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Cancer Research

ऑर्गेनोइड संस्कृति का उपयोग करके माउस प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन करना

doi: 10.3791/60223 Published: November 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

माउस प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड विभेदन को विनियमित करने वाले तंत्रों का मूल्यांकन करने के लिए एक आशाजनक संदर्भ का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह पेपर प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण का वर्णन करता है, और (1) ऑर्गेनोइड से प्रोटीन लाइसेट एकत्र करने के तरीकों का परिचय देता है, और (2) पूरे माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए फिक्स और दाग ऑर्गेनॉइड।

Abstract

प्रोस्टेट एपिथेलियम मुख्य रूप से बेसल और ल्यूमिनल कोशिकाओं से शामिल है। विकास, ऊतक-उत्थान और परिवर्तन के दौरान माउस प्रोस्टेट बेसल और चमकदार कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता को परिभाषित करने के लिए वीवो वंश ट्रेसिंग का उपयोग किया गया है। हालांकि, एक वंश ट्रेसिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर प्रोस्टेट एपिथेलियल विभेदन क्षमता के सेल-आंतरिक और बाह्य नियामकों का मूल्यांकन अक्सर व्यापक प्रजनन की आवश्यकता होती है और लागत निषेधात्मक हो सकता है। प्रोस्टेट ऑर्गेनोइड परख में बेसल और ल्यूमिनल कोशिकाएं प्रोस्थेटिक एपिथेलियम एक्स वीवो उत्पन्न करती हैं। महत्वपूर्ण बात, प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाओं को किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि या चूहों के चूहों से अलग किया जा सकता है, जो तीन आयामी (3 डी) संस्कृति में चढ़ाना से पहले, या बाद में छोटे अणुओं की किसी भी संख्या के साथ इलाज किया जाता है। भेदभाव क्षमता के मूल्यांकन के लिए पर्याप्त सामग्री 7-10 दिनों के बाद उत्पन्न होती है। पश्चिमी दाग द्वारा (1) प्रोटीन विश्लेषण के लिए बेसल-व्युत्पन्न और चमकदार-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड का संग्रह और (2) पूरे माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा बरकरार ऑर्गनॉइड का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण शोधकर्ताओं को पूर्व वीवो भेदभाव का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं की क्षमता। संयोजन में उपयोग किए जाने पर, ये दोनों दृष्टिकोण आनुवंशिक या औषधीय हेरफेर के जवाब में प्रोस्टेट बेसल और चमकदार कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता के बारे में पूरक जानकारी प्रदान करते हैं।

Introduction

बेसल और चमकीले कोशिकाओं में प्रोस्टेट एपिथेलियम1का बहुमत शामिल है। वंश ट्रेसिंग अध्ययनों से पता चला है कि ये कोशिका प्रकार मुख्य रूप से वयस्क माउस2में अलग-अलग जनकों द्वारा आत्म-निरंतर होते हैं ; हालांकि, बेसल प्रोजेनिटर्स से चमकदार भेदभाव विकास3,4,ऊतक उत्थान5,सूजन6,7 औरप्रोस्टेट कैंसर दीक्षा2,8सहित कई संदर्भों में मनाया गया है . इसके अलावा, उभरते डेटा बहुशक्तिशाली चमकदार जनक ों के साथ-साथ चमकदार-प्रतिबद्ध जनक9के अस्तित्व का समर्थन करते हैं। मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर में, एआर-निर्भर चमकदार वंश से बेसल और न्यूरोएंडोक्राइन सुविधाओं के साथ एआर-उदासीन वंश में भेदभाव एंड्रोजन मार्गअवरोधक10,11,12के प्रतिरोध के तेजी से सराहना किए गए तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, के रूप में भेदभाव सामांय शरीर विज्ञान, कैंसर दीक्षा और चिकित्सा के प्रतिरोध में फंसाया है, प्रोस्टेट एपिथेलियल सेल भेदभाव के प्रमुख आणविक नियामकों स्पष्ट महत्वपूर्ण है ।

माउस प्रोस्टेट ऑर्गेनोइड मॉडल प्रोस्टेट एपिथेलियल सेल विभेदन9,13,14का अध्ययन करने के लिए एक सुरुचिपूर्ण पूर्व वीवो संदर्भ के रूप में उभरा है । इस परख में, व्यक्तिगत एपिथेलियल कोशिकाओं को 3 डी मैट्रिक्स में चढ़ाया जाता है जहां वे 1 सप्ताह के भीतर बेसल और ल्यूमिनल कोशिकाओं दोनों वाले ग्रंथि संरचनाएं उत्पन्न करते हैं। जबकि ऑर्गेनॉइड संस्कृति में कोशिकाओं को चढ़ाना के लिए मौजूदा दृष्टिकोणों का उपयोग ऑर्गेनॉइड को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, इन दृष्टिकोणों को और अधिक अनुकूलन14की आवश्यकता होती है। प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड को मजबूत करने से जुड़ी उल्लेखनीय चुनौतियों में (1) दो आयामी (2डी) उपनिवेशों को छोड़कर शामिल हैं जो विश्लेषण से मैट्रिक्स जेल के नीचे बनते हैं, (2) मीडिया परिवर्तनों के दौरान मैट्रिक्स जेल की अखंडता को बनाए रखते हैं, और (3) ऑर्गोनॉइड को सही ढंग से गिनते हैं। यह पेपर माउस प्रोस्टेट से अलग एपिथेलियल कोशिकाओं से ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण को रेखांकित करता है। वर्णित दृष्टिकोण में 2डी कॉलोनियों की घटना को रोकने के लिए पॉली (2-हाइड्रोक्सेथिल मेथेक्रिलेट) (पॉली-हेमा) के साथ कोटिंग प्लेटें शामिल हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल डिस्क के बजाय मैट्रिक्स जेल रिंग में चढ़ाया जाता है, जो मीडिया को बदलने और ऑर्गेनॉइड को कम चुनौतीपूर्ण बनाता है। ये तकनीकें शोधकर्ताओं को अधिक आसानी से जांच करने की अनुमति देती हैं कि आनुवंशिक परिवर्तन या छोटे अणुओं को पहले या उसके दौरान पेश किया जाता है, ऑर्गेनॉइड गठन भेदभाव जैसी प्रमुख प्रक्रियाओं को बदल देता है।

पूरे माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा वेस्टर्न ब्लॉट या इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड की कटाई13विभेदन में मूल्यवान मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, फिर भी ऐसी तकनीकों के लिए ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल की कमी है। यह पांडुलिपि प्रोटीन लाइसेट के (1) संग्रह, या (2) निर्धारण और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए धुंधला करने के लिए फसल ऑर्गेनॉइड के दृष्टिकोण का वर्णन करती है। महत्वपूर्ण बात, फिक्सिंग और धुंधला प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड के लिए वर्णित दृष्टिकोण मौजूदा तरीकों के संबंध में काफी सुधार हुआ है । हालांकि ये ऑर्गेनॉइड15को सेक्शन करने पर भरोसा करते हैं, इस पांडुलिपि में वर्णित विधि अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड का उपयोग करती है, जो नमूना तैयारकरने के दौरान ऑर्गेनोइड क्षति से बचाने में मदद करती है। जब संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो पश्चिमी दाग और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी भेदभाव के आणविक नियामकों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, इन दृष्टिकोणों का उपयोग विकास और परिवर्तन जैसी अन्य प्रक्रियाओं को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

नोट: पेपर में वर्णित दृष्टिकोणों को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध चित्रित चित्रित चित्र 1में प्रदान किया गया है ।

1. फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करके माउस बेसल और ल्यूमिनल प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करना - समय: 30 मिन

नोट: अंधेरे में कदम 1.3-1.5 प्रदर्शन करते हैं।

  1. लॉसन एट अल16में वर्णित कुल माउस प्रोस्टेट से कोशिकाओं को अलग करने के बाद, कोशिकाओं को एफएसीएस ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 100 माइक्रोन मीडिया(तालिका 1)में 0.1-5 x 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  2. सीडी45, सीडी31, टेर-119, ईपीसीएमएम और सीडी49एफ: निम्नलिखित सीधे-सीधे-कॉन्जुलेड प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित मात्रा जोड़ें।
  3. बर्फ पर इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित, 20 किमी के लिए।
    नोट: अनसित और एकल दाग नियंत्रण के लिए कुल विसोशिएट कोशिकाओं का 10% उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। छंटाई के लिए सही मुआवजा और वोल्टेज सेट करने के लिए ये नियंत्रण आवश्यक हैं।
  4. प्रत्येक नमूने में वियोजन मीडिया के 1 mL जोड़कर एंटीबॉडी कॉकटेल बुझाएं। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 न्यूनतम के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेटिंग करके हटा दें।
  5. 1 μg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) युक्त dissoation मीडिया के उचित मात्रा (२५० μL प्रति 1 x 106 कोशिकाओं) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें । FACS के लिए आगे बढ़ें। माउस बेसल और ल्यूमिनल प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव का प्रदर्शन करने वाले फ्लो साइटोमेट्री भूखंडोंको चित्र ा 2 में दर्शाया गया है।

2. प्राथमिक माउस ऑर्गेनॉइड संस्कृति में प्लेटिंग सॉर्ट प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाएं - समय: 2-3 एच (पॉली-हेमा-कोटेड प्लेट तैयारी को छोड़कर)

नोट: मैट्रिक्स जेल के नीचे कुएं की सतह पर 2डी कॉलोनी गठन को रोकने के लिए प्लेटों को पॉली-हेमा के साथ लेपित किया जाता है। माउस ऑर्गेनोइड संस्कृति में हल बेसल या ल्यूमिनल प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं को चढ़ाना से 1 दिन पहले पॉली-हेमा-कोटेड प्लेटें तैयार करें। कम विकास कारक मैट्रिक्स जेल के 1 mL aliquots, इसके बाद मैट्रिक्स जेल के रूप में संदर्भित, बर्फ पर 2 घंटे के कदम से पहले 2.1 । Y-27632 (रॉक अवरोधक) को चरण 2.1 से तुरंत पहले माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए। बर्फ पर 2.1-2.8 कदम प्रदर्शन करें।

  1. 5 मिलीग्राम गोल-नीचे ट्यूबों में कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा गोली मारें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
  2. माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया (टेबल 2)14के 500 माइक्रोन में सेल पैलेट को धो लें ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
  4. 1,000 कोशिकाओं/μL के सेल घनत्व पर माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया में फिर से निलंबित करें।
  5. मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए, मैट्रिक्स जेल के साथ माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया में निलंबित एपिथेलियल कोशिकाओं को मिलाएं जिसमें 25% कोशिकाएं/मीडिया और 75% मैट्रिक्स जेल शामिल हैं। बेसल कोशिकाओं को आम तौर पर 100-2,000 कोशिकाओं/80 μL की एकाग्रता पर चढ़ाया जाता है, जबकि चमकदार कोशिकाओं को आम तौर पर 2000-10,000 कोशिकाओं/80 μL की एकाग्रता पर चढ़ाया जाता है । चढ़ाया कोशिकाओं का घनत्व प्रत्याशित सामग्री संग्रह के दिन, और वांछित डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर भिन्न होता है।
    नोट: मास्टर मिक्स तैयारकरने से पहले अपेक्षित मास्टर मिक्स वॉल्यूम 5 मिन के लिए उचित आकार की ट्यूब (एस) ठंडा करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि मैट्रिक्स जेल हैंडलिंग करते समय कठोर नहीं होता है, इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले मैट्रिक्स जेल को 3-4 बार पाइप करके पिपेट टिप को ठंडा करना महत्वपूर्ण है।
  6. 24-अच्छी प्लेट के प्रति अच्छी तरह से मैट्रिक्स जेल/सेल मिश्रण के 80 μL जोड़ें। पॉली-हेमा कोटिंग के साथ सीधे संपर्क से बचते हुए, कुएं की दीवार के निचले आधे हिस्से पर एक बूंद को पाइप करने की सिफारिश की जाती है। मैट्रिक्स जेल जोड़ने के बाद, मैट्रिक्स जेल/सेल मिश्रण को कुएं के रिम के चारों ओर एक अंगूठी बनाने की अनुमति देने के लिए प्लेट को घुमाएं।
  7. मैट्रिक्स जेल को आंशिक रूप से कठोर होने की अनुमति देने के लिए 24-अच्छी तरह की प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ2 इनक्यूबेटर राइट साइड में रखें।
    नोट: इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह की प्लेट रखने के तुरंत बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया को गर्म करना शुरू करें।
  8. 10 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, 24-अच्छी तरह से प्लेट को उल्टा और अतिरिक्त 50 मिन के लिए इनक्यूबेट फ्लिप करें ताकि मैट्रिक्स जेल को पूरी तरह से कठोर होने की अनुमति दी जा सके।
  9. प्रत्येक कुएं के केंद्र में पूर्व-गर्म माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया ड्रॉपवाइज के 350 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: मैट्रिक्स जेल की अखंडता को बनाए रखने के लिए, मीडिया को जोड़ते समय मैट्रिक्स जेल रिंग से बचना महत्वपूर्ण है।
  10. मीडिया को जोड़ने के बाद 24 वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर लौटा दें।

3. माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया की भरपाई -समय: 10-15 मिन प्रति 24-अच्छी तरह से प्लेट

नोट: मौजूदा मीडिया को हर ४८ घंटे में ताजा मीडिया से बदला जाना चाहिए । प्रत्येक मीडिया परिवर्तन से पहले, पूर्व गर्म माउस ऑर्गेनोइड मीडिया। यह भरपाई के लिए इस्तेमाल मीडिया के लिए रॉक अवरोधक जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है ।

  1. 24-अच्छी तरह की प्लेट को 45 डिग्री कोण पर झुकाएं और मैट्रिक्स जेल रिंग से बचते हुए, एक p1000 पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से मौजूदा मीडिया को धीरे से हटा दें।
  2. चरण 2.9 में पूर्व-गर्म माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया के 350 माइक्रोन जोड़ें। प्रमुख पोषक तत्वों और विकास कारकों की तेजी से कमी को रोकने के लिए 5 दिनों से अधिक समय तक सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड में मीडिया (1 मिलीएल तक) की एक बड़ी मात्रा जोड़ने की सिफारिश की जाती है।

4. वेस्टर्न ब्लॉट एनालिसिस के लिए प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड से प्रोटीन लाइसेट निकालना - टाइमिंग: 2.5-4 एच

नोट: प्रोटीन लाइसेट निष्कर्षण के लिए ऑर्गेनॉइड इकट्ठा करने से पहले, तैयार करें और पूर्व-गर्म dispase युक्त मीडिया(तालिका 1)

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया से निकालें और चरण 3.1 में।
  2. ऑर्गेनॉइड इकट्ठा करने के लिए, मैट्रिक्स जेल को बार-बार मैट्रिक्स जेल की अंगूठी पर सीधे मैट्रिक्स जेल रिंग पर पाइपिंग करके विस्फोट करें, जब तक कि पूरी अंगूठी उखाड़ न जाए, और 1.5 मीटर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित न हो जाए।
    नोट: पॉली-हेमा-कोटेड कुओं के साथ सीधे संपर्क से बचना महत्वपूर्ण है। प्रत्यक्ष संपर्क पॉली-हेमा के साथ एकत्र सामग्री के संदूषण का कारण बन सकता है, जो कोशिका के अस्तित्व को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है।
  3. 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब (एस) को 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिन से 1 घंटे के लिए रखें ताकि डिस्पाज द्वारा मैट्रिक्स जेल के पूर्ण पाचन की अनुमति दी जा सके।
  4. आरटी में 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा पैलेट ऑर्गेनॉइड और माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके सुपरनेट को हटा दें।
  5. ऑर्गेनोइड पैलेट में फॉस्फेट-बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) जोड़ें और धीरे-धीरे फ्लिकिंग करके फिर से सस्पेंड करें।
    नोट: ऑर्गेनॉइड पेलेट को पर्याप्त रूप से फिर से निलंबित करने में विफलता के परिणामस्वरूप अवशिष्ट डिस्पास या मैट्रिक्स जेल के साथ ऑर्गनॉइड सामग्री का संदूषण हो सकता है।
  6. आरटी पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके सुपरनेट को हटा दें।
  7. प्रत्येक ट्यूब को सूखी बर्फ और मेथनॉल वाले समाधान में रखकर ऑर्गेनोइड छर्रों को तेजी से फ्रीज करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य का उपयोग होने तक ट्यूब (एस) स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, चरण 4.6 के तुरंत बाद प्रोटीन निकालें।
  8. पैक्ड सेल वॉल्यूम के प्रति 10 माइक्रोन प्रोटीन लाइसिस बफर(टेबल 1)में ऑर्गेनॉइड छर्रों को फिर से निलंबित करें। फिर से निलंबित करने के लिए झटका।
    नोट: यदि तेजी से ठंड के बाद फिर से शुरू हो रहा है, तो सुनिश्चित करें कि प्रोटीन लाइसिस बफर -80 डिग्री सेल्सियस से नमूनों को हटाने से पहले गल जाए, क्योंकि फॉस्फेटेज और प्रोटीज गतिविधि को रोकने के लिए तुरंत नमूनों में लाइसिस बफर जोड़ा जाना चाहिए।
  9. कम से कम 45 नगदी के लिए बर्फ पर प्रोटीन लाइसिस बफर में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: परमाणु प्रोटीन वसूली की दक्षता बढ़ाने के लिए बर्फ पर ऊष्मायन से पहले सोनीकेट करने की सिफारिश की जाती है; हालांकि, सोनिकेशन की आवश्यकता नहीं है। यदि ध्वनिकरण नहीं किया जाता है, तो 4.10 कदम आगे बढ़ें।
    1. सोनीकेट करने के लिए, गीली बर्फ में ट्यूब ों को जलमग्न करें और धीरे-धीरे माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के बाहर ध्वनि डिमेम्ब्रेटर की नोक को लागू करें। 20 kHz पर 40 s के लिए सोनीकेट।
  10. स्थापित प्रोटोकॉल के बाद पश्चिमी दाग के लिए आगे बढ़ें।

5. संपूर्ण-माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए फिक्सिंग और धुंधला प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड

  1. 24-अच्छी प्लेटों से प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड इकट्ठा करना- समय: 45-60 किमी
    नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रक्रिया करने के लिए प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड इकट्ठा करते समय, उनकी संरचना को बनाए रखने के लिए उन्हें देखभाल के साथ संभालना महत्वपूर्ण है। नीचे संग्रह प्रोटोकॉल अलगाव के दौरान ऑर्गेनॉइड संरचना के व्यवधान को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया से निकालें और चरण 3.1 में।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिन के लिए 30 मिन के लिए डाइपयुक्त मीडिया(टेबल 1)के 500 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेटिंग करके मैट्रिक्स जेल को पचाएं।
    3. माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में डाइजेस्ट ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन एकत्र करें और आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को पैलेट करें। सुपरनेटेंट को हटा दें।
  2. प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला-समय: 3-4 दिन (1-5 h/day)
    1. पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 माइक्रोन जोड़ें और कोमल झटकों के साथ आरटी में 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा ऑर्गेनॉइड को गोली मारें, सुपरनेटेंट को हटा दें, और कोमल झटकों के साथ 15 सीन के लिए पीबीएस के 1 मिलील के साथ गोली धोएं।
    3. अतिरिक्त दो बार के लिए चरण 5.2.2 के रूप में गोली धोएं।
    4. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और सुपरनेटेंट को हटा दें। ब्लॉकिंग सॉल्यूशन(टेबल 1)में 1 μg/mL DAPI जोड़ें । आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट या वैकल्पिक रूप से रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए।
    5. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और सुपरनेटेंट को हटा दें। समाधान को अवरुद्ध करने और कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट में प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश एंटी-पी63, माउस एंटी-साइटोकेराटिन 8) जोड़ें।
    6. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और सुपरनेटेंट को हटा दें। कोमल झटकों के साथ 15 मिन के लिए पीबीएस के 1 mL के साथ गोली धोलें।
    7. अतिरिक्त दो बार के लिए चरण 5.2.6 के रूप में गोली धोएं।
    8. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और सुपरनेटेंट को हटा दें। माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (बकरी विरोधी खरगोश IgG-Alexa Fluor 594, बकरी विरोधी माउस IgG-Alexa Fluor 488) समाधान अवरुद्ध करने में और कोमल मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    9. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा ऑर्गेनॉइड को गोली मारें, सुपरनेटेंट को हटा दें, और कोमल झटकों के साथ 15 सीन के लिए पीबीएस के 1 मिलील के साथ गोली धोएं।
    10. अतिरिक्त दो बार के लिए चरण 5.2.9 के रूप में गोली धोएं।

6. ऊतक समाशोधन और पूरे माउंट Conफोकल माइक्रोस्कोपी के लिए दाग प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड के बढ़ते-समय: 7 एच

  1. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  2. 1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस में 30% सुक्रोज का 1 एल जोड़ें और कोमल मिलाते हुए आरटी में 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  4. 1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस में 45% सुक्रोज के 1 mL जोड़ें और कोमल मिलाते हुए के साथ आरटी में 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  6. 1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस में 60% सुक्रोज के 1 mL जोड़ें और कोमल मिलाते हुए के साथ आरटी में 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. आरटी पर 3 मिन के लिए 800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा ऑर्गनॉइड को गोली मारें और 95% सुपरनेटेंट को हटा दें।
    नोट: गोली लूजर हो जाती है क्योंकि सुक्रोज की एकाग्रता अधिक हो जाती है। यूवी लाइट के नीचे DAPI-दाग ऑर्गेनॉइड को देखना इस बात की पुष्टि करने के लिए कि वे सुपरनेटेंट को हटाने के दौरान खो नहीं गए थे, इसकी सिफारिश की जाती है।
  8. शेष निलंबन की 10-20 माइक्रोन ड्रॉपलेट को कक्षित कवरस्लिप में स्थानांतरित करें और माइक्रोस्कोपी को कॉन्फोकल करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: कवरस्लिप टुकड़ों को स्पेसर्स(चित्र4C)के रूप में उपयोग किए जाने वाले बूंद के दोनों ओर रखा जा सकता है। ये ऑर्गेनॉइड को बूंद के ऊपर कवरस्लिप रखे जाने पर गिरने से रोकते हैं।

Representative Results

प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं को माउस ऑर्गेनॉइड संस्कृति में चढ़ाया जाता है जहां वे ऑर्गनॉइड बनाते हैं, जिन्हें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण(चित्रा 1)की तैयारी से पहले काटा जाता है।

बेसल और ल्यूमिनल एपिथेलियल कोशिकाएं FACS का उपयोग करके अलग-थलग हैं। DAPI+ कोशिकाओं और घटते लिन+ कोशिकाओं (सीडी45, सीडी31, Ter119) को छोड़कर, बेसल और चमकदार कोशिकाओं EpCAM और CD49f(चित्रा 2)की अंतर अभिव्यक्ति के आधार पर प्रतिष्ठित हैं । ऑर्गेनोइड संस्कृति में प्लेट प्रोस्टेट बेसल और चमकदार कोशिकाओं के लिए वर्णित दृष्टिकोण पर जोर देता है: (1) मैट्रिक्स जेल के छल्ले में कोशिकाओं को चढ़ाना, और (2) पॉली-हेमा के साथ कोटिंग कुओं। अंगूठियों में चढ़ाना पहले अग्रवाल एट अल9में वर्णित किया गया है । इस दृष्टिकोण का उपयोग(चित्रा 3ए)शोधकर्ताओं को मीडिया (चरण 3) की भरपाई करते समय मैट्रिक्स जेल से अधिक आसानी से बचने की अनुमति देता है, और कुएं की परिधि का पालन करके अधिक आसानी से ऑर्गेनॉइड की गणना करता है। पॉली-हेमा के साथ कोटिंग कुओं को रेटिना ऑर्गेनॉइड17में 2डी कॉलोनी गठन को रोकने के लिए दिखाया गया है; हालांकि, प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड मॉडल में इस दृष्टिकोण का उपयोग नहीं किया गया है। महत्वपूर्ण बात यह है कि पॉली-हेमा(टेबल 3)के साथ कोटिंग कुओं ने ऑर्गेनोइड गठन(चित्रा 3बी)में हस्तक्षेप किए बिना 2डी उपनिवेशों की घटना को समाप्त कर दिया। ये संशोधन प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड परख की क्षमताओं का विस्तार करते हैं।

बेसल और ल्यूमिनल कोशिकाएं अलग-अलग मॉर्फोलोजी(चित्र 4ए)के साथ ऑर्गनॉइड बनाती हैं। जबकि अधिकांश बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड संस्कृति में 7 दिनों के बाद आकार (100-300 माइक्रोन व्यास) में समान होते हैं, ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड महत्वपूर्ण विषमता (30-450 माइक्रोन व्यास) प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, अधिकांश बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में बहुस्तरीय एपिथेलियम(चित्रा 4ए, शीर्ष)से घिरे ल्यूमेंस होते हैं, जबकि चमकदार-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड खोखले से आकृति विज्ञान में होते हैं, एकल स्तरित एपिथेलियम के साथ ठोस तक, कोशिकाओं के बहु-स्तरित कॉर्ड के साथ जो कैनाडिज़ नहीं करते हैं(चित्रा 4ए, नीचे)। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (चरण 4, 5) के लिए ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए ऊपर वर्णित दृष्टिकोणों का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या ये फेनोटाइपिक अंतर वंश मार्कर अभिव्यक्ति में मतभेदों को प्रतिबिंबित करते हैं। पश्चिमी दाग विश्लेषण से पता चला है कि बेसल और ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड बेसल और ल्यूमिनल प्राइमरी कोशिकाओं से जुड़ी विशेषताओं को बनाए रखते हैं । बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड बेसल मार्कर साइटोकेराटिन 5 (के5) के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, जबकि ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड ल्यूमिनल मार्कर साइटोकेराटिन 8 (के8)(चित्रा 4बी)के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। थोक आबादी में बेसल और ल्यूमिनल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में बेसल और ल्यूमिनल मार्कर दोनों का पता चला, शायद भेदभाव का विचारोत्तेजक(चित्र4बी)।

हमने बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में वंश मार्कर अभिव्यक्ति की विशेषता बताने की मांग की और यह निर्धारित करने की कोशिश की कि क्या रूपात्मक रूप से अलग चमक-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड अक्षुण्ण ऑर्गेनॉइड को धुंधला करके और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 4डी)प्रदर्शन करके मार्कर अभिव्यक्ति में अंतर प्रदर्शित करते हैं। बेसल-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में बाहरी परतों के साथ बहुस्तरीय एपिथेलियम होता था, जो बसाल मार्कर पी63 के उच्च स्तर और चमकदार मार्कर के मध्यम स्तर को व्यक्त करता है (p63हाय,K8मध्य),और आंतरिक परतों के बिना p63 के पता लगाने योग्य स्तर और K8 (p63lo,K8हाय)(चित्र4डी, शीर्ष)। जबकि एकल स्तरित चमक-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड में सभी कोशिकाओं K8 के लिए सकारात्मक दाग, केवल कोशिकाओं का चयन परमाणु p63 निहित(चित्रा 4डी, नीचे)। ये डेटा फसल के दृष्टिकोण को मान्य करते हैं और पश्चिमी दाग या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए ऑर्गनॉइड तैयार करते हैं और इस तरह विभेदन सहित प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनोइड परख की क्षमता का विस्तार करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: संग्रह और विश्लेषण के लिए प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए योजनाबद्ध चित्रण कार्यप्रवाह। कुल माउस प्रोस्टेट को अलग किया जाता है और बेसल और ल्यूमिनल प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाएं स्थापित प्रोटोकॉल18,19के माध्यम से फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई से अलग होती हैं। माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया और मैट्रिक्स जेल के मिश्रण में निलंबित बेसल या चमकदार कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल के छल्ले में चढ़ाया जाता है। संस्कृति के 5 से 7 दिनों के बाद, ऑर्गेनॉइड को वेस्टर्न ब्लॉट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए काटा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) का उपयोग करके माउस बेसल और ल्यूमिनल प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव। माउस प्रोस्टेट से अलग कोशिकाओं DAPI के साथ दाग रहे हैं, मृत कोशिकाओं से रहते हैं, और सतह एंटीबॉडी भेद करने के लिए, चमकदार कोशिकाओं से बेसल भेद करने के लिए, FACS से पहले । डीएपीआई- कोशिकाओं पर बाएं = गेटेड। एफएससी-ए = फॉरवर्ड-स्कैटर। केंद्र = लिनकोशिकाओं पर Gated (CD45लो,CD31लो,Ter119लो)। एसएससी-ए = साइड-स्कैटर। दाएं = बेसल कोशिकाएं (बास) (EpCAMहाय,CD49fहाय),ल्यूमिनल कोशिकाएं (लूम) (EpCAMहाय,CD49fमध्य)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: माउस प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड की स्थापना। (A)24-अच्छी प्लेट के कुएं में मैट्रिक्स जेल की अंगूठी उत्पन्न करने के लिए योजनाबद्ध चित्रण दृष्टिकोण। (ख)ऑर्गेनॉइड (3डी ग्रोथ प्लेन) और दो आयामी कॉलोनियों (2डी ग्रोथ प्लेन) की प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां 7 दिन बाद गैर-लेपित (पॉली-हेमा (-)), या लेपित (पाली-हेमा (()) 24-अच्छी प्लेटों में प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं को चढ़ाना के 7 दिन बाद बनी । 2डी विकास विमान के भीतर बॉक्स्ड क्षेत्रों को दाईं ओर बढ़ाया जाता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: वेस्टर्न ब्लॉट और पूरे माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड में वंश मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण। (क)संस्कृति के 7 दिनों के बाद बेसल-व्युत्पन्न (ऊपर) और चमकदार-व्युत्पन्न (नीचे) ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां । स्केल बार = 100 माइक्रोन।(बी)बेसल-व्युत्पन्न (बास) और ल्यूमिनल-व्युत्पन्न (लूम) ऑर्गेनॉइड का वेस्टर्न ब्लॉट एनालिसिस 5 दिनों की संस्कृति के बाद। बेसल मार्कर, साइटोकेराटिन 5 (K5) और ल्यूमिनल मार्कर, साइटोकेराटिन 8 (K8) और एक लोडिंग कंट्रोल, हिस्टोन एच 3 (HH3) के लिए धुंधला। (ग)अंतरिक्ष के साथ चैम्बर कवरस्लिप को चित्रित करने वाली योजनाबद्ध ढंग से। (D)संस्कृति के 7 दिनों के बाद बसाल-व्युत्पन्न (शीर्ष) और चमकदार-व्युत्पन्न (नीचे) ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) और इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां । p63 (लाल), K8 (हरे) और DAPI (नीला) व्यक्तिगत रूप से और विलय के लिए धुंधला । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

व्यंजनों
डिसपे युक्त मीडिया 1 मिलीग्राम/mL dispase + 10 μM रॉक अवरोधक उन्नत DMEM F12 में । 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर स्टरलाइज करें।
विसोजन मीडिया आरपीएमआई 1640 में 10% एफबीएस + 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर स्टरलाइज करें।
प्रोटीन लाइसिस बफर रिपा बफर + फॉस्फेटेज़ अवरोधक + प्रोटीज़ अवरोधक
समाधान अवरुद्ध करना 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस में 10% एफबीएस

तालिका 1: प्रमुख समाधान तैयार करने के निर्देश।

घटक एकाग्रता
बी-27 1x (50x ध्यान से पतला)
ग्लूटामैक्स 1x (100x ध्यान से पतला)
एन-एसीटाइल-एल-साइस्टीन 1.25 एमएम
नॉर्मोसिन 50 μg/mL
पुनः संयोजन मानव EGF, पशु मुक्त 50 एनजी/एमएल
रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन नोगिन 100 एनजी/एमएल
आर-स्पॉन्डिन 1-वातानुकूलित मीडिया 10% वातानुकूलित मीडिया
A83-01 200 एनएम
Dht 1 एनएम
वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड (रॉक अवरोधक) 10 माइक्रोन
उन्नत डीएमईएम/एफ-12 बेस मीडिया
आर-स्पॉन्डिन 1-वातानुकूलित मीडिया ड्रोस्ट, एट अल13में वर्णित के रूप में उत्पन्न होता है। सभी घटकों के अलावा, फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया को स्टरलाइज करें। रॉक अवरोधक केवल संस्कृति की स्थापना और ऑर्गनॉइड की निष्क्रियता के दौरान जोड़ा जाता है।

तालिका 2: माउस ऑर्गेनॉइड मीडिया की तैयारी के निर्देश।

पॉली-हेमा-कोटेड प्लेटें तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल
1 50 मीटर 98% ईटोएच में 0.25 ग्राम पॉली-हेमा जोड़ें। एक शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर पॉली-हेमा को भंग कर दें। इस प्रक्रिया में कम से कम 4 घंटे लगते हैं।
2 फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर पॉली-हेमा नसबंदी।
3 24-वेल प्लेट (एस) के प्रति अच्छी तरह से पॉली-हेमा समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें।
4 पॉली-हेमा जोड़ने के बाद 24-अच्छी प्लेट (एस) से ढक्कन (एस) निकालें और समाधान को रात भर वाष्पित होने दें।
5 प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार PBS के साथ धोने और सुनिश्चित करें कि कुओं को पूरी तरह से अंतिम धोने के बाद भंडारण से पहले सूखी हैं । नोट: धोने के दौरान पॉली-हेमा कोटिंग को बाधित करने से ऑर्गेनोइड संस्कृति में एपिथेलियल कोशिकाओं को चढ़ाना पर 2-आयामी विकास में योगदान हो सकता है। पॉली-हेमा-कोटेड कुओं को नुकसान से रोकने के लिए, धोने के दौरान पिपेट टिप के साथ सीधे संपर्क से बचें। पॉली-हेमा-कोटेड कुओं की अखंडता तब तक बरकरार रहेगी जब तक कि पॉली-हेमा को पिपेट टिप से स्क्रैप नहीं किया जाता ।
6 पॉली-हेमा-कोटेड प्लेट्स को दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है। नोट: भंडारण से पहले पैराफिल्म में प्लेटों को लपेटने से संदूषण का खतरा कम हो जाएगा।

तालिका 3: पॉली-हेमा-कोटेड प्लेटों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल।

Discussion

प्रोस्टेट एपिथेलियल सेल विभेदन को सामान्य प्रोस्टेट जीव विज्ञान2,3,4,5,6,7 और रोग जीव विज्ञान8,10,11,12दोनों में फंसाया गया है । हालांकि, इस प्रक्रिया के मास्टर नियामक अपरिभाषित रहते हैं। प्रोस्टेट एपिथेलियल सेल भेदभाव के प्रमुख नियामकों की पहचान अच्छी तरह से स्थापित संदर्भों की अनुपस्थिति के कारण भाग में मुश्किल हो गया है यह मॉडल । जबकि 2डी मोनोलेयर संस्कृति का उपयोग भेदभाव11,12मॉडल के लिए किया जा सकता है, यह संदर्भ जटिल प्रोस्टेट माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से तैयार करने में विफल रहता है। इसके अलावा, मॉडल भेदभाव के लिए वीवो संदर्भों में खुद को मशीनी अध्ययन के लिए उधार नहीं देते हैं, क्योंकि वे हेरफेर करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। इसलिए, भेदभाव का अध्ययन करने के लिए, अभी तक शारीरिक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में हेरफेर करने के लिए एक आसान की पहचान महत्वपूर्ण है ।

प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड मॉडल एक सुरुचिपूर्ण पूर्व वीवो संदर्भ का प्रतिनिधित्व करता है जहां चमकदार भेदभाव के लिए बेसल होने की सूचना दी जाती है। प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के तरीके अच्छी तरह से स्थापित हैं14; हालांकि, इन तरीकों का आगे अनुकूलन आवश्यक है। इसके अलावा, फसल के दृष्टिकोण और विश्लेषण के लिए प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड तैयार स्पष्ट रूप से वर्णित नहीं हैं। यह पेपर माउस प्रोस्टेट से ऑर्गेनोइड संस्कृति में अलग प्लेट प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को ऑर्गेनोइड गठन के दौरान 2डी उपनिवेशों की घटना को रोकने की अनुमति देता है, (2) मीडिया की भरपाई के दौरान मैट्रिक्स जेल में व्यवधान के जोखिम को कम करता है, और (3) अधिक प्रभावी ढंग से ऑर्गोनॉइड की गणना करता है। इसके अलावा, यह पांडुलिपि पश्चिमी दाग विश्लेषण, या पूरे माउंट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तैयारी के लिए फसल ऑर्गेनॉइड के दृष्टिकोण को रेखांकित करती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण इसकी अवधि के माध्यम से ऑर्गनॉइड की अक्षुण्ण संरचना को बनाए रखता है, जो छवि अधिग्रहण से पहले ऑर्गनॉइड क्षति को कम करता है। कुल मिलाकर, वर्णित दृष्टिकोण प्रोस्टेट ऑर्गेनोइड परख की क्षमताओं का विस्तार करते हैं।

विशेष रूप से, बेसल और चमकदार कोशिकाओं की ऑर्गेनोइड-फॉर्मिंग क्षमता को संबंधित आबादी को अलग-थलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों और संस्कृति की स्थिति से दोनों को बदला जा सकता है। इस परख में इस्तेमाल की जाने वाली ऑर्गेनोइड कल्चर की स्थितियां सबसे पहले कार्थस एट अल13ने बताई थीं । जबकि कार्थस एट अल ने बताया है कि बेसल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता अधिक होती है (15%) चमकदार कोशिकाओं की तुलना में (1%)13,चुआ एट अल, अलग अलगाव विधियों और संस्कृति की स्थिति का उपयोग करके, ने बताया है कि चमकदार कोशिकाएं (0.2-0.3%) बेसल सेल्स (0.03%)20की तुलना में एक उच्च ऑर्गनॉइड बनाने की क्षमता है . कुल मिलाकर, कार्थस एट अल द्वारा वर्णित विधियां बेसल और चमकदार कोशिकाओं दोनों के लिए उच्च ऑर्गेनोइड-फॉर्मिंग दरों का नेतृत्व करती हैं, संभावित रूप से बेसल और चमकदार कोशिकाओं13को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण में अंतर को दर्शाती हैं, जैसा कि संस्कृति की स्थिति के विपरीत है जो चमकदार कोशिकाओं से ऑर्गनॉइड गठन के खिलाफ पूर्वाग्रह है। यह स्पष्ट नहीं है कि इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल बहुशक्तिशाली चमकदार जनक, या प्रतिबद्ध-चमकदार जनक9से चमकदार ऑर्गेनोइड गठन का पक्षले है या नहीं । हालांकि समय पर और लागत निषेधात्मक, वीवो वंश ट्रेसिंग अध्ययनों में अंगोइड परख में स्पष्ट विशिष्ट प्रोस्टेट एपिथेलियाल वंश से जुड़े जनक सुविधाओं को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

विकास, भेदभाव और परिवर्तन जैसी प्रक्रियाएं न केवल प्रोस्टेट जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक हैं, बल्कि मस्तिष्क, फेफड़े, आंत, अग्न्याशय और यकृत सहित अन्य ऊतकों के जीव विज्ञान के लिए भी प्रासंगिक हैं। वर्णित तरीकों से न केवल प्रोस्टेट, बल्कि ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनोइड मॉडल के उपयोग की सुविधा होती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

पीडीसी और जेएमजी रूथ एल किर्शस्टीन राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार GM007185 द्वारा समर्थित हैं। JAD टी हैसन और शाऊल मार्टिनेज छात्रवृत्ति को सम्मानित राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R25GM055052) के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित है। एएसजी को स्पिट्जर फैमिली फाउंडेशन फंड और गिल एंडोमेंट का समर्थन है । इस काम को अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-17-068-01-TBG), रक्षा विभाग (W81XWH-13-1-0470), मार्गरेट ई द्वारा समर्थित किया गया था । अर्ली मेडिकल रिसर्च ट्रस्ट, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE प्रोस्टेट कैंसर में), रोज हिल्स फाउंडेशन, और UCLA के Jonsson व्यापक कैंसर केंद्र, ब्रॉड स्टेम सेल अनुसंधान केंद्र, नैदानिक और ट्रांसलेशनल विज्ञान संस्थान, और यूरोलॉजिक ऑन्कोलॉजी संस्थान से समर्थन करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Dish 35 mm, high ibidi 81156
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 50-980-487
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
A83-01 Tocris 2939
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 μg BioLegend 118218
B-27 Supplement (50x), Serum Free Thermo Fisher Scientific 17504044
Complete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11836145001
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) Sigma A-8380
Dispase II, Powder Thermo Fisher Scientific 17-105-041
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F8667
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) BioLegend 102405
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) BioLegend 103107
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/mL, 50 μg) BioLegend 116205
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Halt Phosphatase Inhibitor Thermo Fisher Scientific 78428
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning CB-40230C
Mouse anti-cytokeratin 8 BioLegend 904804
N-acetyl-L-cysteine Sigma A9165
Normocin Thermo Fisher Scientific ant-nr-1
PE anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313612
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15-140-122
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) Sigma P3932-25G
Rabbit anti-p63 BioLegend 619002
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) Thermo Fisher Scientific PI89901
Recombinant Human EGF, Animal-Free PeproTech AF-100-15
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) Thermo Fisher Scientific 22400105
Sonic Dismembrator Thermo Fisher Scientific FB120
Sucrose Sigma S0389-500G
Triton X-100 Sigma X100-5ML
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Selleck Chemical S1049-50MG

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References

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ऑर्गेनोइड संस्कृति का उपयोग करके माउस प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन करना
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Crowell, P. D., Giafaglione, J. M., Hashimoto, T., Diaz, J. A., Goldstein, A. S. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. Exp. (153), e60223, doi:10.3791/60223 (2019).More

Crowell, P. D., Giafaglione, J. M., Hashimoto, T., Diaz, J. A., Goldstein, A. S. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. Exp. (153), e60223, doi:10.3791/60223 (2019).

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