Summary
Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) passano da uno stato quiescente a uno stato di differenziazione a causa della loro plasticità metabolica durante la formazione del sangue. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la respirazione mitocondriale e la glicolisi degli HSPC.
Abstract
Le cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (HPG) hanno una plasticità metabolica distinta, che permette loro di passare dal loro stato quiescente a uno stato di differenziazione per sostenere le richieste della formazione del sangue. Tuttavia, è stato difficile analizzare lo stato metabolico (respirazione mitocondriale e glicolisi) degli HSPC a causa del loro numero limitato e della mancanza di protocolli ottimizzati per HSPC fragili e non aderenti. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per misurare la respirazione metabolica (tasso di consumo di ossigeno; OCR) e glicolisi (tasso di acidificazione extracellulare; ECAR) di HSPC di midollo osseo murino-Lingo Questo protocollo fornisce una maggiore quantità di HSPC LSK dal midollo osseo murino, migliora la vitalità degli HSPC durante l'incubazione, facilita l'analisi del flusso extracellulare di HSPC non aderenti e fornisce protocolli di iniezione ottimizzati (concentrazione e tempo) per i farmaci che prendono di mira il fosforolazione ossidativa e le vie glicolytiche. Questo metodo consente la previsione dello stato metabolico e della salute degli HPC durante lo sviluppo del sangue e le malattie.
Introduction
Poiché la durata della vita della maggior parte delle cellule del sangue mature è breve, l'omeostasi del sangue si basa sull'auto-rinnovamento e la differenziazione di una popolazione longeva ma rara di cellule staminali ematopoietiche (HSPN)1. Gli HSPC sono quiescenti, ma sono pronti a proliferare e a subire differenziazione sulla stimolazione per sostenere le esigenze del sistema sanguigno. Poiché ogni stato cellulare HSPC richiede una domanda bioenergetica unica, i cambiamenti metabolici sono i fattori chiave delle decisioni del destino HSPC. Pertanto, la perdita di plasticità metabolica, alterando l'equilibrio tra quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione degli HPG, porta spesso a disturbi mielo- o linfo-proliferativi. Insieme, la comprensione della regolazione metabolica dello sviluppo HSPC è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle neoplasie ematologiche2,3,4,5.
La respirazione mitocondriale e la glicolisi generano ATP per guidare reazioni intracellulari e produrre gli elementi costitutivi necessari per la sintesi delle macromolecole. Poiché gli HSPC hanno una bassa massa mitocondriale rispetto alle cellule differenziate6 e sostengono la quiescenza nelle nicchie ipossiche del midollo osseo, gli HSPC si basano principalmente sulla glicolisi. L'attivazione di HSPC migliora il loro metabolismo mitocondriale che porta alla perdita di quiescenza e la loro successiva immissione nel ciclo cellulare. Tale plasticità metabolica degli HSPN consente la manutenzione del pool HSPC per tutta la vita adulta6,7,8,9,10,11,12. Pertanto, è fondamentale studiare le loro attività metaboliche, come il tasso di consumo di ossigeno (OCR; indice di fosforo ossidativo) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR; indice della glicolisi) per analizzare l'attivazione di HSPC e lo stato di salute. Sia l'OCR che l'ECAR possono essere misurati simultaneamente, in tempo reale, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tuttavia, il metodo corrente richiede un numero elevato di celle ed è ottimizzato per le celle aderenti13. Poiché gli HSPC non possono essere isolati in grandi quantità dai topi14, richiedono lo smistamento per ottenere una popolazione pura, sono cellule non aderenti15e non possono essere coltivate durante la notte senza evitare la differenziazione16, è stato difficile misurare l'OCR e l'ECAR degli HSPC. Qui, forniamo una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video-based tutorial su come misurare la respirazione metabolica e la glicolisi di poche migliaia di murine osso midollo-LineagenegSca1-c-Kit(LSK) HSPC.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dal Comitato nazionale per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico (IACUC).
NOT: Il protocollo è descritto in ordine cronologico che si estende per il periodo di due giorni. Utilizzare nuovi reagenti come descritto nel protocollo riportato di seguito.
1. Preparazione del reagenti il giorno precedente al test
-
Idratare la cartuccia del sensore.
- Incubare 5 mL del calibro (Tabella dei Materiali) in un incubatore non-CO2 37 gradi centigradi durante la notte.
- Aprire il kit di analisi del flusso (Tabella dei materiali) e separare la cartuccia del sensore (verde; superiore) dalla piastra di utilità (trasparente; inferiore). Posizionare quindi la cartuccia del sensore capovolta e adiacente alla piastra di utilità.
- Utilizzando acqua sterile, riempire i pozzetto della piastra di utilità (200 ) e le camere intorno ai pozzi (400 .
- Immergere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano completamente coperti dall'acqua. Toccare 3x per evitare la formazione di bolle.
- Collocare la cartuccia sommersa nella piastra di utilità in un'incubatrice non-CO2 37 gradi centigradi durante la notte. Per evitare l'evaporazione dell'acqua, assicurarsi che l'incubatrice sia adeguatamente umidificata. Posizionare un becher aperto contenente H2O come ulteriore precauzione accanto alla piastra cartuccia-utility, in particolare se si utilizza un forno normale.
-
Preparare il piatto di assaggio.
- Sterilizzare la superficie della biosicurezza cabinet classe 2 utilizzando 70% etanolo. Aprire la piastra di qualità sotto il cofano.
- Aggiungete 40 l di soluzione poli-L-ll(PLL) disponibile in commercio a ciascun bene della piastra di s'anguilla sotto il cofano.
- Coprire la piastra di prova con il coperchio fornito nel kit. Incubare la piastra di aspetto chiusa a temperatura ambiente (RT) sotto il cofano per 1 h.
NOT: L'obiettivo dell'incubazione è quello di lasciare PLL rivestire la superficie della piastra di saggio per facilitare l'adesione delle celle di sospensione alla superficie della piastra di saggio. - Dopo 1 h incubazione della piastra di gusto, rimuovere la soluzione in eccesso con un aspiratore sterile a basso vuoto e asciugare l'aria del pozzo sotto il cofano.
NOT: Ci vogliono 30-60 dollari per asciugare ad aria i pozzetti della piastra di manto a seguito dell'eccessiva rimozione del PLL con l'aspiratore.
2. Giorno del Saggio
- Preparare la cartuccia.
- Sollevare la cartuccia del sensore. Metterlo a testa in giù nella cappa di coltura dei tessuti e scartare l'acqua dalla piastra di utilità.
- Riempire i pozze di servizio con 200 gradi del calibro preriscaldato.
- Riempire le camere intorno ai pozzi con 400 l del calibratore.
- Sommergi la cartuccia del sensore nella piastra di utilità, assicurandoti che i sensori siano completamente coperti dal calibratore. Toccare 3x per evitare la formazione di bolle.
- Equilibrate la cartuccia del sensore immersa nella piastra di utilità in un'incubatrice non-CO2 37 gradi centigradi per 45-60 min.
- Raccogliere hSPC LSK derivati da murine.
- Per accogliere un numero sufficiente di repliche biologiche, si prevede di utilizzare Gli HSPC derivati da un topo per pozzo della piastra di analisi.
NOT: Questo metodo di raccolta del midollo osseo fornisce 50.000-80.000 LSK HSPC da ogni topo. Questo protocollo per misurare il flusso extracellulare è ottimizzato per HSPC LSK da 70.000 dollari per pozzo di 96 pozzi. - Topi eutanasi che utilizzano sovradosaggio di CO2 e lussazione cervicale, seguendo metodi locali approvati da IACUC.
- Sterilizzare la superficie degli utensili di dissezione e la panca utilizzando il 70% di etanolo.
- Per ogni topo, precompilare una parabola Petri con 1x salina tamponata da fosfato (PBS) contenente il 2% di siero bovino fetale inattivato dal 2% (FBS) a RT.
NOT: Non utilizzare PBS preraffreddamento in quanto creerà grumi nei passaggi seguenti. - Spruzzare 70% di etanolo (v/v) sull'intero topo eutanasia. Isolare tutte le ossa, compresi gli arti superiori e inferiori, le ossa dell'anca, lo sterno, la gabbia toracica e la colonna vertebrale, dal topo17,18. Estrarre la materia bianca dal midollo spinale del mouse in quanto può contaminare le cellule LSK. Collocare tutte le ossa in 1x PBS (2% FBS), mentre vengono raccolte, in un piatto Petri fino a nuovo utilizzo.
- Invertire un tubo conico da 50 ml (nuovo ogni volta) e utilizzarlo per triturare le ossa sommerse in 1x PBS (-2% FBS) nel piatto Petri.
- Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, pipetta su e giù (10x) per lavare uniformemente le cellule dalle ossa, dopo aver schiacciato le ossa.
- Posizionare un colino a 40 m su un tubo conico da 50 ml. Pre-bagnato della superficie del colino passando 1 mL di 1x PBS (2% FBS).
- Raccogliere la sospensione cellulare derivata dal midollo osseo dal punto 2.2.7 e passarla attraverso la superficie pre-bagnata del colino cellulare per rimuovere i detriti ossei.
- Ripetere i passaggi da 2.2.6 a 2.2.9 fino a quando tutti i materiali ossei diventano bianchi come marcatore che la maggior parte delle cellule del midollo osseo sono raccolte nel tubo conico da 50 mL.
NOT: Spesso ci vogliono due tubi conici da 50 mL per mouse per raccogliere tutte le cellule derivate dal midollo osseo. - Centrifuga 50 mL tubi conici contenenti cellule derivate dal midollo osseo per 5 min a 500 x g e RT.
- Togliete il super-acletterante. Risospendere le cellule derivate dal midollo osseo (combinare il contenuto di entrambi i tubi da 50 mL) in 5 mL di 1x PBS (-2% FBS) come volume finale e mantenere le cellule a RT.
- Per accogliere un numero sufficiente di repliche biologiche, si prevede di utilizzare Gli HSPC derivati da un topo per pozzo della piastra di analisi.
- Raccogliere cellule di midollo osseo murinee mononucleated.
- Aggiungere 5 mL di gradiente medio di densità (cioè Ficoll) a un tubo conico da 15 mL. Quindi aggiungere lentamente 5 mL della sospensione della cellula del midollo osseo. Assicuratevi che le celle rimangano come un livello al di sopra del mezzo di sfumatura di densità.
- Centrifuga per 30 min a 500 x g e RT. Non usare un freno nella centrifuga. Assicurarsi che la centrifuga sia alla più bassa accelerazione possibile (ad esempio, 1 accelerazione e 0 decelerazione).
- Raccogliere l'interfaccia centrale delle cellule mononilleate (colore bianco) dopo la centrifugazione in un tubo conico fresco da 15 mL.
- Lavare le cellule, raccolte da un mezzo di pendenza di densità, con 5 mL di 1x PBS (-2% FBS). Centrifuga per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Togliete il super-acletterante.
- Ripetere il passaggio 2.3.4.
- Risospendere il contenuto della cella del tubo in 300 -L di 1x PBS (-2% FBS). Aliquota 10 di sospensione cellulare per il controllo incontaminato o monocolore in un tubo FACS.
- Raccogliere LSK HSPC da cellule mononucleate del midollo osseo murineo.
- Preparare un cocktail di biotina-anticorpi mescolando 3 -L per campione dei seguenti anticorpi: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Aggiungere 15 l del cocktail biotina-anticorpo a 300 -L di cellule mononucleate del midollo osseo.
NOT: Ogni anticorpo viene utilizzato a 1:100 diluizione. - Incubare le cellule con il cocktail biotina-anticorpo per 30 min a 4 gradi centigradi con agitazione per evitare che le cellule si aggrovigliano nella parte inferiore del tubo.
- Aggiungere 10 mL di PBS pre-raffreddato (2% FBS) alle cellule mescolate con il cocktail biotina-anticorpo.
- Centrifugare il tubo per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 400 -L l of 1x PBS (2% FBS). Aliquota 10 L per il controllo del colore singolo streptavidin.
- Brevemente vortice anti-biotina microsfere (Tabella dei materiali) prima dell'uso. Aggiungete 80 l di microsfere ad ogni campione di cellule (di 400 gradi centigradi). Mescolare bene e incubare per ulteriori 20 min a 4 gradi centigradi, con agitazione.
- Aggiungere 10 mL di PBS 1x pre-raffreddato alle celle. Centrifugare il tubo per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 1x PBS (-2% FBS). Conservare a 4 gradi centigradi durante la configurazione dell'unità di separazione magnetica.
- Collocare una colonna (Tabella dei materiali) nel campo magnetico del separatore di ordinamento delle celle magnetiche assistite (MACS) a 4 gradi centigradi. Preparare la colonna per la separazione magnetica risciacquandola con 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) sotto il flusso di gravità a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere la sospensione della cella dal punto 2.4.7 alla colonna pre-bagnata a 4 gradi centigradi. Lasciare che le cellule passino attraverso la colonna a 4 gradi centigradi e raccogliere gli effluenti in un tubo conico da 15 mL.
NOT: La frazione con celle senza etichetta in tali effluenti rappresenta le cellule negative di lignaggio arricchite. - Lavare la colonna con 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) a 4 gradi centigradi. Ripetere 3x. Raccogliere il flusso attraverso e tenerlo a 4 gradi centigradi. Contare le cellule vitali eluite con l'esclusione blu trypan utilizzando un emocitometro.
- Centrifugare il tubo conico da 15 mL contenente il flusso-through per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Risospendere le celle in 0,5 mL di 1x PBS (-2% FBS) e trasferire il contenuto in un tubo FACS.
- Aggiungere 24 - L del cocktail anticorpo LSK a ogni 107 cellule. Il cocktail anticorpale contiene la stessa concentrazione di anticorpi 450-streptavidin, anticorpo PE-CY7-Sca1, e anticorpo APC-c-Kit.
- Incubare per 1 h a 4 gradi centigradi con agitazione sotto scuro (coperto di stagnola).
- Aggiungete 3 mL di 1x PBS (-2% FBS) al tubo FACS. Centrifuga per 5 min a 500 x g e 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
- Risospendere le cellule con etichettatura anticorpo in 1 mL di 1x PBS (-2% FBS). Aggiungere 1 ll di 1 mg/mL di iodio iodio alla sospensione cellulare appena prima dello smistamento.
- Filtrare il contenuto del tubo FACS utilizzando un colino da 40 m subito prima di ordinare le celle LSK.
- Raccogliere le cellule LSK, tramite lo smistamento FACS, in un tubo da 1,5 mL contenente 0,5 mL di supporto completo integrato con 2 mM di glutammina, 3 mg/mL di glucosio, 1 mM di piravate, 1x trombopoietina (TPO), 1x fattore di cellule staminali (SCF), 0,5x penicillina/streptomycin (P/S), pH 7.4Table).
- Preparare un cocktail di biotina-anticorpi mescolando 3 -L per campione dei seguenti anticorpi: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Aggiungere 15 l del cocktail biotina-anticorpo a 300 -L di cellule mononucleate del midollo osseo.
3. Sospensione mitocondriale e saggi di glicolisi degli HSPC LSK
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Semina LSK nella piastra di saggio
- Centrifuga cellule LSK da passo 2.4.17 per 5 min a 500 x g e RT. Scartare il sovratalmente.
- Risospendere le cellule in supporti completi ad una concentrazione finale di almeno 70.000 cellule/40 .
- Contenuto di semi di 40 -L (contenente 70.000 celle) nella lastra di 8 pozze di PLL dal punto 1.2.4. Lasciare vuoti tutti i pozzi d'angolo.
- Centrifuga per 1 min a 450 x g e RT. Non applicare il freno. Assicurarsi che le cellule siano attaccate al fondo del pozzo utilizzando il microscopio invertito.
- Aggiungete 135 l di supporto completo alle celle in ogni pozzo per un volume finale di 175 gradi.
- Incubare le cellule nell'incubatrice nonCO2 per 2 h a 37 .
- Impostare un programma per aggiungere farmaci a ogni pozzo della piastra di pozzo nell'analizzatore utilizzando una metrica descritta nella Tabella 2 (test di stress mitocondriale) e nella tabella 3 (test di stress della glicolisi).
NOTA: Durante l'incubazione delle cellule, accendere lo strumento e assicurarsi che sia a 37 gradi centigradi.
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Test di stress mitocondriale
- Preparare 45 soluzioni di stock di oligomicina, 50 m di cianuro carbonile 4-(trifluromethoxy)fenylhydrazone (FCCP) e 25 soluzioni di stock m di rotenone/antimicina A. Per preparare una soluzione di 45 oligomicina, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 280 - L del supporto completo. Per preparare una soluzione di 50 m FCCP, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 288 - L del supporto completo. Per preparare una soluzione di supporto a 25 M rotenone/antimycin A, sciogliere il contenuto della sacca disponibile in commercio in 216 - L del supporto completo.
- Togliere la cartuccia del sensore nella piastra di utilità dall'incubatrice e caricare le sue porte (A, B e C) in modo che ogni pozzo abbia una concentrazione finale di 2 oligomicina M, 1,5 M FCCP e 0,5 M di rotenone/antimicina A come richiesto, seguendo le metriche di diluizione descritte nella tabella 4 (per il tasso di consumo di ossigeno).
- Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore assemblato nella piastra di utilità e posizionarlo sul vassoio dello strumento. Avviare la calibrazione che richiederà 20 min.
- Dopo la calibrazione, rimuovere la piastra di utilità e sostituirla con una piastra di analisi contenente celle LSK, che ora sono aderenti al fondo del pozzo.
- Premere Continua per avviare il programma descritto nella tabella 2. Dopo il completamento del programma, recuperare i dati e analizzarli utilizzando il software Wave Desktop.
NOT: I dati generati dai saggi del flusso extracellulare possono essere tracciati utilizzando il grafico a punti dal software Wave Desktop o esportati in un programma di statistiche basato sul web.
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Test di stress della glicolisi
- Ricostituire il glucosio in 300 ml (100 mM), oligomycin in 288 L (50 m), glucosio 2D (2-DG) in 300 l (500 mM) di supporti completi dalla sacca disponibile in commercio.
- Delicatamente pipette su e giù (10x) per solubilizzare i composti. Vorticare la DG 2 per circa 1 min per garantire una corretta dissoluzione nei supporti.
- Togliere la cartuccia del sensore dall'incubatrice. Le porte di carico da A a C in base alle metriche di diluizione descritte nella tabella 5 per ottenere una concentrazione finale di glucosio di 10 mM, 2 oligomicina e 50 mM 2-DG.
- Ripetere i passaggi 3.2.3 e 3.2.4.
- Premere Continua per avviare il programma descritto nella tabella 3. Dopo il completamento del programma, recuperare i dati e analizzarli utilizzando il software Wave Desktop.
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Representative Results
Il nostro metodo di estrazione ci ha permesso di raccogliere fino a 80.000 HSPC LSK per mouse. La vitalità e il numero di cellule LSK sono stati migliorati con il nostro metodo, perché noi: (1) combinato midollo osseo da arti superiori e inferiori, ossa dell'anca, sterno, gabbia toracica, e la colonna vertebrale, (2) evitato utilizzando buffer di lisi a cellule rosse che avrebbe aumentato la morte delle cellule e l'agglomeramento, (3) utilizzato il gradiente di densità media separazione delle cellule mono-nucleate, e (4) evitato l'uso di buffer pre-freddo che avrebbe causato la perdita di cellule di interesse in ciuffi.
Anche se l'analisi del flusso extracellulare è stata tradizionalmente utilizzata per le cellule aderenti, il nostro uso del rivestimento PLL dei pozzi, seguito dalla centrifugazione delle cellule su di esso, ha facilitato l'aderenza degli HSPC LSK alla superficie del pozzo. Questo ci ha permesso di misurare il flusso extracellulare, e quindi la salute metabolica degli HSPC LSK. Considerando il numero limitato di cellule che possono essere raccolte da un mouse e la lunga durata del protocollo per il loro isolamento, il nostro uso dell'analizzatore con il suo formato di 8 pozzi è emerso come la soluzione più conveniente e fattibile (Figura 1).
Le cellule utilizzano la glicolisi e la respirazione mitocondriale per ricostituire il loro fabbisogno energetico e per produrre intermedi necessari per la loro proliferazione e crescita19. L'enzima esokinasi converte il glucosio nel glucosio-6-fosfato e che viene successivamente trasformato in piravadi20. Pyruvate può quindi essere trasformato in lattato e viene esportato dalla cella con protoni21. ECAR misura l'acidificazione dei media ed è quindi un indicatore di glicolisi. Pyruvate può anche essere trasportato nei mitocondri e trasformato in coenzese acetil A (CoA). Acetyl CoA entra nel ciclo TCA, che fornisce intermedi energetici per guidare i movimenti degli elettroni della catena di trasporto elettronico (ETC) e genera un gradiente protonico nello spazio inter-membrana mitocondriale22. L'ossigeno agisce come l'accettatore finale di elettroni, e i protoni tornano alla matrice mitocondriale attraverso il complesso di sinteassi ATP durante la generazione di ATP23. L'OCR misura il consumo di ossigeno e viene quindi utilizzato per quantificare la respirazione mitocondriale.
Al fine di analizzare l'OCR e l'ECAR in condizioni basali e sollecitate, abbiamo usato l'iniezione sequenziale di farmaci che interferiscono con la glicolisi e la respirazione mitocondriale. Abbiamo usato glucosio e 2-deossiglucosio (2-DG), un analogo di glucosio, per avviare e bloccare la glicolisi rispettivamente24. Abbiamo usato Rotenone (un complesso inibitore Specifico io dell'ETC), antimicina A (un complesso inibitore III-specifico dell'ETC), oligomycin (inibitore della synthasi ATP), e l'agente disaccoppiamento carbonyl cianide-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazone (FCCP) per bloccare eventi specifici dell'ETC25. Abbiamo titolato tali reagenti per trovare la concentrazione ottimale per gli HSPC LKS(Figura 2A,B).
Per eseguire il test di stress della glicolisi, abbiamo coltivato gli HSPC LSK in un supporto privo di glucosio/pyruvate (come raccomandato dal produttore), o in glucosio / pirova Come previsto, abbiamo scoperto che il livello basale dell'ECAR era più alto per gli HSPC LSK coltivati nei media di glucosio/pyruvate rispetto agli HSPC LSK coltivati nei media glucosio/pyruvate-media. La prima iniezione con glucosio non ha modificato il livello basale di ECAR per Gli HSPC LSK coltivati nei media glucosio/pyruvate, mentre ha stimolato la glicolisi negli HSPC LSK coltivati nei media glucosio/pyruvate-. Tuttavia, il livello basale dell'ECAR, dopo l'iniezione con glucosio, è rimasto inferiore rispetto al gruppo glucosio/pyruvate. La seconda iniezione con oligomicina, che potrebbe bloccare la produzione di ATP attraverso la fosfororylazione ossidativa, ha attivato la glicolisi al suo massimo livello di HSPC di glucosio/pyruvate, ma non ha influenzato il gruppo glucosio/pirova-, ma non ha influenzato il gruppo glucosio/pirova.- L'ultima iniezione con l'analogo di glucosio 2-DG ha riportato l'ECAR al suo livello non glicolitico (Figura 2C).
Per la prova di stress mitocondriale, abbiamo misurato il livello basale di OCR degli HSPC LSK nei media glucosio/pyruvate. Per prima cosa abbiamo iniettato l'oligomicina che inizialmente iperpolarmente la membrana mitocondriale, ha impedito più pompaggio di protoni attraverso i complessi ETC, e quindi ha ridotto il tasso di respirazione mitocondriale. La seconda iniezione di ionofori FCCP ha spinto i livelli di ETC e OCR al loro massimo, poiché le cellule hanno cercato di recuperare il potenziale della membrana mitocondriale. L'iniezione finale con altri due degli inibitori dell'ETC (antimicina A e rotenone) ha causato l'arresto completo della respirazione mitocondriale e quindi l'OCR è tornato al suo livello minimo (Figura 2D).
Figura 1: Schema che dimostral'isolamentodelle cellule progenitrici dello stelo ematopoietico (LSK) dal midollo osseo del topo . Il midollo osseo viene estratto dalle ossa e le cellule mononucleari (MNC) sono isolate attraverso la separazione del gradiente medio grado di densità. Successivamente, le cellule vengono incubate con lignaggi biotinylati- anticorpi e perline magnetiche coniugate streptavidin per eluire le cellule negative di lignaggio (Lin-) dopo la loro separazione magnetica. Lin- le cellule vengono successivamente incubate con anticorpi LSK e cellule LSK isolate dallo smistamento cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi del flusso extracellulare delle cellule progenitrici del progenitore dello stelo ematopoietico (LSK) del flusso extracellulare di murine LineagenegSca1-c-Kit (LSK). (A,B) Descrizione meccanicistica dei farmaci utilizzati per le analisi del flusso extracellulare durante la glicolisi e la respirazione mitocondriale. (C) Risultati rappresentativi della prova di stress della glicolisi sugli HSPC Murini LSK in presenza o assenza di glucosio/pirova nei media. (D) Risultati rappresentativi della prova di stress mitocondriale sugli HSPC LSK murini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Stock | Concentrazione finale | Volume per 30 mL | |
| Completa supporto | 28.691 mL | ||
| P/S (in inglese) | 100x | 0,5x | 150 lL |
| L-Glutamina | 200mm | 2 mM | 300 lL |
| Piruvato | 100 mM | 1 mM | 300 lL |
| Glucosio | 1 M/180,2 mg/mL | 3 mg/mL | 499,4 l l |
| Tpo | 100 g/mL | 100 ng/mL | 30 ll |
| Scf | 100 g/mL | 100 ng/mL | 30 ll |
Tabella 1: Contenuto e preparazione del supporto XF completo.
| Basale | Oligomicina (2 m) | FCCP (1,5 M) | R/A (0,5 m) | |
| Ripetizione | 3 volte | 3 volte | 3 volte | 3 volte |
| Mix | 3 min | 3 min | 3 min | 3 min |
| Aspettare | 0 min | 0 min | 0 min | 0 min |
| Misura | 4 min | 4 min | 4 min | 4 min |
Tabella 2: Protocollo di iniezione per la prova di stress mitocondriale.
| Basale | Glucosio (10 mM) | Oligomicina (2 m) | 2-DG (50 mM) | |
| Ripetizione | 3 volte | 3 volte | 3 volte | 3 volte |
| Mix | 3 min | 3 min | 3 min | 3 min |
| Aspettare | 0 min | 0 min | 0 min | 0 min |
| Misura | 7 min | 7 min | 7 min | 7 min |
Tabella 3: Protocollo di iniezione per la prova di stress della glicolisi.
| Porta | Droga | Concentrazione finale del pozzo (M) | Volume della soluzione stock (L) | Volume del supporto (L) | Soluzione porta (M) | Volume aggiunto alla porta (L) |
| Porta A | Oligomycina | 2 | 100 | 181.25 | 16 | 25 |
| Porta B | FCCP | 1.5 | 100 | 270.4 | 13.5 | 25 |
| Porta C | Rotenone/antimicina A | 0.5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
Tabella 4: Metriche di diluizione per ottenere una concentrazione ottimale di farmaci per la prova di stress mitocondriale in ogni pozzo dell'analizzatore.
| Porta | Droga | Concentrazione finale di pozzi | Volume della soluzione stock (L) | Volume del supporto (L) | Soluzione portuale | Volume aggiunto alla porta (L) |
| Porta A | Glucosio | 10 mM | 300 | 75 | 80mm | 25 |
| Porta B | Oligomycina | 2 M | 108 | 192 | 18 M | 25 |
| Porta C | 2-DG | 50mm | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
Tabella 5: Metriche di diluizione per ottenere una concentrazione ottimale di farmaci per il test di stress della glicolisi in ogni pozzo dell'analizzatore.
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Discussion
Qui, dimostriamo l'isolamento di una quantità massima di popolazione di HSPC murini murini puro e vitale, nonché la misurazione della loro glicolisi e della respirazione mitocondriale con un analizzatore di flusso extracellulare. In particolare, il protocollo supera i seguenti problemi tecnici per l'uso di HSPC LSK : i) la bassa frequenza degli HSPC LSK nel midollo osseo murino14, ii) bassa attività metabolica basale di LSK HSPCs26, iii) la fragilità di LSK HSPCs27, ed iv) la non aderenza degli HSPC LSK alla coltura15. Inoltre, abbiamo ottimizzato le concentrazioni di farmaci e la composizione dei media per ottenere prestazioni ottimali dei saggi del flusso extracellulare.
Gli HPGC derivati dal midollo osseo risiedono nella nicchia ipossica e mostrano un fenotipo glicolitico, che è fondamentale per il mantenimento della loro stesità28. Al contrario, la respirazione è essenziale per la differenziazione HSPC6. Come disfunzione metabolica degli HPC porta a malattie del sangue; qui, abbiamo descritto il protocollo e video-based tutorial per misurare i segni distintivi delle funzioni metaboliche, come l'OCR e l'ECAR, per gli HSCI di origine del midollo osseo murno.
Contrariamente alle raccomandazioni del produttore per le cellule aderenti, abbiamo scoperto che i risultati dello stress di glicolisi sugli HSPC LSK sono ottimali quando le cellule vengono coltivate nei media glucosio/pyruvate, rispetto ai supporti glucosio/pyruvate-media. Ci siamo resi conto che la mancanza di glucosio nei media per gli HSPC di LSK provoca la morte delle cellule durante il periodo di equilibratione di 2 dollari in un'incubatrice non-CO2. Poiché l'iniezione di glucosio non ha modificato il livello basale di ECAR per gli HSPC LSK coltivati nei media di glucosio/pyruvate, la nostra modifica del protocollo non solo conserva l'essenza della prova di stress glicolitico, ma ci permette anche di distinguere tra la glicolisi basale (prima di eventuali iniezioni), la capacità glicolitica (dopo l'iniezione di oligomicina) e l'acidificazione non glicolitica (dopo l'iniezione con 2-DG) degli HSPC.
Il nostro test di stress mitocondriale degli HSPC LSK ha mostrato che l'ATP prodotto dalla fosforilazione ossidativa negli HSPC LSK è minimo come si è visto con la piccola riduzione dell'OCR dopo l'iniezione di oligomicina. Al contrario, l'elevazione dell'OCR dopo l'iniezione FCCP afferma che gli HSPC LSK sono in grado di rispondere a una maggiore domanda di energia.
Insieme, l'obiettivo di questo protocollo era quello di fornire una serie di istruzioni chiare e concise per accompagnare tutorial basati su video su come misurare le funzioni metaboliche, come l'OCR e l'ECAR, degli HSPC. Con modifiche chiave e raccomandazioni aggiuntive per la raccolta di un maggior numero di HSPC LSK sani, che li rende aderenti alla superficie del pozzo, così come l'ottimizzazione del tempo di incubazione e la concentrazione di farmaci, questo protocollo empower analizzare la glicolisi e lo stato di respirazione mitocondriale degli HPG, nonché le cellule ematopoietiche non aderenti durante lo sviluppo del sangue e le malattie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è in parte supportato dal sostegno finanziatorio dei National Institutes of Health (HL131645, CA016058), dalla Fondazione St. Baldrick e dalla Pelotonia Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
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