Summary
该协议引入了一种光点测定，以调查果蝇幼虫光法行为。在此测定中，光点产生为光刺激，而幼虫避光过程由红外光成像系统记录。
Abstract
在觅食阶段，果蝇的幼虫表现出明显的避光行为。果蝇幼虫光毒可作为研究动物回避行为的模型。该协议引入了一种光点测定，以研究幼虫光法行为。实验装置包括两个主要部分：产生光斑的视觉刺激系统，以及记录幼虫避光过程的红外光成像系统。这种测定允许跟踪幼虫在进入之前、遇到期间和离开光斑后的行为。可以使用此方法捕获和分析幼虫运动的细节，包括减速、暂停、头部铸造和车削。
Introduction
在觅食阶段，果蝇的幼虫表现出明显的避光行为。果蝇幼虫照片一直在调查，特别是在过去50年1，2，3，4，5，6，7 ，8.近年来，尽管事实上1）许多神经元调解幼虫光避免已被确定4，5，9，10，11，122）在突触的分辨率下，幼虫视觉系统的完整连接体已经建立13个，幼虫光突厥背后的神经机制基本仍不清楚。
在研究幼虫光轴时，已经使用了一些行为测定。它们大致可以分为两类：一类涉及空间光梯度，另一类涉及时光梯度。对于空间光梯度测定，竞技场在光明和黑暗中被分成相等数量的截面。竞技场可以分为光明和黑暗两部分2，4或光明和暗象限14，15，甚至可以分为交替的光明和黑暗方块，如棋盘7。通常，琼脂板用于空间光梯度测定，但被分为交替光和暗部分的管子也可以使用10，14。
在旧版本的测定中，光照通常源自幼虫的下方。然而，较新版本的照明主要来自上述，因为幼虫眼（例如，对低或中光强度16敏感的Bolwig器官）包含在不透明的头足骨骨架中，其开口朝向上前。这使得幼虫对来自上前方向的光比从方向7后面的下方对光更敏感。对于时光梯度测定，竞技场中的光强度在空间上是均匀的，但强度会随时间而变化。除了时态方波光（即闪烁开/关或强/弱光3，7），与线性强度斜带一致的时态变化光也使用8测量幼虫对时间变化的光刺激。
第三种类型的光射器测定是定向光景导航，它涉及从上面以45°7的角度进行照明。在Kane等人7号工作之前，在幼虫光刻测定中只计算了幼虫在光和暗区域的数量、转弯频率和足迹长度等粗糙参数。由于同一组的工作，通过分析幼虫光片的高时态分辨率视频记录，在光刻过程中幼虫运动的详细动态（即幼虫身体不同部位的瞬间速度、方向、转弯角度和相应的角速度）已被分析7。因此，已经能够发现更多的幼虫光轴行为的细节。在这些测定中，幼虫在组内测试，因此不排除组效应。
该协议引入了一种光点测定，用于研究幼虫对个体光刺激的行为反应。主要实验装置由视觉刺激系统和红外光成像系统组成。在视觉刺激系统中，LED光源在琼脂板上产生一个直径为2厘米的圆形光点，对幼虫进行测试。可以使用 LED 驱动器调整光照强度。成像系统包括一个红外摄像机，除了三个为摄像机提供照明的 850 nm 红外 LED 外，还可捕获幼虫的行为。相机镜头由 850 nm 带通滤镜覆盖，以阻止视觉刺激系统的光线进入摄像机，同时允许红外光进入摄像机。因此，视觉刺激对成像的干扰是可以避免的。在本次测定中，记录和分析进入光之前、期间和之后的一段时间内个体幼虫快速反应的行为细节。
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Protocol
1.果蝇幼虫的制备
- 准备标准介质，包括煮玉米粉（73克）、琼脂（5.6克）、大豆粉（10克）、酵母（17.3克）、糖浆（76 mL）和水（1000 mL）。
- 在12小时/12小时光/暗循环的房间里，在标准介质上以25°C升起所有苍蝇。
2. 准备琼脂板
- 准备 1.0% 琼脂溶液。在500 mL的烧杯中称量3克琼脂，并加入300 mL的蒸馏水。在断路器上放置箔纸，以防止水蒸发。在微波炉中加热烧杯煮沸。
- 拿出烧杯，用玻璃棒搅拌，然后在微波炉中加热煮沸。重复，直到液体完全透明和液体。
注：最终的热琼脂溶液应无气泡;否则，将琼脂倒入板中将导致琼脂板表面不均匀和凹陷，从而影响后续幼虫行为测试。琼脂溶液的浓度不应过高或过低。如果浓度过高，琼脂板上的光漫反射将强，并涂抹光/暗边界。如果浓度过低，幼虫将在盘子上留下痕迹。这两个错误都会妨碍后期在 protcol 中进行视频处理。 - 缓慢地将热琼脂溶液倒入培养皿（直径为 15 厘米），直到底部均匀地覆盖一层琼脂（厚度约 4 mm），并在室温 （RT） 下冷却，直到琼脂溶液凝固。
- 刚准备好的Agar板应使用。如果不是，将一层水倒在表面上，以4°C将其储存在冰箱中，供以后使用。
3. 视觉刺激系统的设置
- 选择 LED 光源：470 nm 或暖白光处的准直 LED 蓝光。
注：光源可以替换为任何其他波长的 LED 灯。在本实验中，以蓝光 LED 为例。 - 卷一块厚厚的铝箔或黑色纸板（确保不公开），形成一个12厘米长的开筒，直径类似于直径为3厘米的蓝光LED。让气缸的顶端覆盖蓝光 LED 的前端。用黑色纸板覆盖底端，中间有一个小圆孔（直径0.5厘米）。这构成了光源系统的设置。
- 用夹子将准备好的光源固定到铁架上，确保 LED 指示灯向下投射到桌面上。稍微倾斜气缸。圆柱面和垂直平面之间的角度约为 10°（见图1）。将 470 nm 蓝色 LED 指示灯连接到大功率 LED 驱动器的"LED1"插头。打开驱动器，转动驾驶员右上角的旋钮以选择通道470 nm，然后单击"LED"。然后，当屏幕显示"+"时，桌面上将显示一个蓝色光点。
注：如果气缸除小圆孔外漏光，建议在泄漏部件上使用黑色胶带，以确保只有孔才能通过光。 - 单击"确定"并转动旋钮以调整光的强度。将旋钮旋转到 50 mA 的较高光强。使用光谱仪测量和记录光谱。
- 上下移动光源的位置，将光斑的直径调整到 2 厘米。桌面应为黑色，以产生更好的对比度效果。
- 旋转旋钮，根据实验需要选择光强。使用带有标准光电二极管功率传感器的紧凑型功率计控制台，测量现场最大和最小光功率，记录、测量三次，并获取平均值。
注： 建议使用光电二极管功率传感器测量特定波长的光的光强度，并使用热功率传感器测量白光的光强度。 - 通过将测得的光功率除以传感器区域来计算光斑中的光强度。
注：例如，如果步骤 2.6 中测量的光功率为 20 pW，并且传感器的面积为 0.81 mm2，则光强度为 24.69 pW/mm2（除以 20 pW x 0.81 mm2）。
4. 成像系统的设置
- 用铁夹夹住高分辨率网络摄像机，在桌面上光点上方约 10 厘米处（图1）。
- 调整相机镜头朝向桌面的方向。通过 USB 接口将相机连接到计算机。
- 将琼脂板放在相机正下方的桌面上。
- 打开带有 Windows 7 的计算机上的"Amcap9.22"软件，光点将自动显示在 Amcap 窗口中。稍微向左或向右移动相机，以确保光点靠近窗口中心。确保摄像机不会阻止光路。光斑应该是完整和圆的。
注：可在http://amcap.en.softonic.com/找到该软件。 - 修复了 850 nm × 3 nm 带通滤波器，其夹子位于摄像机正下方 5-7 mm 处。
注：滤镜直径约2.5厘米，相机镜头直径小于1厘米，因此滤镜可以覆盖相机的视觉场。在摄像机下方的滤光片中，不应在 AMcap 窗口中看到光斑。 - 在琼脂板周围均匀放置三个红外发光 LED（中心波长 = 850 nm）。每个 LED 应远离琼脂板的边缘约 5 厘米，并且 LED 的镜头面应朝向琼脂板的 70° 向下角度。通过交流到直流转换器将 LED 连接到电源。
注：最好固定红外光 LED 的位置和角度，以确保在各种实验试验中场亮度的一致性，并便于以后进行视频处理。 - 在计算机和设备之间放置一块黑板。设置计算机屏幕的亮度，以防止计算机屏幕光线影响实验。
注：测量光的波长或强度时，保持环境黑暗。
5. 设置成像参数
- 在 AMcap 软件的菜单上，选择"选项|视频设备|捕获格式，并将捕获的视频的像素大小设置为 800 x 600，帧速率设置为 60 fps。
- 从摄像机下方移除滤镜，在摄像机下方放置一个标尺，并调整摄像机对焦，以使比例线清晰且与视频视场的宽度平行。
- 单击"捕获|设置|视频捕获选择保存路径，单击"开始录制"，记录与 600 像素相对应的实际距离，并计算每个像素与实际距离的比率。
6. 光避光行为的视频录制
- 通过所有实验保持25.5°C的温度。如果需要，使用空调控制室温。使用加湿器将湿度始终保持在 60%。
- 拍摄名为"光area1"的光斑位置的简短视频。然后，将 850 nm × 3 nm 滤光片移回以覆盖相机镜头。
注： 记录幼虫行为时，相机镜头被 850 nm × 3 nm 滤光片覆盖，因此视频中不会显示光斑。光斑可以在视频与幼虫稍后与Matlab重建。请勿更改摄像机的位置，并避免更改每个像素与步骤 4.3 中测量的实际距离的比率。 - 打开远离实验设备的灯（即房间灯）。尽可能低地调低光线，只要用眼睛能清楚地看到幼虫。用勺子将幼虫从培养基中取出来，轻轻挑选第三星幼虫，用蒸馏水清洗干净。小心一次洗一个幼虫，以避免饥饿的干扰。单个实验至少需要20个幼虫。
- 在步骤 3.3 期间将幼虫转移到摄像机下方的琼脂板的中心。用刷子轻轻去除幼虫中的多余水，或使用印迹纸去除幼虫中的水，以防止镜头下光线反射。关闭房间灯，让幼虫在黑暗环境中适应2分钟。
- 打开 LED 灯以产生红外光，然后轻轻地将幼虫刷到板的中心。当幼虫开始爬行直，旋转板，使幼虫头朝光点。确保它从一开始就直接爬网，否则可能无法访问光点。
- 单击"捕获|设置|视频捕获以选择保存路径，然后单击"开始录制"进行录制。让幼虫向光斑爬行，进入光斑，然后离开光斑，直到它接近视野。单击"停止录制"。如果幼虫在接近之前偏离光点，请直接单击"停止录制"。
- 将滤镜移离相机。拍摄名为"光区域2"的光斑位置的简短视频，并将其与"光区1"进行比较，以确保光斑位置不发生变化。如果观察到明显的位置变化，请丢弃数据。
7. 数据分析
- 使用SOS17提取动物身体的轮廓和运动参数从视频使用图像处理方法，如前面描述17。
注：使用头速（幼虫头速度）、尾部速度（幼尾速度）、中速（骨架线幼虫中点速度）和厘米速度（幼虫质心速）等参数测量幼虫运动速度。包括头头图（头中点和中点尾线之间的角度）和头欧米茄（头的改变速度）用于测量幼虫体弯曲和弯曲的角速。
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Representative Results
根据该协议，光斑测定用于研究在12小时/12小时光/暗循环室中标准介质上以25°C升起的第三星幼虫的光避光行为。在25.5°C下使用光斑测定对单个w1118幼虫进行了测试。460 nm LED 产生的光斑的平均光照强度为 0.59 μW/cm2。使用SOS软件和自定义编写的脚本12、17记录和分析幼虫进入和离开光点的整个过程。图2和影片1显示了代表性幼虫尾部速度、体弯曲角和体弯曲角速度的时间曲线。
为了研究八角胺能神经元对幼虫避光的影响，用光点测定测试了第三个与八角胺能神经元通过表达破伤风毒素（UAS-TNTG）抑制的八角胺神经元（UAS-TNTG）。这一点测定。 如图3所示，与家长控制相比，幼虫头铸造（最大体弯曲角）的大小显著减小，这表明Tdc2-Gal4神经元对于正常的幼虫光反应是必要的。
图1：实验设置。（A） 基于光斑的幼虫快速光轴测定的设置的原理表示。蓝线表示用作视觉刺激的可见光路径，红线表示红外光的路径。箭头指示光的方向。850 nm 带通滤波器允许红外光通过，但它阻挡可见光。（B） 光斑测定设置的图像。需要注意的是，图像是在光线条件下拍摄的，以便更好地进行可视化。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：进入光斑时幼虫反应的定量描述。（A） 显示用于测量幼虫体运动参数的图表.幼虫的轮廓以细线显示。粗线显示薄幼虫体轮廓的骨架。骨架线的两端和中点被指定为幼虫头、中点和尾部的位置。从头到中点线和中点到尾线之间的角度是主体弯曲角度。随着时间的推移，车身弯曲角度的变化速度被定义为幼虫头铸造的角速度。这里代表的是尾速（B，尾部速度），头铸造角速度（C，头膜），和身体弯曲角（D，头）的w1118幼虫进入和离开一个光斑。绿线标记幼虫头进入并离开光斑的时间点。强减速周期的时间窗口为黄色。箭头头指向减速周期和相关峰在头部铸造角速度和身体弯曲角。行为过程如电影1所示。这个数字已由公12等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：使用破伤风毒素TNTG抑制Tdc2-Gal4标记神经元，减少幼虫头铸造的大小，以响应光斑入口。*， P < 0.01， n = 81， 52， 92;克鲁斯卡尔-瓦利斯测试，然后后临时邓恩的多重比较测试被使用。这个数字已由公12等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
电影1：w 1118幼虫进入，并在光斑测定中留下一个光斑。边缘平滑的光斑为白色。显示了幼虫头的轨迹。同时播放幼虫尾速、头速和头盖的相应曲线。这部电影已由公公等人修改。请点击此处观看此视频。（右键单击下载。
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Discussion
该协议提出了光斑测定，以测试果蝇幼虫从光中逸出的能力。这种测定允许跟踪幼虫在进入之前、遇到期间和离开光斑后的行为。可以捕获和分析幼虫运动的细节。光斑测定非常简单，具有很强的实用性。整个设备的成本不高。在实验中，LED灯被用作光源。如果需要，可以替换为不同波长的光源。光照强度也可以由 LED 驱动器调整。现场最低光照强度可达1.80 pW/mm2（冷白光）。即使在如此低的光照强度下，幼虫仍然能够感知光，并表现出避光行为11。
需要注意的是，琼脂板的浓度控制在0.8%至1.0%之间。如果浓度过高，琼脂板上的光散射可能很严重，视频中识别的光斑大小被夸大了。因此，点的亮度不应过高。由于光斑中的幼虫几乎不可见，如果使用可见光进行照明，则有必要使用红外光来照亮幼虫，并在相机上添加 850 nm 带通滤波器，以防止光斑信号进入摄像机。幼虫对光斑的反应视频可以稍后根据幼虫和光斑视频合成。
光斑测定具有三大优点：1）可以对幼虫避光过程进行详细监测和分析;2） 幼虫光反应只测试一次，因此可以排除可能参与的光适应;3）可以排除其他幼虫对光反应的可能影响。这种测定的一个明显缺点是，它的低通量，因为一次只测试一个幼虫。虽然这种测定主要在光11、12的低强度下使用，但它也可以应用于强光中的幼虫避免，可以激发4级DA神经元，使身体壁表面的瓷砖16。
我们的实验设备也可用于光遗传学。850 nm 带通滤波器可以阻止激发光，就像光斑信号一样，以便摄像机可以清楚地记录红光刺激之前、期间和之后的幼虫行为。具体来说，当620nm红光与Chrimson结合使用进行光遗传学刺激时，红外光LED的低半部分需要被遮盖，红光的方向应受到很好的控制，以清楚地成像幼虫。同时，图像中来自红灯的中等噪声信号水平可用于判断开/关刺激的时间。简而言之，光斑测定提供了一种附加方法，用于监测和分析快速幼虫光避免行为的详细空间和时间特性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国自然科学基金（31671074）和浙江省高校基础研究基金（2019XZZX003-12）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
References
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