Summary
Denna metod innebär användning av kliniska diagnostiska data för prostatacancerpatienter för att vägleda provtagningsförfaranden, när biobankning vävnad efter Radikal prostatektomi. Detta övervinner problem med tidigare publicerade metoder kring effektivitet och tillgång till färsk vävnad för ett bredare spektrum av nedströms applikationer.
Abstract
Tidigare metoder för biobankning av prostatavävnad, efter Radikal prostatektomi, omfattade i allmänhet slumpmässigt urval. För att öka effektiviteten och möjliggöra ett större utbud av nedströmsprogram utvecklades en mer målinriktad metod för provtagning av prostatavävnad. Här använder vi både magnetisk resonanstomografi (MRI) och biopsi data för att rikta specifika områden av orgeln för provtagning. Metoden innebär användning av en tidigare publicerad prostata skivning enhet som tar bort en 5 mm tvärgående skiva från en förutbestämd region i prostatan, följt av avlägsnande av 6 mm Punch biopsier från förutbestämda områden av denna sektor. Dessa prover kan lagras frysta eller fasta för biobankning ändamål, eller används färskt omedelbart med 70% förtroende för tumör halt, jämfört med 10% förtroende från slumpmässig provtagning. Detta gör det möjligt att använda alla standard nedströms tekniker såsom genomik, proteomik eller histologiskt arbete, men också arbete som kräver färsk vävnad såsom levande vävnad Imaging eller ex vivo kultur.
Introduction
Tillgång till hög kvalitet mänsklig prostatacancer vävnad är ett centralt krav för att driva effektiv forskning inom området. Det finns ett antal befintliga metoder för att prova prostatavävnad efter Radikal prostatektomi för forskning. Typiskt dessa innebär att använda Punch biopsier att ta slumpmässiga prover från en färsk, fryst eller fast bit av prostatavävnad, och retrospektivt bekräftar huruvida tumören finns i varje prov av hematoxylin & eosin (H & E) som bedöms av en uropatolog1,2,3,4,5. En nyligen genomgång har sammanställt en översikt över dessa befintliga metoder6. Dessa metoder är användbara för vissa nedströms tillämpningar, där vävnad kan lagras och bedömas för tumör halt vid ett senare tillfälle, såsom storskaliga genomiska analyser som International cancer Genome Consortium (ICGC) och cancer Genome Atlas (TCGA) 4,7. Dessa metoder skulle dock kunna förbättras om vi skulle använda magnetisk resonanstomografi (MRI) och/eller biopsidata för att rikta in sig på specifika områden av prostatan för provtagning. Detta skulle förbättra metodiken på två sätt; för det första genom att minska antalet insamlade vävnadsprover, öka effektiviteten och minska trycket på patologi avdelningarna och lagringskostnaderna, och för det andra genom att låta färsk vävnad användas omedelbart utan behov av omedelbar bekräftelse av tumör halt, för nya toppmoderna tekniker som levande vävnad Imaging, Organoid generation eller ex vivo kultur. Detta forskningsbehov har lett till utvecklingen av de människor (PatiEnt prostata prov för forskning) metod, och resultaten från de första 84 fall biobanked med hjälp av människor publicerades nyligen8. En variant av denna metod har också publicerats med en tredimensionell (3D) tryckt skivning apparat och patientspecifika mögel, för att underlätta ex vivo MRI på före och efter fixering vävnad9,10.
Protocol
Protokollet följer lokala riktlinjer och godkänns av UCL/UCLC Biobank Research etik Committee (referens 15/YH/0311).
Anmärkning: Eftersom denna metod inbegriper provtagning av mänsklig vävnad, måste alla lokala procedurer avseende etik och samtycke följas innan protokollet inleds. Radikala prostatektomi-fall kan inkluderas om både MRT-och biopsidata finns tillgängliga före operationen, med tumör diameter ≥ 5 mm. fall bör uteslutas om index lesionen inte är väl definierad, d.v.s. endast diffusa förändringar är synliga vid MRT.
1. apparat för prostata skärning
- Köpa prostata skivning apparat (tabell över material). Du kan också skriva ut ett blad handtag med en 3D-skrivare som tidigare publicerat10.
Anmärkning: Enheten och engångsbladen som används här köptes under material överföringsavtal från Institute of cancer Research, London, UK.
2. tumör inriktning
- Granska kliniska anmärkningar för att identifiera index lesionen som indikeras av diagnostiska biopsi, e.g., vänster bakre.
- Granska MRI-bilder för att mäta placeringen av ovanstående tumör.
- Hitta den sekvens där tumören är mest synlig i det axiella planet, t. ex., T2-vägd.
- Bläddra genom axiella bilder för att hitta den bild där tumören är störst och skriv ut bilden som referens.
- I motsvarande koronala bild, mäta avståndet från basen av prostatan till den valda axiella positionen, och den fulla längden av prostatan från Apex till basen (mm), och skriv ut för referens.
3. insamling av pProstate
- Kontrollera patient noteringar för att säkerställa att lämpligt informerat samtycke har erhållits för detta förfarande och eventuella efterföljande forskningsansökningar.
- Efter Radikal prostatektomi, samla in prostatan i en torr kruka. Se till att ingen formalin eller andra fixativ har lagts till i prostatan.
- Överför till en lämplig steril plats för provtagning, t ex ett laminärt flödes skydd i ett patologi laboratorium.
- Fortsätt till provtagning så snart som möjligt om färsk vävnad krävs.
Anmärkning: För vissa tillämpningar (t. ex. bedömning av DNA som inte bör brytas ned lika snabbt som RNA) kan det vara lämpligt att kyla preparatet och ta prover nästa dag.
4. preparat beredning
- Förbered laminär Flow Hood och prostata skivning apparater enligt lokala sanering förfaranden, med hjälp av steril teknik. Här, spraya 70% etanol och torka över alla ytor. Använd sterila engångsnålar och skalpeller. Använd utsnitts blad upp till tre gånger; Tvätta efter varje användning i hett tvålvatten, sedan spraya och torka med 70% etanol.
- Väg prostatan (g) med en standard skala.
- Bläck prostatan. Måla vänster sida med blått bläck och höger sida med svart bläck. Täck hela kapseln och sädesblåsor med bläck för att senare beteckna de kirurgiska marginalerna.
Anmärkning: Inking-procedurer kan variera lokalt och kan ändras i enlighet med detta.
5. prostata skivning
- Montera skivning apparaten genom att sätta in väggarna vinkelrätt i stativet (figur 1A).
- Placera prostata så att basen och Apex står inför motsatta väggar, med den bakre sidan nedåt och anterior upp. Placera guldnålar runt prostata. Tryck prostata inåt något om det behövs för att få en ombonad passform, som kommer att stödja prostatan under skivning.
- Mät prostata längd från bas till Apex, med hjälp av en linjal, och jämföra med prostata längd mätt med MRI. Om prostatan har krympt, tillämpa en ad hoc-korrigering till det förväntade avståndet från bas till mål tvärgående skiva. Till exempel, om den fulla längden av prostatan i MRI-bilden är 50 mm, men när den mäts med en linjal på denna punkt har krympt till 45 mm, minska den förväntade skivning position med 10%.
- Mät från basen till önskad tvärgående skiva. Välj den PIN-kod som ligger närmast denna mätning för att skära runt.
- Bär Chainmail handskar för att förhindra skada, håll skivning enhet (figur 1B), placera bladen på vardera sidan av den identifierade stift och använda spacer för att hålla bladen 5 mm isär. Ta skiva genom att sakta och stadigt flytta bladen nedåt, framåt och bakåt med långa streck (figur 1C). Se till att en hel skiva har separerats innan apparaten demonterats.
- Ta bort väggar och stift och försiktigt ta slice ut på ett sterilt ark kork ombord med handskar.
6. provtagning av vävnad
- Inspektera det tvärgående segmentet visuellt och jämför med den axiella MRI-bilden. I vissa fall, tumör området kan visas blemmare än omgivande vävnad.
- Palpate den tvärgående slice försiktigt. I vissa fall, tumören kan kännas fastare än den omgivande vävnaden.
- Använd den axiella MRI-bilden som guide och välj ett eller flera områden för provtagning.
-
Ta biopsi stansar av önskat område av vävnad.
- Med en 6 mm Punch, tryck ner på önskat område av vävnad.
- Vrid vävnaden Punch på plats och ner mot korken för att säkerställa full separation och använda en skarp skalpell att separera vid behov.
- Ta bort stans och placera i rör/formar som behövs genom att mata ut med hjälp av kolven.
- Upprepa för ytterligare tumör och godartade prover som krävs, med separata sterila biopsi stansar. Bläcket hålen där stansar togs i rött.
- Notera placeringen av varje Punch tillsammans med vikten av prostata och eventuella observationer på vävnad färg/fasthet.
7. inlämning av prostata för lokal diagnostik
- Stift prostatan till kork med sterila engångsnålar före fixering för att förhindra vävnad krympning och skevhet, vilket kan förändra utseendet på de kirurgiska marginalerna.
- Efter fastlåsning till Cork, skicka prostatan till histopatologisk avdelning för standard klinisk diagnostik.
8. dekontaminering av apparater
- Kassera all engångsutrustning i biomedicinska avfallsströmmar och/eller behållare för vassa föremål som utsetts lokalt.
- Sanera laminarflödeshuven och prostataskivning i enlighet med lokala riskbedömningar som är lämpliga för mänsklig vävnad (t. ex. genom sprutning med 70% EtOH och torkning).
Representative Results
Färsk prostatavävnad som samplas med hjälp av PEOPLE-metoden kan användas för en mängd olika nedströmstekniker, inklusive genomisk sekvensering och ex vivo-kultur. De första 59 fall som samplas med denna metod har tidigare publicerats i jämförelse med en tidigare version av metoden, tillsammans med inledande nedströms data8. Tiden från första skivning prostatan till frysning/fastställande av Punch biopsier här var ungefär 1 min, som hölls till ett minimum för att undvika nedbrytning av RNA. Tid från avlägsnande av prostata till prostata skivning bör också hållas till ett minimum, men här tog ca 20 min på grund av vår teater och patologi Labs är på olika platser.
Beroende på nedströms ansökan, vanligtvis minst två prover tas: en från ett område med förväntad tumör vävnad och en från ett område med förväntad godartad vävnad. Det viktigaste måttet på framgång för själva urvalsmetoden är att bedöma tumör innehållet i ett givet prov.
För inträde i 100 000 genomen hos-projektet måste ett H & E-målat vävnads avsnitt bedömas av en uropatolog, och provet måste innehålla minst 40% tumörceller. Prover som innehåller mindre än 40% tumör kan fortfarande ingå i projektet om de framgångsrikt macrodissected. Av de första 92 fall som ingick i urvalet på detta sätt innehöll 64% minst 40% tumör och lämnades in till 100 000 Genomes-projektet utan makrodissektion. DNA extraherades och var av tillräcklig avkastning och kvalitet i samtliga fall (tabell 1). En första delmängd av 59 av dessa prover publicerades tidigare i jämförelse med en tidigare metod8.
För ex vivo kultur, matchade tumör och godartad vävnad måste vara av tillräcklig kvalitet för att tåla 72 h kultur utan betydande nedbrytning. Flera vävnadsprover från sammanlagt tre patienter odlade framgångsrikt8.
Figur 1: apparat för prostata skärning. Denna apparat erhölls enligt material överföringsavtal från Institute of cancer Research. (A) väggarna sätts vinkelräta mot basen, och guldnålar sätts in i basen som omger prostatan (prostata inte bilden). (B) de utbytbara parallella bladen sätts in i blad handtaget. (C) bladen passerar mellan guldsprintar för att skära en 5 mm del av prostatan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| n (%) | |
| Hit (> 40% tumör) | 59 (64%) |
| Partisk hit (5-30% tumör) | 6 (7%) |
| Miss (0% tumör) | 27 (29%) |
| Totala | 92 (100%) |
Tabell 1: tumör träff hastighet. Tumör träff Rate bestämdes av en konsult patolog som specialiserat sig på prostatacancer, efter granskning av H & E färgade vävnad. Tumör cells halt på > 40% bestämdes att vara lämplig för att ingå i 100 000 Genomes-projektet, enligt Genomics Englands riktlinjer.
Discussion
Kritiska steg inom detta protokoll inkluderar identifiering av tumör region för provtagning, mätning av prostata, och vävnads provtagning. För det första är mätning av MRI för att identifiera rätt område av provtagning nyckeln. Vi visar denna metod i den medföljande videon; men vi rekommenderar också att bekräfta mätningar med en radiolog i första hand. Tydliga kliniska noter som pekar forskaren mot området för MRI-bilder som innehåller index lesionen är idealiska. För det andra bör mätning av prostatan utföras med försiktighet, se till att linjalen hålls i en vinkel för att mäta hela längden från bas till Apex, parallellt med den främre av prostatan. För det tredje bör tumör områden bekräftas före provtagning genom att visuellt inspektera vävnaden slice i förhållande till den ursprungliga MRI bilden, palperas vävnaden (i vissa fall tumör området kan kännas tätare), och visuellt bedöma färgen på vävnaden (i vissa fall tumören kommer att visas mer blek än omgivande godartad vävnad).
Detta protokoll har genomförts i sin helhet på UCL/UCLH av icke-kliniska postdoktorala forskare, en patologi Fellow, patologi konsulter, och forskningstekniker. Enligt vår erfarenhet kan alla steg i protokollet läras ut i under tio fall oavsett teknisk bakgrund. Vi rekommenderar dock utbildning från en radiolog om MRI mätning och utbildning från en patolog om skivning i första hand. Protokollet kan ändras med hjälp av ett 3D-tryckt skivning handtag, som tidigare publicerats10.
Möjliga begränsningar av tekniken inkluderar risken för att hindra diagnos. Skivning av prostatan är ett nyckelsteg, vilket kan hämma vid gradering eller positiva marginal räntor om det görs felaktigt. Det finns två möjliga problem här. För det första, om alla index lesion avlägsnas och används för färsk vävnad experiment omedelbart, rutinmässig klinisk diagnostik kommer inte att utföras för denna lesion och patienten kan feldiagnostiseras som har en lägre grad cancer. För att undvika detta bör forskaren diskutera provtagningsplanen med konsulten patolog som rutinmässigt kommer att granska ärendet, före provtagning, och enas om antalet, och lokalisering, av prover som skall tas. Små tumörer kan uteslutas lokalt av denna anledning. För det andra, om den prostatiska kapseln inte fästs korrekt på kork ombord före fixering, detta kan göra det möjligt för den inre vävnaden att utbuktning utåt under fixering, ändra de kirurgiska marginalerna. Detta kan leda till en falsk positiv marginal, där den återstående tumören verkar vistas på kapseln enbart på grund av vävnad skevhet.
Betydelsen av denna teknik med avseende på befintliga metoder ligger främst med tumör inriktning. En rad metoder för provtagning av radikala prostatektomi-prover har hittills publicerats. dessa förlitar sig dock på en helt eller delvis slumpmässig urvalsmetod1,2,3,4,5,6,7. Användningen av biopsi och i synnerhet MRI data här har förbättrad effektivitet, möjliggör minskad provtagning med ökat förtroende för att få tumör vävnad8.
Framtida tillämpningar av denna metod medger antagande av ett bredare spektrum av nedströmstekniker än med tidigare provtagningsmetoder. Till exempel, tillgången på färsk vävnad som har en hög sannolikhet för att vara tumör innebär att dyrare och/eller arbetsintensiva färsk vävnad tekniker kan utnyttjas, eftersom många prover inte krävs för att säkerställa närvaron av tumör. Detta kan innefatta och är inte begränsat till, ex vivo kultur, ex vivo MRI, avancerad avbildning och transcriptomics.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna prostatacancer UK för finansiering SH under prostatacancer UK Centre of Excellence och resa Prize Fellowship (TLD-PF16-004) och HP under innovation (PG14-018-TR2). Detta arbete stöddes av forskare vid National Institute for Health Research University College London Hospitals biomedicinska forskningscentret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm biopsy punch | Fisher Scientific | 13404607 | Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples |
| Black Ink | Leica Biosystems | 3801753 | Tissue marking & margin dye |
| Blue Ink | Leica Biosystems | 3801751 | Tissue marking & margin dye |
| Chainmail hand glove | Arco | 1456803 | Chainmail gloves to protect hand during slicing |
| Cork board | Fisher Scientific | 12396447 | Cork board for pinning prostate to following sampling procedure |
| Needles | SLS (Scientific Laboratory supplies) | SYR6112 | Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling |
| Prostate slicing aparatus | Insitute of Cancer Research, London | NA - must be obtained under MTA | A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins |
References
- Sooriakumaran, P., Henderson, A., Denham, P., Langley, S. E. A novel method of obtaining prostate tissue for gene expression profiling. International Journal of Surgical Pathology. 17 (3), 238-243 (2009).
- Jhavar, S. G., et al. Processing of radical prostatectomy specimens for correlation of data from histopathological, molecular biological, and radiological studies: a new whole organ technique. Journal of Clinical Pathology. 58 (5), 504-508 (2005).
- Wheeler, T. M., Lebovitz, R. M. Fresh tissue harvest for research from prostatectomy specimens. The Prostate. 25 (5), 274-279 (1994).
- Esgueva, R., et al. Next-generation prostate cancer biobanking: toward a processing protocol amenable for the International Cancer Genome Consortium. Diagnostic Molecular Pathology. 21 (2), 61-68 (2012).
- Dev, H., et al. Biobanking after robotic-assisted radical prostatectomy: a quality assessment of providing prostate tissue for RNA studies. Journal of Translational Medicine. 9, 121 (2011).
- Tolkach, Y., et al. Blind Biobanking of the Prostatectomy Specimen: Critical Evaluation of the Existing Techniques and Development of the New 4-Level Tissue Extraction Model With High Sampling Efficacy. The Prostate. 77 (4), 396-405 (2017).
- Warren, A. Y., et al. Method for sampling tissue for research which preserves pathological data in radical prostatectomy. The Prostate. 73 (2), 194-202 (2013).
- Heavey, S., et al. PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch, a tissue collection pathway utilizing magnetic resonance imaging data to target tumor and benign tissue in fresh radical prostatectomy specimens. The Prostate. 79 (7), 768-777 (2019).
- Bailey, C., et al. VERDICT MRI validation in fresh and fixed prostate specimens using patient-specific moulds for histological and MR alignment. NMR in Biomedicine. 32 (5), 4073 (2019).
- Bourne, R. M., et al. Apparatus for Histological Validation of In Vivo and Ex Vivo Magnetic Resonance Imaging of the Human Prostate. Frontiers in Oncology. 7, 47 (2017).
