Summary
As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.
Abstract
As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) têm plasticidade metabólica distinta, o que lhes permite fazer a transição de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar as demandas da formação sanguínea. No entanto, tem sido difícil analisar o estado metabólico (respiração mitocondrial e glicolíse) dos HSPCs devido aos seus números limitados e à falta de protocolos otimizados para HSPCs frágeis não aderentes. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para medir a respiração metabólica (taxa de consumo de oxigênio; OCR) e glicolyse (taxa de acidificação extracelular; ECAR) de murine osso medula-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo fornece uma maior quantidade de HSPCs LSK da medula óssea da urina, melhora a viabilidade dos HSPCs durante a incubação, facilita análises de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece protocolos de injeção otimizados (concentração e tempo) para medicamentos que visam a fosforilação oxidativa e vias glicolíticas. Este método permite a previsão do estado metabólico e da saúde dos HSPCs durante o desenvolvimento do sangue e doenças.
Introduction
Uma vez que a vida útil da maioria dos glóbulos maduros é curta, a homeostase do sangue depende da auto-renovação e diferenciação de uma população de longa duração, mas rara de células-tronco hematopoiéticas (HSPCs)1. HSPCs são quiescentes, mas eles são rápidos a proliferar e sofrer diferenciação após a estimulação para sustentar as demandas do sistema sanguíneo. Como cada estado celular HSPC requer uma demanda bioenergética única, as mudanças metabólicas são os principais impulsionadores das decisões de destino HSPC. Portanto, a perda da plasticidade metabólica, alterando o equilíbrio entre quiescência, autorenovação e diferenciação de HSPCs, muitas vezes leva a distúrbios mielo ou linfoproliferativos. Juntos, a compreensão da regulação metabólica do desenvolvimento do HSPC é fundamental para descobrir mecanismos subjacentes malignidades hematológicas2,3,4,5.
A respiração mitocondrial e a glicolíse geram ATP para conduzir reações intracelulares e produzir os blocos de construção necessários para a síntese de macromoléculas. Como os HSPCs têm baixa massa mitocondrial em comparação com células diferenciadas6 e sustentam quiescência em nichos de medula óssea hipóxico, os HSPCs dependem principalmente de glicolíse. A ativação de HSPCs aumenta seu metabolismo mitocondrial que leva à perda de quiescência e sua subsequente entrada no ciclo celular. Tal plasticidade metabólica dos HSPCs permite a manutenção dapiscina HSPC ao longo da vida adulta6,7,8,9,10,11,12. Portanto, é fundamental investigar suas atividades metabólicas, como a taxa de consumo de oxigênio (OCR; índice de fosforilação oxidativa) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR; índice de glicolyse) para analisar a ativação do HSPC e o estado de saúde. Tanto o OCR quanto o ECAR podem ser medidos simultaneamente, em tempo real, usando um analisador de fluxo extracelular. No entanto, o método atual requer um grande número de células e é otimizado para células aderentes13. Uma vez que os HSPCs não podem ser isolados em grandes quantidades de camundongos14,exigem a classificação para obter uma população pura, são células não aderentes15,e não podem ser cultivadas durante a noite sem evitar a diferenciação16, tem sido difícil medir o OCR e o ECAR de HSPCs. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para acompanhar tutoriais baseados em vídeo sobre como medir a respiração metabólica e a glicolíse de poucos milhares de HSPCs de medula óssea de urinasca1+c-Kit+ (LSK).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Nationwide Children's Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC).
Nota: O protocolo é descrito em ordem cronológica que se estende ao longo do período de dois dias. Use novos reagentes, conforme descrito no protocolo abaixo.
1. Preparação de reagentes no dia anterior ao ensaio
-
Hidrate o cartucho do sensor.
- Incubar 5 mL do calibrante(Tabela de Materiais)em uma incubadora não CO2 37 °C durante a noite.
- Abra o kit de ensaio de fluxo(Mesa de Materiais)e separe o cartucho de sensor (verde; superior) da placa de serviço público (transparente; inferior). Em seguida, coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo e adjacente à placa de serviço público.
- Usando água estéril, preencha os poços da placa de serviço público (200 μL) e as câmaras ao redor dos poços (400 μL).
- Submergir o cartucho do sensor na placa de serviço público certificando-se de que os sensores estão cobertos completamente pela água. Toque 3x para evitar a formação de bolhas.
- Coloque o cartucho submerso na placa de serviço público em uma incubadora não CO2 37 °C durante a noite. Para evitar a evaporação da água, certifique-se de que a incubadora é devidamente umidificada. Coloque um copo aberto contendo H2O como uma precaução extra ao lado da placa de cartucho-utilitário, especialmente se estiver usando um forno regular.
-
Prepare a placa de ensaio.
- Esterilizar a superfície do armário de biossegurança classe 2 usando 70% de etanol. Abra a placa de ensaio o capô.
- Adicione 40 μL de 0,01% (w/v) poli-L-lisina (PLL) solução para cada poço da placa de ensaio o capô.
- Cubra a placa de ensaio com a tampa fornecida no kit. Incubar a placa de ensaio fechado à temperatura ambiente (RT) o capô por 1 h.
Nota: O objetivo da incubação é deixar pll revestimento da superfície da placa de ensaio para facilitar a adesão de células de suspensão para a superfície da placa de ensaio. - Após 1 h de incubação da placa de ensaio, retire o excesso de solução com um aspirador estéril à base de vácuo e ar seque o poço o capô.
Nota: Leva ~ 30-60 min para secar o ar os poços da placa de ensaio após a remoção pll excessiva usando o aspirador.
2. Dia do Ensaio
- Prepare o cartucho.
- Levante o cartucho do sensor. Coloque-o de cabeça para baixo na capa da cultura do tecido e descarte a água da placa de serviço público.
- Encha os poços de placas de serviço público com 200 μL do calibrante pré-aquecido.
- Encha as câmaras ao redor dos poços com 400 μL do calibrante.
- Submergir o cartucho do sensor na placa de serviço público, certificando-se de que os sensores estão cobertos completamente pelo calibrante. Toque 3x para evitar a formação de bolhas.
- Equilibre o cartucho de sensor submerso na placa de serviço público em uma incubadora não CO2 37 °C por 45 a 60 min.
- Cspcs derivados da medula da urina.
- Para acomodar réplicas biológicas suficientes, planeje usar HSPCs derivados de um mouse por poço da placa de ensaio.
Nota: Este método de colheita de medula óssea fornece ~ 50.000 a 80.000 LSK HSPCs de cada mouse. Este protocolo para medir o fluxo extracelular é otimizado para ~ 70.000 HSPCs LSK por poço de 96 bem-placa. - Eutanásia ratos usando overdose de CO2 e luxação cervical, seguindo métodos aprovados pelo IACUC local.
- Esterilizar a superfície das ferramentas de dissecação e do banco usando 70% de etanol.
- Para cada rato, pré-preencher uma placa de Petri com soro fisiológico 1x fosfato-buffered (PBS) contendo 2% de calor inativado soro bovino fetal (FBS) na RT.
Nota: Não use PBS pré-refrigerados, pois ele irá criar grupos nas seguintes etapas. - Spray 70% etanol (v/v) em todo o rato eutanasiado. Isolar todos os ossos, incluindo membros superiores e inferiores, ossos do quadril, esterno, caixa torácica e coluna vertebral, do rato17,18. Retire a matéria branca da medula espinhal do rato, pois pode contaminar as células LSK. Coloque todos os ossos em 1x PBS (+ 2% FBS), como eles estão sendo coletados, em uma placa de Petri até novo uso.
- Inverter um tubo cônico de 50 mL (novo a cada vez) e usá-lo para triturar ossos submersos em 1x PBS (+ 2% FBS) na placa de Petri.
- Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, pipeta para cima e para baixo (~10x) para expulsar uniformemente as células dos ossos, depois de esmagar ossos.
- Coloque um filtro de célula de 40 μm em um tubo cônico de 50 mL. Pré-molhe a superfície do filtro, passando 1 mL de 1x PBS (+ 2% FBS).
- Harvest suspensão celular derivada da medula óssea do passo 2.2.7 e passá-la através da superfície pré-molhada do filtro celular para remover detritos ósseos.
- Repita os passos 2.2.6 a 2.2.9 até que todos os materiais ósseos ficam brancos como um marcador que a maioria das células da medula óssea são coletadas no tubo cônico de 50 mL.
Nota: Muitas vezes leva dois tubos cônicos de 50 mL por mouse para coletar todas as células derivadas da medula óssea. - Tubos cônicos centrífugas 50 mL contendo células derivadas de medula óssea por 5 min a 500 x g e RT.
- Retire o supernatant. Resuspender as células derivadas da medula óssea (combinar conteúdo de ambos os tubos de 50 mL) em 5 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) como um volume final e manter as células em RT.
- Para acomodar réplicas biológicas suficientes, planeje usar HSPCs derivados de um mouse por poço da placa de ensaio.
- Colher células mononucleadas de medula óssea murina.
- Adicione 5 mL de gradiente médio de densidade (ou seja, Ficoll) a um tubo cônico de 15 mL. Em seguida, adicione lentamente 5 mL da suspensão da célula da medula óssea. Certifique-se de que as células permanecem como uma camada acima do meio gradiente de densidade.
- Centrífuga por 30 min a 500 x g e RT. Não use um freio na centrífuga. Certifique-se de que a centrífuga esteja na menor aceleração possível (por exemplo, 1 aceleração e 0 desaceleração).
- Colha a interface média das células mononucleadas (cor branca) após a centrífuga em um tubo cônico fresco de 15 mL.
- Células lavadas, colhidas a partir de meio gradiente de densidade, com 5 mL de 1x PBS (+ 2% FBS). Centrífuga por 5 min a 500 x g e 4 °C. Retire o supernatant.
- Repita o passo 2.3.4.
- Resuspender o conteúdo celular do tubo em 300 μL de 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL de suspensão celular por controle não manchado ou de cor única em um tubo FACS.
- Colheita HSPCs LSK de células mononucleated murine medula óssea.
- Faça um coquetel de anticorpos biotina misturando 3 μL por amostra dos seguintes anticorpos: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Adicione 15 μL do coquetel de biotina-anticorpo a 300 μL de células mononucleadas de medula óssea.
Nota: Cada anticorpo é usado em 1:100 diluição. - Incubar células com o coquetel de biotina-anticorpo por 30 min a 4 °C com agitação para evitar que as células se aglutinem no fundo do tubo.
- Adicione 10 mL de 1x PBS pré-refrigerados (+ 2% FBS) a células misturadas com o coquetel de biotina-anticorpo.
- Centrífuga do tubo por 5 min a 500 x g e 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota celular em 400 μL de 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL para controle de cores simples de streptavidina.
- Microesferas antibiotina vórtice brevemente vórtices(Tabela de Materiais)antes do uso. Adicione 80 μL de microesferas a cada amostra de célula (de 400 μL). Misture bem e incubar para adicional 20 min em 4 °C, com agitação.
- Adicione 10 mL de 1x PBS pré-refrigerados (+ 2% FBS) às células. Centrífuga do tubo por 5 min a 500 x g e 4 °C.
- Descarte o supernatant e resuspenda a pelota de celular em 1 mL de 1x PBS (+ 2% FBS). Guarde a 4°C durante a criação da unidade de separação magnética.
- Coloque uma coluna(Tabela de Materiais)no campo magnético do separador de células assistidas magnéticas (MACS) a 4 °C. Prepare a coluna para a separação magnética enxaguando-a com 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) o fluxo de gravidade em 4 °C.
- Adicione a suspensão celular do passo 2.4.7 à coluna pré-molhada a 4 °C. Permita que as células passem pela coluna a 4 °C e coletem efluentes em um tubo cônico de 15 mL.
Nota: A fração com células não rotuladas em tal efluente representa as células negativas de linhagem enriquecidas. - Coluna de lavagem com 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) a 4 °C. Repita 3x. Colete o fluxo e mantê-lo em 4 °C. Conte as células viáveis eluted por exclusão azul trypan usando um hemocytometer.
- Centrífuga o tubo cônico de 15 mL contendo o fluxo para 5 min a 500 x g e 4 °C. Descarte o supernatant. Resuspender as células em 0,5 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) e transferir o conteúdo para um tubo FACS.
- Adicione 24 μL do coquetel de anticorpos LSK a cada 107 células. O coquetel de anticorpos contém concentração igual de anticorpos de 450 streptavidin, anticorpo PE-CY7-Sca1 e anticorpo APC-c-Kit.
- Incubar por 1 h a 4 °C com agitação o escuro (coberto com folha de estanho).
- Adicione 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) ao tubo FACS. Centrífuga por 5 min a 500 x g e 4 °C. Descarte o supernatant.
- Resuspender as células com rótulo de anticorpos em 1 mL de 1x PBS (+ 2% FBS). Adicione 1 μL de 1 mg/mL propidium iodeto à suspensão celular pouco antes da classificação.
- Filtrar o conteúdo do tubo FACS usando um filtro de 40 μm logo antes de classificar as células LSK.
- Coletar células LSK, via classificação FACS, em tubo de 1,5 mL contendo 0,5 mL de mídia completa complementada com glutamina de 2 mM, 3 mg/mL de glicose, 1 mM piruvate, 1x tromboietina (TPO), fator de células-tronco 1x (SCF), 0,5 x penicilina/estreptomicina (P/S), pH 7.4 (Tabela 1).
- Faça um coquetel de anticorpos biotina misturando 3 μL por amostra dos seguintes anticorpos: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Adicione 15 μL do coquetel de biotina-anticorpo a 300 μL de células mononucleadas de medula óssea.
3. Respiração mitocondrial e ensaios de glicolíse de LSK HSPCs
-
Semeades de LSK na placa do ensaio
- Células Centrífugas LSK do passo 2.4.17 para 5 min a 500 x g e RT. Descarte o supernatant.
- Resuspenda as células em completa mídia para uma concentração final de pelo menos 70.000 células/40 μL.
- Teor de sementes de 40 meios μL (contendo 70.000 células) na placa de 8 poços revestida de PLL do passo 1.2.4. Deixe todos os poços de canto vazios.
- Centrífuga por 1 min a 450 x g e RT. Não aplique o freio. Certifique-se de que as células estão ligadas ao fundo do poço usando o microscópio invertido.
- Adicione 135 μL de mídia completa para as células em cada poço para um volume final de 175 μL. Adicionar 175 μL de mídia completa para os 2 cantos da placa como espaços em branco.
- Incubar as células da incubadora não-CO2 por 2 h a 37 °C.
- Configure um programa para adicionar medicamentos a cada poço da placa de poço no analisador usando uma métrica descrita na Tabela 2 (teste de estresse mitocondrial) e na Tabela 3 (teste de estresse de glicolyse).
NOTA: Enquanto as células estão incubando, ligue o instrumento e certifique-se que está em 37 °C.
-
Teste de estresse mitocondrial
- Prepare 45 μM soluções de estoque de oligomicina, 50 μM carbonilcial cianeto 4-(trifluromethoxy) fenixizona (FCCP) e 25 μM soluções de estoque de rotenone / antimicina A. Para preparar a solução de estoque de oligomicina de 45 μM, dissolva o conteúdo da bolsa comercialmente disponível em 280 μL da mídia completa. Para preparar a solução de ações 50 μM FCCP, dissolva o conteúdo da bolsa disponível comercialmente em 288 μL da mídia completa. Para preparar 25 μM rotenone/antimicina Uma solução de ações, dissolva o conteúdo da bolsa disponível comercialmente em 216 μL da mídia completa.
- Tire o cartucho de sensor na placa de serviço público da incubadora e carregue suas portas (A, B e C) de modo que cada poço teria concentração final de 2 μM oligomicina, 1,5 μM FCCP e 0,5 μM de rotenone/antimicina A conforme necessário, seguindo métricas de diluição descritas na Tabela 4 (para taxa de consumo de oxigênio).
- Retire a tampa do cartucho do sensor montado na placa de serviço público e coloque-a na bandeja do instrumento. Iniciar a calibração que levará 20 min.
- Após a calibração, retire a placa de serviço público e substitua-a por placa de ensaio contendo células LSK, que agora são aderidas ao fundo do poço.
- Imprensa Continue a iniciar o programa descrito na Tabela 2. Após a conclusão do programa, recuperar os dados e analisá-los usando o software Wave Desktop.
Nota: Os dados gerados a partir dos ensaios de fluxo extracelular podem ser traçados usando o gráfico de pontos do software Wave Desktop ou exportados para o programa de estatísticas baseado na web.
-
Teste de estresse de glicolyse
- Reconstituir glicose em 300 μL (100 mM), oligomicina em 288 μL (50 μM), glicose 2-D (2-DG) em 300 μL (500 mM) de mídia completa da bolsa comercialmente disponível.
- Delicadamente pipeto para cima e para baixo (~ 10x) para solubilizar os compostos. Vortex o 2-DG para aproximadamente 1 min para assegurar a dissolução apropriada em meios.
- Retire o cartucho do sensor da incubadora. Carregue portas A a C após métricas de diluição descritas na Tabela 5 para obter uma concentração final de 10 mm de glicose, 2 μM oligomicina e 50 mM 2-DG.
- Repita os passos 3.2.3 e 3.2.4.
- Imprensa Continue a iniciar o programa descrito na Tabela 3. Após a conclusão do programa, recuperar os dados e analisá-los usando o software Wave Desktop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nosso método de extração nos permitiu colher até ~ 80.000 HSPCs LSK por mouse. A viabilidade e o número de células LSK foram melhorados com o nosso método, porque nós: (1) medula óssea combinada dos membros superiores e inferiores, ossos do quadril, esterno, caixa torácica e coluna vertebral(2) evitado o uso de tampão de lyse de células vermelhas que teria aumentado a morte celular e aaglomeração, (3) usou a separação média de gradiente de densidade de células mononucleadas, e (4) evitou o uso de tampão pré-refrigerado que teria causado a perda de células de interesse em aglomerados.
Embora a análise de fluxo extracelular tenha sido tradicionalmente usada para células aderentes, nosso uso do revestimento de poços PLL, seguido pela centrífugação de células, facilitou a adesão dos HSPCs LSK à superfície do poço. Isso nos permitiu medir o fluxo extracelular e, portanto, a saúde metabólica dos HSPCs LSK. Considerando o número limitado de células que podem ser colhidas de um mouse e a longa duração do protocolo para seu isolamento, nosso uso do analisador com seu formato de 8 poços emergiu como a solução mais econômica e viável (Figura 1).
As células usam glicolysis e respiração mitocondrial para reabastecer suas necessidades energéticas e para produzir intermediários necessários para sua proliferação e crescimento19. A enzima hexokinase converte glicose em glicose-6-fosfato e que é posteriormente transformada em piruvato20. Pyruvate pode então ser processado em lactato e é exportado da célula com prótons21. A ECAR mede a acidificação dos meios de comunicação e, portanto, é um indicador de glicolyse. O piruvato também pode ser transportado para as mitocôndrias e transformado em coenzima acetilA A (CoA). Acetil CoA entra no ciclo TCA, que fornece intermediários de energia para conduzir os movimentos de elétrons da Cadeia de Transporte de Elétrons (ETC) e gera um gradiente de prótons no espaço mitocondrial intermembrana22. O oxigênio atua como o aceitador de elétrons final, e prótons voltar para a matriz mitocondrial através do complexo synthase ATP ao gerar ATP23. OCR mede o consumo de oxigênio e, portanto, é usado para quantificar a respiração mitocondrial.
Para analisar o OCR e o ECAR em condições basais e estressadas, usamos injeção sequencial de drogas que interferem com a glicolyse e a respiração mitocondrial. Usamos glicose e 2 desoxiglicose (2-DG), um análogo de glicose, para iniciar e bloquear a glicolyse,respectivamente, 24. Usamos Rotenone (um inibidor complexo i-específico do ETC), antimicina A (um inibidor complexo III-específico do ETC), oligomicina (inibidor da synthase ATP), e o agente de sacoplamento carbonilciado cianeto-4-(trifluoromethoxy)fenidigitzone (FCCP) para bloquear eventos específicos do ETC25. Nós titrated tais reagentes para encontrar a concentração óptima para HSPCs de LKS(figura 2A, B).
Para realizar o teste de estresse de glicolíse, cultamos os HSPCs LSK em uma mídia privada de glicose/piruvato (como recomendado pelo fabricante), ou em glicose/piruvato contendo mídia. Como esperado, descobrimos que o nível basal do ECAR foi maior para LSK HSPCs cultivados em glicose / pyruvate + mídia em comparação com LSK HSPCs cultivadas em glicose / piruvate-media. A primeira injeção com glicose não alterou o nível basal de ECAR para HSPCs LSK cultivados em glicose / mídia piruvate +enquanto impulsionou a glicolíse em LSK HSPCs cultivadas em glicose / piruvate-mídia. No entanto, o nível basal do ECAR, após a injeção com glicose, manteve-se menor em comparação com o grupo glicose/piruvato+. A segunda injeção com oligomicina, que poderia bloquear a produção de ATP através da fosforilação oxidativa, ativou a glicolíse em seu nível máximo de HSPCs LSK em mídia de glicose/piruvate+, mas não afetou o grupo de glicose/piruvate. A última injeção com o análogo de glicose 2-DG devolveu o ECAR ao seu nível não glicolítico (Figura 2C).
Para o teste de estresse mitocondrial, medimos o nível basal de OCR de LSK HSPCs em glicose / mídia piruvate +. Primeiro injetamos oligomicina que inicialmente hiperpolarizou a membrana mitocondrial, impediu mais prótons bombeando através dos complexos etc, e, assim, reduziu a taxa de respiração mitocondrial. A segunda injeção de ionóforos FCCP empurrou os níveis etc e OCR ao seu máximo como as células tentaram recuperar o potencial da membrana mitocondrial. A injeção final com outros dois inibidores do ETC (antimicina A e rotenone) causou a parada completa da respiração mitocondrial e, portanto, o OCR reverteu ao seu nível mínimo(Figura 2D).
Figura 1: Schema demonstrando isolamento de LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) células progenitoras de tronco hematopoiético da medula óssea do rato. A medula óssea é extraída de ossos e células mononucleares (MNCs) são isoladas através da separação de gradiente médio gradiente de densidade. Em seguida, as células são incubadas com linhagem biotinylated+ anticorpos e streptavidin-conjugado contas magnéticas para elute Lineage negativo (Lin-) células após a sua separação magnética. Lin- as células são posteriormente incubadas com anticorpos LSK e células LSK isoladas pela classificação celular. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Análises de fluxo extracelular das células progenitoras de tronco hematopoiéticas de murine LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) células progenitoras hematopoiéticas. (A,B) Descrição mecanicista de medicamentos utilizados para análises de fluxo extracelular durante a glicolyse e respiração mitocondrial. (C) Resultados representativos do teste de estresse de glicolíse em HSPCs lsk de urina na presença ou ausência de glicose/piruvate na mídia. (D)Resultados representativos do teste de estresse mitocondrial em Murine LSK HSPCs. Barras de erro representam o desvio padrão da média (SD) Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Estoque | Concentração final | Volume de 30 mL | |
| Mídia completa | 28.691 mL | ||
| P/S P/S | 100x 100x | 0,5x 0,5x | 150 μL 150 μL |
| L-Glutamina | 200 mM | 2 mM | 300 μL |
| Piruvato | 100 mM | 1 mM | 300 μL |
| Glicose | 1 M/180.2 mg/mL | 3 mg/mL | 499,4 μL 499,4 μL |
| Tpo | 100 μg/mL | 100 ng/mL 100 ng/mL | 30 μL |
| Ccah | 100 μg/mL | 100 ng/mL 100 ng/mL | 30 μL |
Tabela 1: Conteúdo e preparação da mídia completa do XF.
| Basal | Oligomicina (2 μM) | FCCP (1,5 μM) | R/A (0,5 μM) | |
| Repetição | 3 vezes | 3 vezes | 3 vezes | 3 vezes |
| Mistura | 3 min | 3 min | 3 min | 3 min |
| Esperar | 0 min | 0 min | 0 min | 0 min |
| Medida | 4 min | 4 min | 4 min | 4 min |
Tabela 2: Protocolo de injeção para o teste de estresse mitocondrial.
| Basal | Glicose (10 mM) | Oligomicina (2 μM) | 2-DG (50 mM) | |
| Repetição | 3 vezes | 3 vezes | 3 vezes | 3 vezes |
| Mistura | 3 min | 3 min | 3 min | 3 min |
| Esperar | 0 min | 0 min | 0 min | 0 min |
| Medida | 7 min | 7 min | 7 min | 7 min |
Tabela 3: Protocolo de injeção para o teste de estresse de glicolyse.
| Porta | Droga | Concentração final de poços (μM) | Volume de solução de estoque (μL) | Volume de mídia (μL) | Solução portuária (μM) | Volume adicionado ao porto (μL) |
| Porto A | Oligomicina | 2 | 100 | 181.25 | 16 | 25 |
| Porto B | FCCP FCCP | 1.5 | 100 | 270.4 | 13.5 | 25 |
| Porto C | Rotenone/antimicina A | 0.5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
Tabela 4: Métricas de diluição para obter a concentração de medicamentos ideal para teste de estresse mitocondrial em cada poço do analisador.
| Porta | Droga | Concentração final do poço | Volume de solução de estoque (μL) | Volume de mídia (μL) | Solução portuária | Volume adicionado ao porto (μL) |
| Porto A | Glicose | 10 mM | 300 | 75 | 80 mM | 25 |
| Porto B | Oligomicina | 2 μM 2 μM | 108 | 192 | 18 μM | 25 |
| Porto C | 2 DG 2-DG | 50 mM | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
Tabela 5: Métricas de diluição para obter a concentração de medicamentos ideal para teste de estresse em glicolyse em cada poço do analisador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, demonstramos o isolamento de uma quantidade máxima de população de HSPCs lspcs de urina pura e viável, bem como a medição de sua glicolíse e respiração mitocondrial com um analisador de fluxo extracelular. Especificamente, o protocolo supera as seguintes questões técnicas para o uso de LSK HSPCs : i) a baixa frequência de LSK HSPCs na medula óssea de urina14, ii) baixa atividade metabólica basal de LSK HSPCs26, iii) a fragilidade dos LSK HSPCs27, e iv) a não adesão de LSK HSPCs aos vasos. Além disso, otimizamos as concentrações de medicamentos e a composição da mídia para o desempenho ideal dos ensaios de fluxo extracelular.
HSPCs derivados da medula óssea residem no nicho hipóxico e exibem um fenótipo glicolítico, que é crucial para a manutenção de sua caule28. Por outro lado, a respiração é essencial para a diferenciação do HSPC6. Como disfunção metabólica de HSPCs leva a doenças do sangue; aqui, descrevimos o protocolo e tutoriais baseados em vídeo para medir as características das funções metabólicas, como o OCR e o ECAR, para LSKHS derivados de medula óssea de urina.
Ao contrário das recomendações do fabricante para células aderentes, descobrimos que os resultados do teste de estresse de glicolíse em HSPCs LSK são ótimos quando as células são cultivadas em glicose / mídia piruvate + em comparação com glicose / piruvate-mídia. Percebemos que a falta de glicose na mídia para LSK HSPCs resulta em morte celular durante o período de equilíbrio ~ 2 h em uma incubadora não-CO2. Como a injeção de glicose não alterou o nível basal de ECAR para LSK HSPCs cultivados em mídia de glicose/piruvate+, nossa modificação do protocolo não só preserva a essência do teste de estresse glicolítico, mas também nos permite distinguir entre a glicolíse basana (antes de quaisquer injeções), capacidade glicolítica (após injeção de oligomimico) e acidificação não glicolítica (após injeção com 2 DG) de HSPCs LSK.
Nosso teste de estresse mitocondrial de LSK HSPCs mostrou que o ATP produzido pela fosforia oxidativa em LSK HSPCs é mínimo, como visto com a pequena redução no OCR após a injeção de oligomicina. Por outro lado, a elevação do OCR na injeção da FCCP afirma que os HSPCs LSK são capazes de responder a uma maior demanda de energia.
Juntos, o objetivo deste protocolo era fornecer um conjunto de instruções claras e concisas para acompanhar tutoriais baseados em vídeo sobre como medir as funções metabólicas, como o OCR e o ECAR, dos HSPCs. Com modificações-chave e recomendações adicionais para a colheita de um maior número de HSPCs LSK saudáveis, tornando-os aderentes à superfície do poço, bem como a otimização do tempo de incubação e concentração de drogas, este protocolo irá capacitar investigadores para analisar a glicolíse e o estado de respiração mitocondrial de HSPCs, bem como células hematopoiéticas não aderentes durante o desenvolvimento do sangue e doenças.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é, em parte, apoiado pelo apoio financeiro dos Institutos Nacionais de Saúde (HL131645, CA016058), da Fundação St. Baldrick e da Fundação Pelotonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B.
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
