Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.

Abstract

המטפאות בתאי הגזע (HSPCs) יש הפלסטיות המטבולית ברורים, אשר מאפשר להם מעבר מהמצב השקט שלהם למצב בידול כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. עם זאת, היה קשה לנתח את מצב חילוף החומרים (הנשמה מיטוכונדריאלי) של HSPCs בשל המספרים המוגבלים שלהם וחוסר פרוטוקולים ממוטבים עבור HSPCs שברירית, שברירי. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות למדוד נשימה מטבולית (שיעור צריכת החמצן; OCR) ו גליקוליזיס (שיעור חמצה מסחטות; ECAR) של מח עצם מורין-השושלתמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs. פרוטוקול זה מספק כמות גבוהה יותר של LSK HSPCs מ מח עצם murine, משפר את הכדאיות של HSPCs במהלך הדגירה, מאפשר ניתוח השטף החילוץ של שאינם חסיד HSPCs, ומספק פרוטוקולי הזרקה אופטימיזציה (ריכוז וזמן) עבור תרופות מיקוד זרחון חמצוני ומסלולים גליקוליטיות. שיטה זו מאפשרת חיזוי מעמד חילוף החומרים ובריאות HSPCs במהלך פיתוח דם ומחלות.

Introduction

כיוון שתוחלת החיים של כדוריות הדם הבוגרות ביותר קצרה, הומאוסטזיס של דם נשענת על התחדשות עצמית והבחנה של אוכלוסייה ארוכת חיים אך נדירה של תאי גזע המטקיים (HSPCs)1. HSPCs הם השקט, אבל הם מהירים להתרבות ולעבור בידול על הגירוי כדי לקיים את הדרישות של מערכת הדם. כמו כל מדינה סלולרית HSPC דורש דרישה bioenergetic ייחודית, שינויים מטבולית הם מנהלי מפתח של החלטות הגורל HSPC. לכן, אובדן הפלסטיות המטבולית, על ידי שינוי שיווי המשקל בין שקט, התחדשות עצמית, והבידול של HSPCs, לעתים קרובות מוביל הפרעות myelo או lympho ההתרבות. יחד, ההבנה של רגולציה המטבולית של הפיתוח hspc הוא קריטי לחשוף מנגנונים בבסיס ממאירות המטקולוגי2,3,4,5.

נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס מייצרים ATP כדי לנהוג בתגובות תאיים ולייצר את אבני הבניין הדרושות לסינתזה מקרומולקולה. מאז HSPCs יש מסה נמוכה מיטוכונדריאלי בהשוואה לתאים הבדיל6 והם מקיימים השקט בגומחות במח ארוי העצם, hspcs מסתמכים בעיקר על גליקוליזיס. ההפעלה של HSPCs משפר את חילוף החומרים היטוכונדריאלי שמוביל לאובדן השקט והכניסה הבאה שלהם לתוך מחזור התא. הפלסטיות המטבולית הזאת של hspcs מאפשר תחזוקה של בריכת hspc לאורך חיי מבוגרים6,7,8,9,10,11,12. לכן, זה קריטי לחקור את פעילויות חילוף החומרים שלהם, כגון שיעור צריכת החמצן (OCR; אינדקס של זירחון חמצוני) ואת שיעור חמצה מסירה (ECAR; אינדקס של גליקוליזיס) כדי לנתח את ההפעלה HSPC ואת מצב הבריאות. הן OCR ו-ECAR ניתן למדוד בו זמנית, בזמן אמת, באמצעות מנתח השטף החילוץ. עם זאת, השיטה הנוכחית דורשת מספר גדול של תאים וממוטבת עבור תאים מחסיד13. מאז HSPCs לא ניתן לבודד בכמויות גדולות מעכברים14, דורשים מיון כדי להשיג אוכלוסייה טהורה, הם תאים לא חסיד15, ואין אפשרות להיות מתורבת לילה מבלי להימנע בידול16, זה היה קשה למדוד את ה-OCR ואת ecar של hspcs. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות ללוות וידאו מבוססי הדרכות על איך למדוד נשימה מטבולית ו גליקוליזיס של כמה אלפי העצם מוריין מחמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הילדים ברחבי המדינה טיפול בבעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).

הערה: הפרוטוקול מתואר בסדר כרונולוגי המתפרס במשך יומיים. השתמש ריאגנטים טרי כפי שמתואר בפרוטוקול להלן.

1. הכנת ריאגנטים ביום שלפני השיטת הזמן

  1. . מימה את מחסנית החיישנים
    1. דגירה 5 מ ל של הכייל (לוח חומרים) ב2 37 מעלות צלזיוס בחממה במשך הלילה.
    2. פתח את ערכת שיטת השטף (טבלת חומרים) והפרד את מחסנית החיישן (ירוק; למעלה) מלוח כלי השירות (שקוף; למטה). הבא, למקם את מחסנית חיישן הפוך וצמוד לצלחת השירות.
    3. באמצעות מים סטריליים, למלא את הבארות של צלחת השירות (200 μL) ואת התאים סביב הבארות (400 μL).
    4. לטבול את מחסנית חיישן לתוך צלחת השירות וודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מים. ברז 3x כדי למנוע את היווצרות של בועות.
    5. מניחים את המחסנית מתחת לצלחת כלי השירות בחממה בלתי-משותפת של2 37 ° c. כדי למנוע אידוי של המים, ודא כי החממה מחולל כראוי. מניחים גביע פתוח המכיל את H2O כאמצעי זהירות נוסף ליד צלחת כלי הדיו, במיוחד אם משתמשים בתנור רגיל.
  2. . הכן את צלחת השיטת ההכנה
    1. לחטא את פני השטח של הקבינט אבטחה טיחות מחלקה 2 באמצעות 70% אתנול. . פתח את לוחית הכיסוי מתחת למכסה המנוע
    2. הוסף 40 μL של מסחרית זמין 0.01% (w/v) הפתרון פולי-L-ליזין (PLL) לכל הטוב של צלחת שיטת הנתונים מתחת למכסה המנוע.
    3. כסו את צלחת המערכת עם המכסה המסופק בערכה. מודקת את הלוחית הסגורה בטמפרטורת החדר (RT) מתחת למכסה המנוע במשך 1 h.
      הערה: המטרה של הדגירה היא לתת PLL לחלוק את פני השטח של צלחת השיטת כדי להקל על הדבקה של תאים ההשעיה על פני השטח של צלחת השיטת.
    4. לאחר 1 h הדגירה של צלחת השיטת, להסיר את הפתרון העודף עם מייבש ואקום סטרילי מבוסס ואוויר יבש היטב מתחת למכסה המנוע.
      הערה: זה לוקח ~ 30-60 דקות לאוויר יבש את הבארות של צלחת השיטה בעקבות הסרת PLL מוגזם באמצעות מייבש.

2. יום השיטת הזמן

  1. הכן את מיכל הדיו.
    1. הרם את מחסנית החיישן. מניחים אותו הפוך במכסה התרבותי של הרקמה ולהשליך את המים מן הצלחת כלי השירות.
    2. למלא את הצלחת השירות בארות עם 200 μL של טרום מחומם.
    3. ממלאים את התאים סביב הבארות עם 400 μL של כאשר.
    4. לטבול את מחסנית חיישן לתוך צלחת כלי השירות, וודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מכייל. ברז 3x כדי למנוע את היווצרות של בועות.
    5. באמצעות מחסנית חיישן מתחת לצלחת השירות בתוך מיכל שאינו CO2 37 ° c בחממה עבור 45-60 דקות.
  2. לקצור מח עצם ממורין.
    1. כדי להכיל מספר משכפל ביולוגי מספיק, תכנן להשתמש ב-HSPCs הנגזר מעכבר אחד לכל היותר בלוח השימוש.
      הערה: זו שיטת האיסוף מח עצם מספק ~ 50,000 ל80000 LSK HSPCs מכל עכבר. פרוטוקול זה כדי למדוד השטף החילוץ ממוטב עבור ~ 70,000 LSK HSPCs לכל טוב של 96 היטב צלחת.
    2. עכברים המתת חסד באמצעות שיתוף מנת יתר של2 ו צוואר הרחם, בעקבות שיטות IACUC מקומיות מאושרות.
    3. לחטא את פני השטח של כלים מבתר ואת הספסל באמצעות 70% אתנול.
    4. עבור כל עכבר, למלא מראש צלחת פטרי אחת עם מלוחים 1 x פוספט באגירה (PBS) המכיל 2% חום בלתי פעיל מופעל סרום העובר (FBS) ב RT.
      הערה: אין להשתמש ב-PBS מקורר כפי שהוא ייצור גושים בשלבים הבאים.
    5. תרסיס 70% אתנול (v/v) על העכבר כולו מורדמים. לבודד את כל העצמות, כולל גפיים העליון והתחתון, היפ עצמות, עצם החזה, צלעות, ושדרה, מהעכבר17,18. משוך החוצה חומר לבן מחוט השדרה של העכבר כפי שהוא יכול לזהם תאים LSK. הצב את כל העצמות ב-1x PBS (+ 2% FBS), כאשר הם נאספים, בצלחת פטרי עד לשימוש נוסף.
    6. היפוך צינור חרוט 50 mL (חדש בכל פעם) ולהשתמש בו כדי קצוצות עצמות שקוע ב-1x PBS (+ 2% fbs) בצלחת פטרי.
    7. באמצעות הצנרת 10 מ ל, פיפטה למעלה ולמטה (~ 10x) כדי לרוקן בצורה אחידה את התאים מעצמות, לאחר ריסוק עצמות.
    8. מניחים מסננת של תא 40 יקרומטר בשפופרת מלאה של 50 mL. טרום להרטיב את פני השטח של מסננת ידי העברת 1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS).
    9. מח עצם קציר-השעיית התא נגזר משלב 2.2.7 ולהעביר אותו דרך משטח רטוב מראש של מסננת התא כדי להסיר פסולת עצם.
    10. חזור על שלבים 2.2.6 דרך 2.2.9 עד כל חומרי העצם להפוך לבן כסמן כי רוב התאים מח עצם נאספים 50 mL חרוט.
      הערה: זה לעתים קרובות לוקח 2 50 mL שפופרות חרוט לכל העכבר כדי לאסוף את כל מח עצם נגזר התאים.
    11. צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות חרוטי המכילים מח עצם-תאים נגזר עבור 5 דקות ב 500 x g ו RT.
    12. . הסר את הסופרנטאנט להשעות את מח העצם-תאים נגזר (לשלב את התוכן של שניהם 50 mL) ב 5 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) כאמצעי אחסון סופי לשמור על תאים ב RT.
  3. . בסדר.
    1. הוסף 5 מ ל של צפיפות בינונית (כלומר, פיקדול) ל-15 מ"ל לצינור חרוט. ואז לאט להוסיף 5 מ ל של ההשעיה תא מח העצם. ודא שתאים נשארים כשכבה מעל למדיום מעבר הצבע של הדחיסות.
    2. צנטריפוגה עבור 30 דקות ב 500 x g ו RT. . אל תשתמש בבלם בצנטריפוגה ודא שצנטריפוגה נמצאת בהאצה הנמוכה ביותר האפשרית (לדוגמה, 1 האצה ו-0 האטה).
    3. לקצור את הממשק האמצעי של תאים מונונוכטיים (צבע לבן) לאחר צנטריפוגה לתוך צינור חדש 15 מ ל חרוט.
    4. לשטוף את התאים, שנקטפו מתוך צפיפות בינונית הדרגתי, עם 5 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . הסר את הסופרנטאנט
    5. חזור על שלב ה2.3.4.
    6. השהה מחדש את תוכן התא של הצינור ב-300 μL של 1x PBS (+ 2% FBS). מחבר 10 μL של השעיית תא עבור שליטה בלתי מוכתמת או צבע יחיד בצינור FACS.
  4. . מתאי מח עצם מורקיים
    1. הפוך קוקטייל של ביוטין-נוגדנים על-ידי ערבוב 3 μL לכל מדגם של הנוגדנים הבאים: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. הוסף 15 μL של קוקטייל הנוגדן biotin כדי 300 μL של תאים במח העצם מונונולי.
      הערה: כל נוגדן משמש ב1:100 דילול.
    2. מודלת תאים עם קוקטייל biotin-נוגדן במשך 30 דקות ב -4 ° צ' עם עצבנות כדי למנוע תאים בתחתית הצינור.
    3. הוסף 10 מ ל של מקורר 1 x PBS (+ 2% FBS) לתאים מעורבבים עם קוקטייל biotin-נוגדן.
    4. צנטריפוגה את הצינור עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-400 μL של 1x PBS (+ 2% FBS). מחלקים 10 μL עבור streptavidin-בקרת צבע אחת.
    5. בקצרה מערבולת נגד biotin מיקרוחרוזים (טבלת חומרים) לפני השימוש. הוסף 80 μL של מיקרוחרוזים לכל דגימת תא (של 400 μL). מערבבים היטב ומשלבים במשך 20 דקות נוספות ב -4 ° c, עם עצבנות.
    6. הוסף 10 מ"ל של מקורר 1 x PBS (+ 2% FBS) לתאים. צנטריפוגה את הצינור עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c.
    7. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). החנות ב -4 ° c בעת הגדרת יחידת הפרדה מגנטית.
    8. הצב עמודה (טבלה של חומרים) בשדה המגנטי של מפריד התא בסיוע מגנטי (מקינטוש) ב -4 ° c. הכן את הטור להפרדה מגנטית על ידי שטיפה עם 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) תחת זרם הכבידה ב 4 ° c.
    9. הוסף את ההשעיה של התא משלב 2.4.7 לעמודה שלפני הרטוב ב-4 ° c. הניחו לתאים לעבור דרך הטור ב-4 ° c ולאסוף קולחים בשפופרת חרוט של 15 מ ל.
      הערה: השבר עם תאים בלתי מסומנים בקולחים כגון זה מייצג את תאי השושלת המועשרת שליליים.
    10. שטוף עמודה עם 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) ב -4 ° c. חזור על 3x. לאסוף את הזרימה ולשמור אותו ב 4 ° c. לספור את התאים הקיימא על ידי טריקון כחול הדרה באמצעות הומוציטומטר.
    11. צנטריפוגה את הצינור החרוט 15 מ"ל המכיל את הזרימה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט השהה תאים מחדש ב-0.5 mL של 1x PBS (+ 2% FBS) והעבר את התוכן לשפופרת של FACS.
    12. הוסף 24 μL של קוקטייל הנוגדן LSK לכל 107 תאים. קוקטייל הנוגדן מכיל ריכוז שווה של 450-streptavidin נוגדן, PE-CY7-Sca1 נוגדן, ו-APC-c-Kit נוגדן.
    13. דגירה של 1 h ב 4 ° צ' עם עצבנות מתחת לחשיכה (מכוסה ברדיד פח).
    14. הוסף 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) לצינור FACS. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
    15. השעיה מחדש של תאים מתויג באמצעות נוגדן 1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). הוסף 1 μL של 1 מ"ג/mL propidium יודיד להשעיה התא ממש לפני מיון.
    16. מסנן תוכן של צינור facs באמצעות מסננת 40 יקרומטר ימינה לפני מיון תאים lsk.
    17. לאסוף תאים LSK, באמצעות מיון FACS, לתוך צינור 1.5 mL המכיל 0.5 mL של מדיה מלאה בתוספת של 2 מ"מ גלוטמין, 3 מ"ג/mL גלוקוז, 1 מ"מ פירובט, 1x הטרובטין (TPO), הגורם הראשון של תא גזע (SCF), 0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 7.4 pH

3. נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס אסאמר של LSK HSPCs

  1. לאחר זריעה של LSK
    1. התאים צנטריפוגה LSK משלב 2.4.17 עבור 5 דקות ב 500 x ו RT. לבטל את הסופרנטאנט.
    2. השהה את התאים מחדש במדיה מלאה לריכוז סופי של לפחות 70,000 תאים/40 μL.
    3. תוכן הזרעים של 40 μL מדיה (המכיל 70,000 תאים) בצלחת מצופה PLL 8-באר משלב 1.2.4. . השאר את כל הבארות הפינתיות ריקות
    4. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 450 x ו RT. . אל תחיל את הבלמים ודא כי תאים מחוברים לתחתית היטב באמצעות המיקרוסקופ הפוך.
    5. הוסף 135 μL של מדיה מלאה לתאים בכל באר עבור אמצעי אחסון סופי של 175 μL. הוסף 175 μL של מדיה מלאה לשתי פינות הלוחית כחללים ריקים.
    6. מודטת התאים בחממה שאינה CO2 עבור 2 h ב 37 ° c.
    7. הגדר תוכנית להוסיף תרופות לכל טוב של צלחת הבאר במנתח באמצעות מדד המתואר בטבלה 2 (מבחן מיטוכונדריאלי) ושולחן 3 (מבחן הלחץ של גליקוליזיס).
      הערה: בזמן שתאים מודלים, הפעל את המכשיר וודא שהוא נמצא ב-37 ° c.
  2. מבחן מצוקה מיטוכונדריאלי
    1. להכין 45 μM פתרונות מניות של oligomycin, 50 μM קרבקסיל ציאניד 4-(טריפלורנומטוקסיק) פנילהידרזיט (FCCP) ו -25 μM פתרונות מניות של rotenone/antimycin A. כדי להכין 45 μM oligomycin מניות פתרון, לפזר את התוכן של הנרתיק הזמין מסחרית ב 280 μL של המדיה המלאה. כדי להכין פתרון מניות 50 μM FCCP, לפזר את התוכן של הנרתיק הזמין מסחרית ב 288 μL של המדיה המלאה. כדי להכין 25 μM rotenone/antimycin פתרון מניות, לפזר את התוכן של הכיס הזמין מסחרית ב 216 μL של המדיה המלאה.
    2. קח את מחסנית חיישן בצלחת השירות מתוך החממה ולטעון את היציאות שלה (A, B, ו-C) כך שכל טוב יהיה ריכוז סופי של 2 μM oligomycin, 1.5 μM FCCP, ו 0.5 μM של rotenone/antimycin A לפי הצורך, בעקבות דילול מדדים המתוארים בטבלה 4 (עבור שיעור צריכת החמצן)
    3. הסר את המכסה מן המחסנית חיישן התאספו לוחית השירות ומניחים אותו על מגש המכשיר. הפעל את הכיול שייקח 20 דקות.
    4. לאחר הכיול, הסר את צלחת כלי השירות והחלף אותו בצלחת היישום המכילה תאי LSK, הנמצאים כעת בתחתית הבאר.
    5. לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית המתוארת בטבלה 2. לאחר סיום התוכנית, לאחזר את הנתונים ולנתח אותם באמצעות תוכנת שולחן העבודה Wave.
      הערה: הנתונים שנוצרו מתוך השטף מקבל מוסר ניתן להתוות באמצעות העלילה נקודה מתוכנת גל שולחן העבודה או מיוצא לתוכנית סטטיסטיקות מבוססות-אינטרנט.
  3. מבחן הדחק גליקוליזה
    1. מהווים גלוקוז ב 300 μL (100 mM), oligomycin ב 288 μL (50 μM), 2-D גלוקוז (2-DG) ב 300 μL (500 mM) של מדיה שלמה מתוך הנרתיק הזמין מסחרית.
    2. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה (~ 10x) כדי לפתרון התרכובות. מערבולת 2-DG בערך 1 דקות כדי להבטיח פירוק הנכון לתוך התקשורת.
    3. הסר את מחסנית החיישן מהאינקובטור. טעינת יציאות A עד C בעקבות דילול מדדים המתוארים בטבלה 5 כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"מ גלוקוז, 2 μm oligomycin, ו 50 mM 2-DG.
    4. חזור על שלבים ה3.2.3 וה3.2.4.
    5. לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית המתוארת בטבלה 3. לאחר סיום התוכנית, לאחזר את הנתונים ולנתח אותם באמצעות תוכנת שולחן העבודה Wave.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת החילוץ שלנו אפשרה לנו לקצור עד ~ 80,000 LSK HSPCs לכל עכבר. הכדאיות והמספרים של תאים LSK שופרו עם השיטה שלנו, כי אנחנו: (1) מח עצם משולב מגפיים העליון והתחתון, עצמות הירך, עצם החזה, צלעות כלוב, ועמוד השדרה, (2) נמנע באמצעות מאגר לפירוק התאים האדומים כי היה להגדיל את מוות התאים והשיא, ( השתמשו בצפיפות ההפרדה הבינונית של תאים מונו-נוקלאובטים, ו (4) נמנע באמצעות מאגר טרום מקורר שהיה גורם לאובדן תאים מעניינים במקבצים.

למרות ניתוח השטף מעמיק המשמש באופן מסורתי עבור תאים חסיד, השימוש שלנו ציפוי PLL של בארות, ואחריו צנטריפוגה של תאים על זה, הקלה הדבקות LSK HSPCs על פני השטח של הבאר. זה איפשר לנו למדוד את שטף החילוץ, ובכך בריאות מטבולית של LSK HSPCs. בהתחשב במספר מוגבל של תאים שניתן לקצור מעכבר ומשך זמן ארוך של הפרוטוקול עבור הבידוד שלהם, השימוש שלנו של מנתח עם שלה 8 הפורמט שלה התפתחה כפתרון חסכוני ביותר וישים (איור 1).

התאים משתמשים בגליקוליזיס ובנשימה מיטוכונדריאלי כדי לחדש את דרישות האנרגיה שלהם ולייצר intermediates הדרושים לשגשוג וצמיחה שלהם19. האנזים ההקאוקיאז ממיר גלוקוז ב גלוקוז-6-פוספט והופך לאחר מכן לפירובט20. פירובט ניתן לעבד לתוך לקטט והוא מיוצא מתא עם הפרוטונים21. ECAR מודדת את החמצה של אמצעי התקשורת ולכן היא מחוון של גליקוליזיס. פירובט יכול גם להיות מועבר לתוך המיטו, והפך בתוך מרחלי co A (CoA). אצטריל CoA נכנס למחזור TCA, אשר מספק intermediates אנרגיה לכונן את תנועות האלקטרונים של שרשרת התחבורה אלקטרון (וכו ') ויוצר מעבר פרוטונים בחלל מיטוכונדריאלי הבין-ממברנה22. חמצן מתפקד כקבלה אלקטרון הסופי, והפרוטונים לחזור למטריקס מיטוכונדריאלי דרך מורכבות ה-ATP בזמן יצירת ATP23. OCR מודד את צריכת החמצן, ולכן משמש לכמת את הנשימה מיטוכונדריאלי.

כדי לנתח את ה-OCR ואת ECAR בתנאים הבזליים והדגישו, השתמשנו בהזרקה רציפה של תרופות המפריעות לגליקוליזיס ולנשימה מיטוכונדריתית. השתמשנו גלוקוז ו 2-deoxyglucose (2-DG), הגלוקוז אנלוגי, כדי ליזום ולחסום גליקוליסיס בהתאמה24. השתמשנו Rotenone (מעכב I-ספציפי מורכבת של וכו '), antimycin A (מעכבי III ספציפי השלישי של וכו '), oligomycin (מעכבי של ATP סטנדרטים), ואת הסוכן הבלתי מצימוד פחמן ציאניד-4-(trifluoromethoxy) לחסום אירועים ספציפיים של וכו '25. אנו טיטרציה כאלה ריאגנטים כדי למצוא את הריכוז האופטימלי עבור lks hspcs (איור 2א, ב).

כדי לבצע את מבחן הלחץ גליקוליזיס, אנו מתורבתים HSPCs הסוכר במדיה משולל גלוקוז/פירובט (כפי שמומלץ על ידי היצרן), או גלוקוז/פירובט המכיל מדיה. כצפוי, מצאנו את הרמה הבזליים של ECAR היה גבוה יותר עבור LSK HSPCs תרבותי ב גלוקוז/פירובט + מדיה לעומת LSK HSPCs תרבותי ב גלוקוז/פירובט-מדיה. הזריקה הראשונה עם גלוקוז לא שינו את רמת הבסיס של ECAR עבור LSK HSPCs תרבותי ב גלוקוז/פירובט + מדיה בזמן שהוא שיפרה גליקוליזיס ב LSK HSPCs תרבותי ב גלוקוז/פירובט-מדיה. עם זאת, רמת הבסיס של ECAR, לאחר ההזרקה עם גלוקוז, נותרה נמוכה יותר בהשוואה לקבוצת הגלוקוז/הפירובט. הזריקה השנייה עם oligomycin, אשר יכול לחסום את הייצור של ATP דרך זרחון חמצוני, הפעיל את גליקוליזיס ברמה המקסימלית של LSK HSPCs ב גלוקוז/פירובט + מדיה, אבל זה לא השפיע על הגלוקוז/פירובט-קבוצה. הזריקה האחרונה עם הגלוקוז האנלוגי 2-DG החזיר את ECAR לרמה הלא גליקולטית שלה (איור 2ג).

עבור מבחן הלחץ מיטוכונדריאלי, אנו מדדו את הרמה הבזליים של OCR של LSK HSPCs ב גלוקוז/פירובט + מדיה. הראשון הזרקנו oligomycin כי בתחילה היפרקוטב קרום מיטוכונדריאלי, מנעו פרוטונים יותר שאיבה דרך מכלולי ETC וכו ', ובכך הפחיתה את שיעור הנשימה מיטוכונדריאלי. הזריקה השנייה של FCCP ionophores דחף ETC ו-OCR רמות המרבי שלהם כתאים ניסה לשחזר את הפוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי. הזריקה הסופית עם שניים אחרים של מעכבי ETC (antimycin A ו rotenone) גרם לעצירה מלאה של הנשימה מיטוכונדריאלי ובכך OCR להחזירה לרמה המינימלית שלה (איור 2ד).

Figure 1
איור 1: הסכמת הסכמה בידוד של שושלת היוחסין Sca1+c-Kit+ (lsk) בתאי גזעמצוי המטפאות ממוח עצם העכבר. מח עצם מופק מעצמות ותאים mon, ברורים (MNCs) מבודדים דרך צפיפות מעבר הדרגתי בינונית ההפרדה. לאחר מכן, תאים מודבטים עם שושלת היוחסין biotinylated+ נוגדנים ו streptavidin מעלה חרוזים מגנטיים כדיeluteשלילי השושלת שלילית (לין-) תאים בעקבות הפרדה מגנטית שלהם. לין- תאים מודדים לאחר מכן עם נוגדנים lsk ו-lsk תאים מבודדים על ידי מיון התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח השטף מתוך מSca1 של השושלת מורנהמינוס+c-Kit+ (lsk) בתאי גזע מצוי המטמין. (א, ב) תיאור מכונאי של תרופות מנוצל לניתוחי השטף במהלך גליקוליזיס ונשימה מיטוכונדריאלי. (ג) תוצאות מייצגות של גליקולזיס מבחן לחץ על מורטין Lsk HSPCs בנוכחות או העדר גלוקוז/פירובט בתקשורת. (ד) התוצאות המייצגות של מבחן מיטוכונדריאלי לחץ על מוריין Lsk HSPCs. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע (ש גויטיין) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לאי ריכוז סופי נפח עבור 30 מ ל
מדיה מלאה 28.691 מ ל
P/S 100x 0.5 x 150 מיקרומטר
ל-גלוטמין 200 ממ ' 2 ממ ' 300 מיקרומטר
פירובט 100 ממ ' 1 ממ ' 300 מיקרומטר
גלוקוז 1 מ/180.2 מ"ג/mL 3 מ"ג/mL 499.4 מיקרומטר
מבחן הטיה 100 μg/mL 100 ng/mL 30 μL
SCF 100 μg/mL 100 ng/mL 30 μL

טבלה 1: תוכן והכנת מדיה מלאה XF.

בזליים Oligomycin (2 μM) FCCP (1.5 μM) R/A (0.5 μM)
חזרה 3 פעמים 3 פעמים 3 פעמים 3 פעמים
ערבב 3 דקות 3 דקות 3 דקות 3 דקות
חכות 0 דקות 0 דקות 0 דקות 0 דקות
מדוד 4 דקות 4 דקות 4 דקות 4 דקות

שולחן 2: פרוטוקול הזרקה עבור מבחן הלחץ מיטוכונדריאלי.

בזליים גלוקוז (10 מ"מ) Oligomycin (2 μM) 2-DG (50 מ"מ)
חזרה 3 פעמים 3 פעמים 3 פעמים 3 פעמים
ערבב 3 דקות 3 דקות 3 דקות 3 דקות
חכות 0 דקות 0 דקות 0 דקות 0 דקות
מדוד 7 דקות 7 דקות 7 דקות 7 דקות

שולחן 3: פרוטוקול ההזרקה לבדיקת הלחץ של גליקוליזה.

נמל סמים ריכוז היטב סופי (μM) נפח פתרון מניות (μL) עוצמת מדיה (μL) פתרון יציאה (μM) אמצעי אחסון שנוסף ליציאה (μL)
פורט א Oligomycin 2 100 181.25 16 25
פורט ב FCCP 1.5 100 270.4 13.5 25
פורט סי רוטנאחד/antimycin A 0.5 60 240 מיכל 5 25

שולחן 4: מדדי דילול להשגת ריכוז מיטבי של סמים לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי בכל טוב של המנתח.

נמל סמים ריכוז הטוב הסופי נפח פתרון מניות (μL) עוצמת מדיה (μL) פתרון יציאה אמצעי אחסון שנוסף ליציאה (μL)
פורט א גלוקוז 10 ממ ' 300 75 80 ממ ' 25
פורט ב Oligomycin 2 מיקרומטר 108 192 18 μM 25
פורט סי 2-DG 50 ממ ' 300 0 500 ממ ' 25

שולחן 5: מדדי דילול להשגת ריכוז מיטבי של סמים לבדיקת מאמץ של גליקוליזיס בכל הנוגע למנתח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו להדגים את הבידוד של כמות מקסימלית של האוכלוסייה הטהורה מורצק LSK הקיימא, כמו גם את המדידה של גליקוליזיס שלהם ואת הנשימה מיטוכונדריאלי עם מנתח השטף של מסחטות. באופן ספציפי, הפרוטוקול גובר על הנושאים הטכניים הבאים לשימוש ב-LSK HSPCs: i) התדר הנמוך של LSK HSPCs במוח עצם מוריין14, ii) פעילות מטבולית נמוכה בסיס של Lsk hspcs26, iii) שבריאת lsk hspcs27, ו-IV) ללא הדבקות של lsk hspcs לכלי התרבות15. בנוסף, יש לנו אופטימיזציה של ריכוזי הסמים והרכב התקשורת עבור ביצועים מיטביים של השטף החילוץ מוסר.

מח עצם-HSPCs הנגזרים מתגוררים בנישה הארוי והם מציגים פנוטיפים לגליקולטיק, שהוא חיוני לשמירה על שקיקתם28. לעומת זאת, הנשימה חיונית עבור HSPC בידול6. כמו תפקוד מטבולי של HSPCs מוביל למחלות דם; כאן, תיארנו את הפרוטוקול ואת הדרכות מבוססות וידאו כדי למדוד את הסימנים של פונקציות מטבולית, כגון ה-OCR ו ECAR, עבור מח עצם murine-נגזר LSK HSPCs.

בניגוד המלצות היצרן עבור תאים חסיד, מצאנו כי התוצאות הבדיקה גליקוליזיס לחץ על LSK HSPCs הם אופטימליים כאשר התאים הם מתורבתים גלוקוז/פירובט + מדיה לעומת גלוקוז/פירובט-מדיה. הבנו כי היעדר גלוקוז בתקשורת עבור LSK HSPCs התוצאות מוות התאים במהלך התקופה ~ 2 h שיעור השיעור בחממה שאינה CO2 . כמו הזרקת הגלוקוז לא לשנות את רמת הבסיס של ecar עבור lsk hspcs תרבותי ב גלוקוז/פירובט + מדיה, השינוי שלנו בפרוטוקול לא רק שומר את המהות של מבחן הלחץ גליקוליטיק, אבל זה גם מאפשר לנו להבחין בין גליקוליזיס בסיס (לפני כל הזריקות), הקיבולת גליקולטיק (לאחר oligomycin הזרקה) ו שאינם גליקוליטיק חמצה (לאחר הזרקה עם 2-DG) של lsk h

מבחן הלחץ היטוכונדריאלי של LSK HSPCs הראה כי ATP המיוצר על ידי זרחון חמצוני ב-LSK HSPCs הוא מינימלי כפי שנראה עם ירידה קטנה ב-OCR לאחר הזרקת oligomycin. לעומת זאת, העלאת התווים ב-OCR על הזרקת ה-FCCP מאשרת כי LSK HSPCs מסוגלים להגיב לדרישת אנרגיה גבוהה יותר.

יחד, המטרה של פרוטוקול זה היתה לספק ערכה של הוראות ברורות ותמציתי ללוות הדרכות המבוססות על וידאו על איך למדוד את פונקציות חילוף החומרים, כגון ה-OCR ו-ECAR, של HSPCs. עם שינויים מרכזיים והמלצות נוספות עבור קצירת מספר גבוה יותר של LSK בריא HSPCs, מה שהופך אותם חסיד על פני השטח של הבאר, כמו גם אופטימיזציה של זמן דגירה ריכוז התרופה, פרוטוקול זה יהיה להעצים חוקרים לניתוח גליקוליזה ומצב נשימה מיטוכונדריאלי של HSPCs, כמו גם תאים לא מחסיד המטפאות במהלך התפתחות הדם ומחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו מהווה חלק בתמיכת המימון של המכון הלאומי לבריאות (HL131645, CA016058), קרן סנט בלדריק וקרן פליטוניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 153 בתאי גזע המטוקיים חילוף החומרים נשימה מיטוכונדריאלי גליקוליזיס ניתוח השטף של מסחטות תאים לא מחסיד
ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scapin, G., Goulard, M. C.,… More

Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter