle prøven og ta prøver neste dag.
4. forberedelse av prøver
- Klargjør laminær strømnings hette og prostata skjære apparater i henhold til lokale rense prosedyrer, ved hjelp av steril teknikk. Her spray 70% etanol og tørk over alle overflater. Bruk sterile engangsnåler og skalpeller. Bruk slicer-blader opptil tre ganger; vask etter hver bruk i varmt såpevann, deretter spray og tørk med 70% etanol.
- Veie prostata (g) ved hjelp av en standard skala.
- Blekk prostata. Male venstre side med blått blekk og høyre side med svart blekk. Dekk hele kapselen og sæd blemmer med blekk til senere betegne de kirurgiske marginer.
Merk: Håndskrifts prosedyrer kan variere lokalt og kan endres tilsvarende.
5. prostata kutting
- Monter skjære apparatet ved å sette veggene vinkelrett inn i sokkelen på stativet (figur 1A).
- Plasser prostata slik at basen og Apex står overfor motstående vegger, med bakre side ned og fremre opp. Plasser gull pinner rundt prostata. Push prostata innover litt om nødvendig for å få en tettsittende passform, som vil støtte prostata under kutting.
- Mål prostata lengde fra base til Apex, ved hjelp av en linjal, og sammenligne med prostata lengde målt ved MRI. Hvis prostata har krympet, bruke en ad hoc korreksjon til den forventede avstanden fra base til målet tverrgående skive. For eksempel, hvis den fulle lengden av prostata i MRI-bildet er 50 mm, men målt med en linjal på dette punktet har det krympet til 45 mm, redusere forventet kutting posisjon med 10%.
- Mål fra basen til ønsket tverrgående skive. Velg pinnen som ligger nærmest denne målingen for å skjære rundt.
- Bruk Chainmail hansker for å hindre skade, hold skjæreenheten (figur 1B), plasser knivene på hver side av den identifiserte pinnen, og bruke avstandsstykket til å holde bladene 5 mm fra hverandre. Ta Slice ved langsomt og fast flytte knivene nedover, forover og bakover med lange slag (figur 1C). Sørg for at hele stykket er separert før du demontere apparatet.
- Fjern vegger og pinner og nøye ta Slice ut på et sterilt ark med kork bord ved hjelp av hansker.
6. Vevsprøve
- Inspiser den tverrgående skive og sammenlign med aksial MRI-bildet. I noen tilfeller kan tumor området vises blekere enn omkringliggende vev.
- Palpate den tverrgående skive forsiktig. I noen tilfeller kan svulsten føles fastere enn det omgivende vevet.
- Bruk aksial MRI-bildet som en veiledning, og velg ett eller flere områder for prøvetaking.
-
Ta biopsi slag av ønsket område av vev.
- Bruk en 6 mm punch, trykk ned på ønsket område av vev.
- Vri vevet punch på stedet og ned mot korken for å sikre full separasjon og bruke en skarp skalpell å skille om nødvendig.
- Fjern punsj og plasser i rør/muggsopp som nødvendig ved å mate ut ved hjelp av stempelet.
- Gjenta for ytterligere tumor og godartet prøver som kreves, med separate sterile biopsi slag. Blekk hullene der slag ble tatt i rødt.
- Merk plasseringen av hvert slag sammen med vekten av prostata og eventuelle observasjoner på vev farge/fasthet.
7. innlevering av prostata for lokal diagnostikk
- PIN prostata til kork med sterile engangsnåler før fiksering for å hindre vev krymping og fordreining, som kan endre utseendet på kirurgiske marginer.
- Etter låsing til kork, sende prostata til histopatologi avdeling for standard klinisk diagnostikk.
8. rensing av apparat
- Kast alt disponibel utstyr i biomedisinsk avfallsstrømmer og/eller Avfallsbeholdere som angitt lokalt.
- Decontaminate den laminær strømnings panseret og prostata skjære apparater i samsvar med lokale risikovurderinger egnet til menneskelig vev (for eksempel ved sprøyting med 70% EtOH og tørke).
Representative Results
Fersk prostata vev samplet ved hjelp av PEOPLE metoden kan brukes til en rekke nedstrøms teknikker, inkludert genomisk sekvensering og ex vivo kultur. De første 59 tilfellene samplet ved hjelp av denne metoden har tidligere blitt publisert i sammenligning med en tidligere versjon av metoden, sammen med første nedstrøms data8. Tiden fra første kutting prostata å fryse/fikse punch biopsier her var ca 1 min, som ble holdt til et minimum for å unngå nedbrytning av RNA. Tid fra fjerning av prostata til prostata kutting bør også holdes til et minimum, men her dette tok ca 20 min på grunn av vår teater og patologi Labs være på forskjellige steder.
Avhengig av nedstrøms programmet, vanligvis minst to prøvene er tatt: en fra et område av forventet tumor vev og en fra et område av forventet godartet vev. Nøkkelen måle suksess for prøvetaking metoden selv er å vurdere tumor innhold i en gitt prøve.
For innreise til 100 000 genomer prosjektet, en H & E beiset tissue delen må vurderes av en uropathologist, og prøven må inneholde minst 40% tumorceller. Prøver som inneholder mindre enn 40% tumor kan fortsatt være inkludert i prosjektet hvis de er vellykket macrodissected. Av de første 92 tilfellene samplet på denne måten, 64% inneholdt minst 40% svulst og ble sendt til den 100 000 genomer Project uten macrodissection. DNA ble ekstrahert og var av tilstrekkelig utbytte og kvalitet i alle tilfeller (tabell 1). En første del av 59 av disse prøvene ble tidligere publisert i sammenligning med en tidligere metode8.
For ex vivo kultur, matchet tumor og godartet vev må være av tilstrekkelig kvalitet til å tåle 72 h kultur uten signifikant degradering. Flere vevsprøver fra totalt tre pasienter ble kultivert med suksess8.
Figur 1: prostata skjære apparater. Dette apparatet ble innhentet i henhold til materiell overføringsavtale fra Institute of Cancer Research. (A) veggene er satt vinkelrett på basen, og gull pinner er satt inn i basen rundt prostata (prostata ikke avbildet). (B) de utskiftbare parallelle knivene settes inn i blad håndtaket. (C) bladene passerer mellom gull pinner for å skjære en 5 mm del av prostata. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| n (%) | |
| Hit (> 40% svulst) | 59 (64%) |
| Delvis treff (5-30% tumor) | 6 (7%) |
| Miss (0% svulst) | 27 (29%) |
| Totalt | 92 (100%) |
Tabell 1: slag rate for tumor. Tumor hit rate ble bestemt av en konsulent patologen som spesialiserer seg på prostatakreft, etter gjennomgang av H & E farget vev. Tumor celleinnhold på > 40% var bestemt på å være egnet for inkludering i 100 000 genomer Project, i henhold til Genomics England retningslinjer.
Discussion
Kritiske skritt i denne protokollen inkluderer identifisering av tumor regionen for prøvetaking, måling av prostata, og vevsprøver. For det første, måling av MRI å identifisere riktig område av prøvetaking er nøkkelen. Vi demonstrerer denne metoden i den med følgende videoen; Vi anbefaler imidlertid også at du bekrefter målinger med en radiolog i første omgang. Clear kliniske notater som peker forskeren mot området av MRI-bilder som inneholder indeksen lesjon er ideelle. Dernest bør måling av prostata utføres med forsiktighet, slik at linjalen holdes i en vinkel for å måle hele lengden fra base til Apex, parallelt med fremre av prostata. For det tredje bør tumor områder bekreftes før prøvetaking ved å visuelt inspisere vevet skive i forhold til det opprinnelige MRI-bildet, palpating vevet (i noen tilfeller tumor området kan føle seg mer tett), og visuelt vurdere fargen på vevet (i noen tilfeller svulsten vises mer blek enn omkringliggende godartet vev).
Denne protokollen har blitt gjennomført i sin helhet på UCL/UCLH av ikke-kliniske postdoktor forskere, en patologi stipendiat, patologi konsulenter, og forskning teknikere. I vår erfaring alle trinn av protokollen kan læres i under ti tilfeller uavhengig av teknisk bakgrunn. Vi anbefaler imidlertid opplæring fra en radiolog angående Mr-måling og opplæring fra patologen om kutting i første instans. Protokollen kan endres ved hjelp av en 3D trykt kutting håndtak, som tidligere publisert10.
Potensielle begrensninger av teknikken inkluderer risikoen for å hindre på diagnose. Kutting prostata er et viktig trinn, som kan hindre på gradering eller positive margin priser hvis det gjøres feil. Det er to potensielle problemer her. For det første, hvis alle av indeksen leksjonen er fjernet og anvendt for frisk tissue eksperimentering med det samme, praksis klinisk Diagnostics ville ikke være gjennomførte for denne leksjonen og pasienten kanskje være feildiagnostisert idet har en lavere grade kreften. For å unngå dette, bør forskeren diskutere prøveplanen med konsulenten patologen som rutinemessig vil gjennomgå saken, før prøvetaking, og bli enige om antall, og plassering, av prøvene som skal tas. Små svulster kan utelukkes lokalt på grunn av dette. Dernest, hvis prostata kapselen ikke er festet ned riktig til kork bord før fiksering, dette kan tillate det indre vevet å bule utover under fiksering, endre kirurgiske marginer. Dette kan føre til en falsk positiv margin, hvor de resterende tumor ser ut til å ligge på kapselen rent på grunn av vev fordreining.
Betydningen av denne teknikken med hensyn til eksisterende metoder ligger hovedsakelig med tumor målretting. En rekke metoder for prøvetaking radikale prostatektomi prøver har blitt publisert til dato; men disse er avhengige av en helt eller delvis tilfeldig prøvetaking tilnærming1,2,3,4,5,6,7. Bruk av biopsi og spesielt MRI-data her har forbedret effektivitet, noe som åpner for redusert prøvetaking med økt tillit til å skaffe tumor vev8.
Fremtidige anvendelser av denne metoden tillater adopsjon av et bredere spekter av nedstrøms teknikker enn med tidligere Prøvetaking metoder. For eksempel, tilgjengeligheten av friskt vev som har en høy sannsynlighet for å bli tumor betyr at dyrere og/eller arbeidskrevende intensive friske vev teknikker kan utnyttes, så mange prøver er ikke nødvendig for å sikre tilstedeværelsen av tumor. Dette kan inkludere og er ikke begrenset til, ex vivo-kultur, ex vivo MRI, avansert bildebehandling og transcriptomics.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne prostatakreft UK for finansiering SH under prostatakreft UK Center of Excellence og reiser Prize Fellowship (TLD-PF16-004) og HP under INNOVERE (PG14-018-TR2). Dette arbeidet ble støttet av forskere ved National Institute for Health Research University College London sykehus Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm biopsy punch | Fisher Scientific | 13404607 | Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples |
| Black Ink | Leica Biosystems | 3801753 | Tissue marking & margin dye |
| Blue Ink | Leica Biosystems | 3801751 | Tissue marking & margin dye |
| Chainmail hand glove | Arco | 1456803 | Chainmail gloves to protect hand during slicing |
| Cork board | Fisher Scientific | 12396447 | Cork board for pinning prostate to following sampling procedure |
| Needles | SLS (Scientific Laboratory supplies) | SYR6112 | Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling |
| Prostate slicing aparatus | Insitute of Cancer Research, London | NA - must be obtained under MTA | A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins |
References
- Sooriakumaran, P., Henderson, A., Denham, P., Langley, S. E. A novel method of obtaining prostate tissue for gene expression profiling. International Journal of Surgical Pathology. 17 (3), 238-243 (2009).
- Jhavar, S. G., et al. Processing of radical prostatectomy specimens for correlation of data from histopathological, molecular biological, and radiological studies: a new whole organ technique. Journal of Clinical Pathology. 58 (5), 504-508 (2005).
- Wheeler, T. M., Lebovitz, R. M. Fresh tissue harvest for research from prostatectomy specimens. The Prostate. 25 (5), 274-279 (1994).
- Esgueva, R., et al. Next-generation prostate cancer biobanking: toward a processing protocol amenable for the International Cancer Genome Consortium. Diagnostic Molecular Pathology. 21 (2), 61-68 (2012).
- Dev, H., et al. Biobanking after robotic-assisted radical prostatectomy: a quality assessment of providing prostate tissue for RNA studies. Journal of Translational Medicine. 9, 121 (2011).
- Tolkach, Y., et al. Blind Biobanking of the Prostatectomy Specimen: Critical Evaluation of the Existing Techniques and Development of the New 4-Level Tissue Extraction Model With High Sampling Efficacy. The Prostate. 77 (4), 396-405 (2017).
- Warren, A. Y., et al. Method for sampling tissue for research which preserves pathological data in radical prostatectomy. The Prostate. 73 (2), 194-202 (2013).
- Heavey, S., et al. PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch, a tissue collection pathway utilizing magnetic resonance imaging data to target tumor and benign tissue in fresh radical prostatectomy specimens. The Prostate. 79 (7), 768-777 (2019).
- Bailey, C., et al. VERDICT MRI validation in fresh and fixed prostate specimens using patient-specific moulds for histological and MR alignment. NMR in Biomedicine. 32 (5), 4073 (2019).
- Bourne, R. M., et al. Apparatus for Histological Validation of In Vivo and Ex Vivo Magnetic Resonance Imaging of the Human Prostate. Frontiers in Oncology. 7, 47 (2017).
