Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lyddæmpnings spark: CRISPR/Cas9 Genome redigering i svagt elektrisk fisk

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60253
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Summary

Her præsenteres en protokol for at producere og bageste crispr/Cas9 genom knockout elektrisk fisk. Detaljeret beskrevet er de nødvendige molekylær biologi, avl og opdræts krav for både en gymnotiform og en mormyrid, og injektion teknikker til at producere Cas9-induceret Indel F0 larver.

Abstract

Electroreception og electrogenesis har ændret sig i den evolutionære historie af hvirveldyr. Der er en slående grad af konvergens i disse selvstændigt afledte fænotyper, som deler en fælles genetisk arkitektur. Dette er måske bedst eksemplificeret ved de talrige konvergerende funktioner i gymnotiforms og mormyrids, to artsrige teleost clader, der producerer og detekterer svage elektriske felter og kaldes svagt elektriske fisk. I 50 år siden opdagelsen af, at svagt elektriske fisk bruger elektricitet til at fornemme deres omgivelser og kommunikere, et voksende samfund af videnskabsfolk har fået enorm indsigt i udviklingen af udvikling, systemer og kredsløb neurovidenskab, cellulære fysiologi, økologi, evolutionær biologi, og opførsel. For nylig har der været en spredning af genomressourcerne til elektriske fisk. Brugen af disse ressourcer har allerede lettet vigtig indsigt med hensyn til forbindelsen mellem genotype og fænotype hos disse arter. En væsentlig hindring for at integrere genomforskning-data med fænotypiske data om svagt elektriske fisk er en nuværende mangel på funktionelle genomforskning-værktøjer. Vi rapporterer her en fuld protokol for at udføre CRISPR/Cas9 mutagenese, der udnytter endogene DNA reparationsmekanismer i svagt elektriske fisk. Vi viser, at denne protokol er lige så effektiv i både mormyrid-arterne Brienomyrus brachyistius og gymnotiformen Brachyhypopomus gauderio ved at bruge crispr/Cas9 til at målrette indels og punktmutationer i den første exon af natrium kanalen gen scn4aa. Ved hjælp af denne protokol blev embryoner fra begge arter fremstillet og Geno skrevet for at bekræfte, at de forventede mutationer i den første exon af natrium kanalen scn4aa var til stede. Knock-out succes fænotype blev bekræftet med optagelser viser reduceret elektrisk organ udledning amplituder sammenlignet med uinjiceret størrelse-matchede kontrol.

Introduction

Electroreception og electrogenesis har ændret sig i den evolutionære historie af hvirveldyr. To nedstamningens af teleost fisk, osteoglossiformes og Siluriformes, udviklet electroreception parallelt, og fem nedstamningens af teleoster (gymnotiformes, mormyrids, og slof astroscopus, malapterurus, og Synodontis) udviklet electrogenesis parallelt. Der er en slående grad af konvergens i disse selvstændigt afledte fænotyper, som deler en fælles genetisk arkitektur1,2,3.

Dette er måske bedst eksemplificeret ved de talrige konvergerende funktioner i gymnotiforms og mormyrids, to artsrige teleost clades, som producerer og detekterer svage elektriske felter og kaldes svagt elektriske fisk. I 50 år siden opdagelsen af, at svagt elektriske fisk bruger elektricitet til at fornemme deres omgivelser og kommunikere4, et voksende samfund af videnskabsfolk har fået enorm indsigt i udviklingen af udviklingen1,5 ,6, systemer og kredsløb neurovidenskab7,8,9,10, cellulære fysiologi11,12, økologi og energetics13 ,14,15,16,17, opførsel18,19og makroevolution3,20,21 .

For nylig har der været en spredning af genomisk, transkriptomic og proteomiske ressourcer til elektriske fisk1,22,23,24,25,26, 27,28. Brugen af disse ressourcer har allerede givet vigtig indsigt i forbindelsen mellem genotype og fænotype i disse arter1,2,3,28,29 ,30. En væsentlig hindring for at integrere genomforskning-data med fænotypiske data om svagt elektriske fisk er en nuværende mangel på funktionelle genomforskning-værktøjer31.

Et sådant værktøj er den nyligt udviklede klynge regelmæssigt interspaced korte palindromic gentagelser parret med Cas9 endonuklease (crispr/Cas9, crispr) teknik. Crispr/Cas9 er et genomredigerings værktøj, der er blevet udbredt i både model32,33,34 og ikke-modelorganismer35,36,37 ens. CRISPR/Cas9-teknologien har udviklet sig til et punkt, hvor et laboratorium, der er i stand til at grundlæggende molekylær biologi, nemt kan generere gen-specifikke sonder kaldet Short guide RNAs (sgRNAs) til en lav pris ved hjælp af en ikke-klonings metode38. Crispr har fordele i forhold til andre knockout/Knockdown strategier, såsom morpholinos39,40, transskription aktivator-lignende Effector nucleaser (talens), og zink finger nucleaser (zfns), som er dyre og tidskrævende at generere for hvert målgen.

CRISPR/Cas9-systemet fungerer til at skabe genudskæringer ved at målrette mod et bestemt område af genomet, instrueret af sgRNA-sekvensen, og forårsage en dobbeltstrenget pause. Den dobbeltstrengede pause detekteres af cellen og udløser endogene DNA-reparationsmekanismer fortrinsvis ved hjælp af NHEJ-vejen (non-homologous end-forbindelse). Denne vej er meget fejlbehæftet: under reparationsprocessen vil DNA-molekylet ofte indeholde indsættelser eller sletninger på det dobbelt strandede Break site. Disse indeler kan resultere i tab af funktion på grund af enten (1) Skift i den åbne læse ramme, (2) indsættelse af en tidlig stop codon, eller (3) forskydninger i den kritiske primære struktur af genproduktet. I denne protokol udnytter vi CRISPR/Cas9 editing til at målrette punktmutationer i målgener ved hjælp af NHEJ i svagt elektriske fiskearter. Selv om denne mutagenicese metode er enklere og mere effektiv end andre teknikker, forventes den at resultere i en række fænotypiske severiteter i F0, som tilskrives genetisk mosaik41,42,43 ,44.

Udvælgelse af organismer
Med henblik på at lette fremtidige undersøgelser af den sammenlignende genomforskning i svagt elfisk er der behov for at udvalgte en repræsentativ dyreart for både gymnotiforme og mormyrier til protokol udvikling. Efter drøftelserne under 2016 Electric Fish-mødet i Montevideo i Uruguay var der enighed i Fællesskabet om at anvende arter, der allerede kunne opdrættes i laboratoriet, og som havde genøkonomiske ressourcer til rådighed. Gymnotiformen Brachyhypopomus gauderio og mormyrid Brienomyrus brachyistius blev udvalgt som arter, der passede til disse kriterier. I begge arter er naturlige signaler til at fremkalde og vedligeholde avlsforhold let at efterligne i fangenskab. B. gauderio, en nøgterne arter fra Sydamerika, har den fordel, at lave opdræts krav: fisk kan holdes på relativt høj tæthed i relativt små (4 L) tanke. B. gauderio har også en hurtig generations omsætning under bundne forhold. Under laboratorieforhold kan B. gauderio udvikle sig fra æg til voksen i ca. 4 måneder.

B. brachyistius, en art af mormyrid fisk fra vest-central Afrika, racer let i fangenskab. B. brachyistius er let tilgængelig gennem akvariet handel, har været meget udbredt i mange undersøgelser, og nu har en række genøkonomiske ressourcer til rådighed. Deres livscyklus strækker sig over 1 − 3 år afhængigt af laboratorieforholdene. Opdræts kravene er noget mere intensive for denne art, der kræver moderat store tanke (50 − 100 L) på grund af deres aggression under avl.

Laboratorier, der studerer andre arter af elektriske fisk, bør let kunne tilpasse denne protokol, så længe arterne kan opdrættes, og enkelt celle embryoner kan opsamles og opdrættes til voksenalderen. Boliger, larve opdræt og in vitro fertilisering (IVF) satser vil sandsynligvis ændre sig med andre arter; denne protokol kan dog bruges som udgangspunkt for Avlsforsøg i andre svagt elektriske fisk.

Et ideelt Genmål for bevis for koncept: scn4aa
Svagt elektrisk mormyrid og gymnotiform fisk genererer elektriske felter (electrogenesis) ved at aflade et specialiseret organ, kaldet el-orgel. Elektriske organ udledninger (EODs) skyldes samtidig fremstilling af aktionspotentialer i de elektriske organ celler kaldet elektro cytter. EODs detekteres af en række elektroreceptorer i huden for at skabe elektriske billeder i høj opløsning af fiskens omgivelser45. Svagt elektriske fisk er også i stand til at afsløre funktioner i deres konspecificitet ' EOD bølgeformer18 samt deres udledning satser46, tillader EODS at fungere yderligere som et socialt kommunikations signal analogt med fuglesang eller frø vokaliseringer47.

En hovedkomponent i action potentiel generation i elektro cytterne af både mormyrid og gymnotiform svagt elektriske fisk er den spændings-gated natrium kanal NaV 1.42. Ikke-elektriske teleoster udtrykker to paralogous genkopier, scn4aa og scn4ab, som koder for den spændings-gated natrium kanal NAV 1.430. I både gymnotiform og mormyrid svagt elektrisk fisk lineages, scn4aa har udviklet sig hurtigt og undergået talrige aminosyre substitutioner, der påvirker dens kinetiske egenskaber48. Vigtigst er, scn4aa er blevet opdelt i begge nedstamningens til elorgel2,3. Det relativt begrænsede udtryk for scn4aa til det elektriske orgel, samt dets nøglerolle i genereringen af EODS, gør det til et ideelt mål for crispr/Cas9 knockout eksperimenter, da det har minimal skadelige pleiotropic effekter. Fordi svagt elektriske fisk begynder at aflade deres larve elektriske organer 6 − 8 dage efter befrugtning (DPF), målretning af scn4aa er ideelt egnet til hurtig fænotypebestemmelse efter embryo mikroinjektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Michigan State University.

1. valg af sgRNA-mål

Bemærk: Der findes en protokol til manuel design af sgRNAs i trin 1,1. Dette blev udnyttet til scn4aa Target udvælgelse. Der gives en tillægsprotokol for at lette denne proces (trin 1,2) ved hjælp af webportalen EFISHGENOMICS. Det tilrådes, at brugerne vælger protokol 1,2, som indeholder flere automatiserede ' checks ' for at sikre succes med at designe sgRNAs til brugerdefinerede mål.

  1. Design sgRNA mål.
    1. For at generere sgRNA guide oligos, er det bedst at målrette exon 1, eller andre 5 ' exons. Den 5 ' UTR kan målrettes; men det er bedst at målrette 5 ' kodning sekvens. Det er at foretrække at udnytte genomisk information, men det er muligt at udvikle succesfulde sgRNAs ved hjælp af transkriptomdata. Anmærkninger af intron/exon grænser (genomdata) eller exon/exon grænser er at foretrække.
    2. Kandidat genomiske sekvenser fra 1,1 søges efter formodede målsekvenser, der matcher mønsteret 5 '-N (18)-NGG-3 '. Dette kan automatisk udføres ved hjælp af desktop Sekvensanalyse software, brugerdefinerede scripts, eller gennem manuel inspektion af sekvenser.
    3. Sekvenser kan prioriteres ved hjælp af metoden Doench et al.49 for on-Target aktivitet. Derudover kan målsekvenser evalueres ved en BLAST søgning mod genomisk/transcriptomic databaser for off-Target binding.
    4. Sørg for, at der kan genereres standard PCR-primere, der flankerer målsekvensen. Primere skal være mindst 20 BP fra hver side af det afskårne sted (tre baser opstrøms for NGG-sekvensen). Ideelt set skal PCR-produktet være 150 − 200 basepar (BP).
    5. Design oligomerer, der opfylder ovenstående kriterier ved hjælp af nedenstående skabelon, som omfatter en T7 Promoter (5 ' af N18) og en komplementær region (3 ' af n18) for udglødning til den konstante oligomer (1.1.6): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG-n18 -Gttttagagctagaaatagcaag-3 '
      Bemærk: N18 sekvensen omfatter ikke NGG protospacer tilstødende Motif (PAM) sekvens. Medtag ikke dette i oligomer.
    6. For den konstante oligomer (tabel 1), der vil blive anvendt til at syntetisere alle sgrnas, oligomerer for sgrna-mål (trin 1.1.5) og PCR-primere (trin 1.1.4) som standard afsaltede oligomerer fra en oligonukleotid-produktions tjeneste. Oligomerer og PCR-primere kan bestilles som standard afaltede oligomerer, ingen yderligere rensning er nødvendig.
  2. Udfør automatiseret design af sgRNA-mål.
    1. Ved hjælp af genomdata skal du vælge et målgen. Transkriptomdata kunne anvendes i stedet, når exon/intron grænser er kendt. Mål kan identificeres ved hjælp af EFISHGENOMICS-portalen (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). Det ideelle mål vil være inden for exon 1; Men, andre 5 ' exons og 5 ' UTR kan overvejes.
    2. Når målsekvensen er identificeret, kan du indlæse det frit tilgængelige EFISHGENOMICS CRISPR-webværktøj (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). Dette webværktøj bruger en tilpasset version af crispor-algoritmen til målgenerering50,51.
    3. I feltet for trin 1skal du indtaste navnet på sekvensen og indtaste målets sekvens i den relevante boks.
  3. Vælg det relevante genom, som sekvensen stammer fra. I øjeblikket er genomiske data tilgængelige for b. brachyistius og b. gauderio. Genom sekvenser er ikke nødvendige for brug af dette værktøj, men er nyttige i vurderingen af potentielle uønskede off-Target effekter.
  4. Vælg den relevante PAM. Den 20 BP-NGG PAM anbefales, selv om der er flere yderligere PAM motiver at vælge imellem, afhængigt af det anvendte Cas9 protein.
  5. En rapport vil blive genereret med placeringen af målsekvensen i genomet med foreslåede guide sekvenser. Vælg tre mål med lav forudsagte off-Target effekter, høj specificitet scores, og høj effektivitet scores. De højest scorende guide sekvenser fremhæves med grøn i venstre side. Gule og røde Fremhævede guide sekvenser bør undgås, hvis det er muligt.
  6. Hvis du klikker på udvalgte målsekvenser, genereres en omfattende CRISPOR-rapport. Nøgleoplysninger fra disse rapporter er for "T7 in vitro-ekspression fra overlappende oligonukleotider". Fra denne rapport, uddrag følgende oplysninger: anbefalede sgrna oligos, PCR primere for målet site, og en konstant oligomer, der vil blive brugt til at syntetisere alle sgrnas.
  7. Bestil de udvalgte oligomerer (trin 1,6) fra en oligonukleotid-produktions tjeneste. Oligomerer og PCR-primere kan bestilles som standard afaltede oligomerer, ingen yderligere rensning er nødvendig.

2. Generer sgRNA

  1. Anneal oligomerer i PCR tube: Tilsæt 1 μL 100 μM konstant oligomer, 1 μL af 100 μM sgRNA specifik oligomer, og 8 μL nuklease-fri H2O
  2. Anneal oligomerer i en termo cycler med følgende program: Opvarm ved 95 °C i 5 min., afkøles til 85 °C ved-2 °C/s, afkøles til 25 °C ved 0,1 °C/s og holdes ved 4 °C.
  3. For at generere sgRNA-skabelon tilsættes 2,5 μL dNTP-mix (10 mM), 2 μL 10x-buffer, 0,5 μL T4-DNA-Polymerase og 5 μL nuklease-fri H2O til de udglødede oligomerer fra trin 2,2. Inkuber i 20 min ved 12 °C.
  4. Rense skabelon ved hjælp af en PCR Clean up kolonne pr producentens anvisninger.
  5. Elute i 20 – 30 μL. Brug et spektrofotometer til at estimere koncentration og renhed. Skabelonen skal være 100 – 200 ng/μL og 1,8 – 1,9 A260/280.
  6. Bekræft via en agrose gel ved at løbe 1 – 5 μL. Det dominerende band bør være 120 BP. Se figur 1a for repræsentative resultater.
  7. Opbevar gel-verificeret sgRNA-skabelon ved-20 °C (lang sigt) eller 4 °C (kortvarig, 1 – 4 uger).
  8. Transskribere sgRNA ved hjælp af T7 RNA transkriptionssæt ved at tilsætte et 1,5 mL mikrocentrifuge glas ved stuetemperatur 8 μL dNTP-mix (lige store mængder af dA, dT, dG, dC), 2 μL 10x buffer (rumtemperatur), 2 μL T7 RNA-polymerase, 100 − 200 ng af sgRNA-skabelon , og nuklease-fri H2O til en samlet volumen på 20 μl. Spin at samle i bunden. Inkuber i 2 – 4 timer ved 37 °C.
  9. Tilsæt 1 μL DNase og Inkuber yderligere 15 min ved 37 °C.
    1. Rengør sgRNA ved at tilsætte 1 μL glykogen, 30 μL nuklease frit H2O, 30 μl 5 M ammonium acetat og 180 μl 100% EtOH til transkriberet sgrna. Bland godt og Inkuber mindst 20 min ved-80 °C (indtil frosset) eller ved-20 °C natten over. Centrifugeres ved 4 °C i 15 minutter ved maksimal hastighed.
  10. Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre pellet, og vask med 1 mL RNase-fri 70% EtOH kølet ved-20 °C. Spin yderligere 5 min ved maksimal hastighed ved 4 °C.
  11. Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre pellet, og luft-tør pellet i 5 min.
  12. Resuspension i 30 μL nuklease-fri H2O og bestemme renhed og udbytte ved hjælp af UV-spektroskopi (minimum udbytte på 200 ng/μl).
  13. Kontroller tilstedeværelsen af sgRNA på en RNase-fri gel. SgRNA optræder mellem 50 og 150 BP som to bånd på grund af den sekundære struktur (figur 1b).
  14. Alikvot til 3 μL og opbevares ved-80 °C.

3. validerer skære effektivitet in vitro

  1. Udpak genomisk DNA fra målarterne ved hjælp af et kommercielt DNA-ekstraktions udstyr. Ventral fin-udklip kan bruges uden at skulle ofre fiskene, fordi vævene regenereres.
  2. Amplificere måldna-regionen ved hjælp af primere designet som beskrevet i trin 1,6 og 1,7 ved hjælp af standard PCR. Kontrollér produktet ved gelelektroforese. Sekvensering af fragmentet for at sikre, at det rette område forstærkes, foreslås, men ikke nødvendigt. Repræsentative resultater for scn4aa -skabelonen er vist i figur 2.
  3. Ryd op i PCR-fragmentet med en etableret laboratorie-eller virksomheds protokol.
  4. Det forstærkede DNA opbevares ved-20 °C. Overvej at adskille det i aliquoter for at reducere fryse-tø cyklusser.
  5. Bestem de påkrævede mængder og mængder for hver komponent. Overvej at køre negative kontroller (undtagen enten sgRNA eller Cas9) og en positiv kontrol (en tidligere testet sgRNA, der kløver sin Target PCR forstærket DNA), hvis det er muligt, samt en koncentrations serie af sgRNA.
  6. Indstil reaktionsblandingen nedenfor i den specificerede rækkefølge i et PCR-rør ved stuetemperatur, og Tilføj sgRNA og Cas9 protein sidst for at opnå de bedste resultater: 50 – 100 ng af Target DNA PCR-produktet, 1 μL 10x buffer 3, 1 μL 10x BSA (0,1 g/mL) , 50 – 200 ng af Cas9 protein (1 mg/mL, 150 ng foreslået), og 30 – 200 af NG sgRNA (100 ng foreslået).
    1. Reaktionen inkubates ved 37 °C i 1 time og derefter ved 65 °C i 10 min for at inaktivere Cas9 protein.
    2. Kør hele prøven på en 2%-3% agopstået gel (forventede bånd størrelser mellem 30 – 200 BP) sammen med positive og negative kontroller. Vellykket kavalergang kan vise nogle af PCR-produktet, men vil også have to mindre bands. Repræsentative resultater er vist i figur 2.

4. opnåelse af embryoner

Bemærk: At få embryoner af svagt elektriske fisk kan være udfordrende. Omhyggelig overvågning af vandkvaliteten, tilstrækkelig tid til fiskepleje, og regelmæssig fodring er nøglen til en vellykket avlsprogram. Fisk skal først konditioneret i flere uger til reproduktion52 som beskrevet i protokol trin 4,1. Efter dette, en protokol forstærke naturlige dets (4,2) til brug i naturlig gyde adfærd (4,3), en alternativ nyligt udviklet in vitro-teknik til opnåelse af præcist tidsindstillede embryoner (4,4) er præsenteret. Protokol 4,3 er lige så effektiv for b. brachyistius og b. gauderio, og protokol 4,4 er overlegne i b. gauderio.

  1. Conditioning
    1. Hold B. brachyistius i par/små grupper (100 – 150 L tanke) eller i meget store tanke (2 hanner og 5 – 6 hunner i ca. 475 l tank), da de bliver meget aggressive under avlsforhold. Der skal være mindst 1 – 2 PVC-rør pr. fisk, som skal bruges som læ (figur 3a,B).
    2. B. gauderio kan opdrættes ved meget højere densitet. Hold op til otte personer i en 100 L tank (2 hanner og 6 kvinder). Der skal være mindst 1 PVC-rør pr. fisk til brug som læ. Tilsætning af sammenfiltrede garn øger berigelse og skjule pletter. Tilsæt 50 mL centrifugerør med 1 cm diameter huller boret ind i dem til toppen af tanken for at tillade voksne at gyde naturligt i rørene (figur 3c).
    3. I ynglesæsonen, fodre fisk dagligt friske blackworms suppleret med frosne blod orme. Maden kan beriges med vitaminer og kosttilskud, hvis det ønskes.
    4. Hus fisk normalt i en relativt høj ledningsevne (300 – 600 μS), pH afbalanceret opløsning. I yngletiden skal du gradvist sænke ledningsevnen med mindst halvdelen i løbet af 1 – 3 uger for at inducere gonade recrudescens og gydningen. Lavere ledningsevne ved daglige tilføjelser af omvendt osmose vand (RO), idet der holdes nøje fokus på pH, når ledningsevnen er lav (pH < 6).
    5. Avlsbetingelser kan opbevares i omkring 3 − 5 måneder med ægproduktion tilspidsning over tid. Efter dette tidspunkt, returnere fisk til høj ledningsevne langsomt over 1 – 3 uger. Hold yderligere 3 måneder med høj ledningsevne, før de udsættes for avlsforhold igen.
  2. Brug Spawn agent (SGnRHa + Domperidon) injektioner.
    1. Identificer hunfisk i avlsforhold, der forekommer gravid (figur 4). I B. gauderio den kvindelige vil have hævede gonader bare caudal til ventilatoren. B. brachyistius hunner vil have hævede bryst flæser og synes dyb fyldig (figur 4a). Hannerne generelt ikke har et problem producerer sperm. Men, større hanner foretrækkes på grund af den større sperm volumen indsamlet.
      Bemærk: Gyde middel er en kommerciel hormon blanding, der letter modning af kønsceller og koordinater gyde. Hvis fisken er blevet injiceret med gyde middel i fortiden, give mulighed for > 4 ugers hvile og rigelig fodring mellem injektioner. Vi foreslår at injicere mindst 2 hanner og 4 – 5 hunner for at sikre et par koblinger af æg og masser af sperm.
    2. Bedøve fisk i MS-222 (0,4 g/3 L) i et par minutter, indtil fisken ikke er i stand til at holde sin kropsholdning, er immobile, men fortsætter med at have opereret bevægelse (fase II53).
    3. Fiskene (g) vejes for at beregne mængden af gyde middel (0,5 μL/g) + 0,5 μL. De ekstra 0,5 μL tegner sig for pipetteringsfejl.
    4. Tilsæt gyde midlet til 4X buffer volumener (1x PBS eller DPBS) i et PCR-rør, og bland godt. Opløsningen bliver uklar. Det hjælper at dispensere gyde midlet på termoplastisk og derefter bruge en pipette til at måle den beregnede dosis. Gyde midlet er viskøs, så sørg for at dispensere hele dosen og vær forsigtig med pipettering.
    5. Afpipettér injektionsopløsningen på termoplastisk, og træk i en præcisions glassprøjte, og undgå luftbobler. Vi anbefaler en 28 G, 19 – 25 mm længde, Affaset nål.
    6. Injicer opløsningen i rygstammen muskel med en jævn hastighed. Lad nålen sidde for 2 – 4 s og derefter fjerne. Straks sætte fisk i frisk system vand til nyttiggørelse.
    7. Efter ca. 24 h klargøring til opsamling af embryoner (Se 4,3 eller 4,4). Saml alle nødvendige materialer, herunder hvad der er nødvendigt for enkelt celle mikroinjektion (se punkt 5).
  3. Opnå embryoner gennem naturlig gydning.
    1. Hus gyde middel-injiceret voksne (4,2) i en stor 450 L tanke. De mest effektive køns forhold har typisk været 1 – 2 hanner og 3 – 4 hunner med passende skjulesteder lavet af PVC-rør, og mørkt marmor substrat på tanken bund for at forhindre ægforbrug. Marmorkugler er typisk vigtigere for b. brachyistius end b. gauderio, som foretrækker at deponere deres klæbrige æg i sprækker eller 50 ml centrifugeglas som beskrevet ovenfor.
    2. Placer fisk i en omvendt lys cyklus for at matche natten gyde til regelmæssig Lab arbejdstid. Brug en off-the-hylde forbruger grade sikkerhedssystem, overvåge fisk ved hjælp af infrarød belysning for at minimere forstyrrelse fra en eksternt tilsluttet PC (figur 3).
    3. Fiskene vil spontant gyde i løbet af den mørke fotoperiode ca. 24 h efter Spawn-midlet injektion.
    4. Når gydningen begynder, opsamles æggene hver time, mens gyde adfærden opstår. I B. brachyistius, indsamle æg ved hjælp af en lille diameter sifon over en fin bomuld mesh net for at minimere skader på frisk spawnede æg. Saml B. gauderio æg fra 50 ml centrifugeglas eller tank substrat. Arbejd effektivt med minimal forstyrrelse af gydefisk ved hjælp af en hoved lampe med et rødt lys med lav intensitet. Som første spaltning forekommer ca 1 h efter befrugtning (HPF), en stor del af æg vil være egnet til enkelt celle mikroinjektion.
    5. Fortsæt straks til mikroinjektion (se punkt 5).
  4. Klem mænd for in vitro befrugtning af B. gauderio.
    1. Forbered sædforlænger opløsningen (SES) som beskrevet i Zebrafish Book54: 10 mm hepes, 80 mm kcl, 45 mm nacl, 45 mm natriumacetat, 0,4 mm CaCl2og 0,2 mm mgcl2.
      1. Brug ddH2O til at bringe til volumen og justere pH til 7,7 med 1 M NaOH.
      2. Opbevares i køleskab.
      3. Filtrer gennem et 0,22 μm filter før brug.
    2. Bedøve fisk i MS-222 (0,4 g/3 L) i et par minutter, indtil fisken ikke er i stand til at holde sin kropsholdning, er immobile, men fortsætter med at have opereret bevægelse (fase II53). Placer 500 μL aliquoter af SES i is.
    3. Tørre hænder og fisk grundigt, især omkring hovedet og ventilatoren. Placer ventrale side opad, forreste til venstre (for højrehåndede individer) i en polystyren skum/svamp holder dækket i en MS-222 gennemblødt, fugtigt papir håndklæde. Hovedet skal være så parallelt med tabellen som muligt.
      Bemærk: Trin 4.4.4-4.4.6 skal ske så hurtigt som muligt, og Fiskene bør kun være ude af vand for 30 – 60 s.
    4. Påfør trykket i hale til rostral Columns retning med lys klemme overarms over gonaderne mod ventilatoren. Fiskene kan udvise affald. Vær omhyggelig med at rengøre ventilatoren med en delikat opgave serviet, hvis der udvises spild. Indsaml ikke affald med sperm. Afhængig af størrelsen af den mandlige, 10-60 μL er almindelig.
    5. Ved hjælp af en Mikropipetter med et tip skal du forsigtigt samle sæden, da den presses fra hannen i intervaller på 50 μL. Placer sperm direkte i 500 μL aliquoter af SES på is. Det kan være nyttigt at have en anden forsker hjælpe med at indsamle sperm, mens den anden klemmer. Sædceller bør anvendes så hurtigt som muligt, men forbliver levedygtige i mindst 1 time.
    6. Umiddelbart efter indsamling, sætte fisk i frisk system vand til nyttiggørelse. Fiskene bør kun være ude af vand for 30 – 60 s.
  5. Klem hunnerne til in vitro befrugtning af B. gauderio.
    1. Bedøve fisk i MS-222 (0,4 g/3 L) i et par minutter, indtil fisken ikke er i stand til at holde sin kropsholdning, er immobile, men fortsætter med at have opereret bevægelse (fase II53). Placer polytetrafluorethene ark på arbejdsstationen.
      Bemærk: Afsnit 4.5.1-4.5.5 skal ske så hurtigt som muligt, og Fiskene bør kun være ude af vand for 30 – 60 s.
    2. Tørre hænder, værktøj, polytetrafluorethene ark, og fisk grundigt, især omkring hovedet og udluftning. Placer på siden med hovedet vendt forreste (for højrehåndet individer).
    3. Påfør trykket i hale til rostral Columns retning med lys klemme overarms over gonaderne mod ventilatoren. Fiskene kan udvise affald. Vær omhyggelig med at rengøre ventilatoren med en delikat opgave serviet, hvis der udvises spild. Afhængigt af fiskens størrelse er 20 – 150 æg almindeligt forekommende. Ved hjælp af en polytetrafluorethene coated spatel/værktøj omhyggeligt indsamle æg, som de er presset fra cloaca. Hurtigt flytte æg til en lille Petri skål og dække. Sørg for, at æggene forbliver tørre under denne proces. Alternativt, efter klemning, røre ægmassen til bunden af en lille Petri skål eller til polytetrafluorethene ark, som de er udvist fra kvinden.
    4. Umiddelbart efter indsamling, sætte fiskene i frisk system vand til nyttiggørelse.
  6. Udfør ægbefrugtning til in vitro-befrugtning af B. gauderio.
    1. Tilsæt 100 μL velblandet sperm i SES (Se trin 4,4) direkte over ægmassen.
    2. Tilsæt 1 mL system vand (filtreret gennem et 0,22 μm filter) og bland godt for 30 – 60 s.
    3. Tilsæt yderligere 1 – 2 mL system vand (Efterlad noget plads i Petri skålen) og Placer det i inkubator. Rekordtid for IVF på Petri skålen og flytte til en 29 °C inkubator. Indstil en 50 min timer for at kontrollere udviklingen af udvikling (f. eks. dannelse af enkelt cellen på dyre stangen, se figur 6). I løbet af denne tid, forberede materialer til mikroinjektion.

5. enkelt celle mikroinjektion

  1. Træk mikroinjektionnåle før Spawn-Indsprøjtnings midlet (trin 4,2) eller naturlig gydning (trin 4,3). Brug en borosilikat glas kapillar med en glødetråd (OD 1,0 mm, id 0,58 mm, 10 cm længde) og en nål aftrækker til at trække mikroinjektionnåle. Forbered 2 – 4 nåle pr. planlagt behandling injektion.
    Bemærk: Backloading nåle med en glødetråd foretrækkes, fordi glødetråden væger opløsningen mod spidsen og eliminerer bobler. Nåle uden glødetråd kan dog anvendes, og forhåndsvideresendelse bør ikke have nogen effekt på udfaldet. Nålen skal have en lang, men robust koner. Brug nålen trække programmet med følgende specifikationer som udgangspunkt: varme = 500; Pull = 70; Hastighed = 70; og klokkeslæt = 100. Repræsentative nåle morfologier er vist i figur 5a.
  2. Forbered injektionsvæsken, og Forbered nålen.
    1. Der tilsættes 0,9 μL sgRNA og 0,9 μL Cas9 enzym (1 mg/mL) til 0,2 μL 10% eller 100% phenol (for henholdsvis 1% og 10% endelig phenolrød koncentration) i et PCR-rør. Bland godt og lad sidde på is 2 − 5 min at tillade sgRNA og Cas9 til komplekse. Beregn den endelige koncentration af sgRNA, Cas9 og phenol rød i injektionsopløsningen.
      Bemærk: Hvis der er problemer med nåle tilstopning eller skære effektivitet ved hjælp af ovenstående opskrift, kan det være nyttigt at bruge en 1x endelig koncentration salt/buffer mix til at stabilisere Cas9 og forhindre nål tilstopning.
    2. Brug en pipettespids til mikroloader til at tilbage læsse 2 μL af opløsningen i mikroinjektionsnål. Udpres væsken så tæt på spidsen som muligt.
    3. Læg kanylen i micromanipulator, og Indstil tryk indstillingerne (Start med 775 pi, 0,1 − 0,2 s og 8-12 pc).
    4. Under anvendelsesområdet skal du bruge et par fine pincet til at bryde nålens spids i en Affaset vinkel. Bryd mod, hvor tilspidseren af nålen begynder at have stivhed. Det er bedst at bryde tættere på spidsen, teste størrelsen af injektionsopløsningen og derefter bryde yderligere, hvis det er nødvendigt. Nålens boring skal forblive så lille som muligt, samtidig med at der opretholdes en stiv koner (figur 5a).
    5. Brug mineralolie og et mikrometer til at måle størrelsen af injektionsopløsningen. 1 – 2 nL anvendes typisk; 0,1 mm diameter er 0,5 nL.
    6. Juster nåle spidsen eller tryk indstillingerne for at få en Injektionsvolumen inden for specifikationerne.
  3. Identificer udvikling af zygoter, og Forbered Indsprøjtnings stadiet. Indstil Indsprøjtnings stadiet. Tag en Petri skål på 100 mm i diameter. Vend bunden og Placer under den inverterede top. Placer et glas mikroskop slide i den inverterede top. Afhængigt af hvordan din micromanipulator er monteret på området, kan den ekstra højde fra den inverterede base være unødvendig.
    1. Se på de udviklende æg og identificere formodede befrugtede zygoter 50 – 60 min efter IVF. Dyret pole vil begynde at danne, og der vil være et overskud af små fedt dråber omkring blomme/animalsk celle grænseflade (figur 6).
    2. Saml 10 – 20 æg med så lidt vand som muligt ved hjælp af en plastik overførings pipette (skær spidsen lidt for at tillade æg at passere) og Placer på kanten af diaset. Vand vil være ond under diaset og trække æg mod kanten.
    3. Brug en delikat opgave serviet og tryk forsigtigt på sliden for at fjerne overskydende vand og lad æggene fastholde sig til kanten af diaset. Der bør være lige nok vand til at holde æggene fugtige samtidig bevare lidt stående fugt for at undgå æg bevægelse under injektion.
  4. Injicér direkte i enkelt celle.
    1. Justér æggene mod diaset lodret, vinkelret på den nærmer nål (figur 5b).
    2. Brug micromanipulator, Placer nålen mod chorion. På omtrent en 45 ° vinkel, Indsæt nålen i chorion, og derefter ind i enkelt cellen. Det kan være nyttigt at indtaste den enkelte celle gennem æggeblomme. Hvis du flytter både Indsprøjtnings stadiet med den frie hånd og micromanipulatoren, kan det give mere kontrol over injektionsprocessen (figur 5b).
    3. Injicer sgRNA/Cas9/phenol rød opløsning i enkelt cellen. Fjern forsigtigt nålen. Fortsæt til næste æg og Gentag trin 5.4.1-5.4.3, indtil alle æg injiceres.
    4. Fjern eventuelle æg, som er brudt under injektionen, med fine pincet. Brug 0,22 μm filtreret system vand i en sprøjte flaske til forsigtigt at fjerne æg fra Indsprøjtnings stadiet til en ny Petri skål med en diameter på 100 mm.
    5. Gentag trin 5.3.3-5.4.6 indtil alle æg er blevet injiceret eller har udviklet sig til den to-celle fase. Sørg for at afsætte ca. 20 formodede befrugtede æg som en no-injektion kontrol for at bestemme gødskning satser og injektion succes. For større koblinger bruge uinjicerede embryoner, der har udviklet sig til to-celle fase, og for mindre koblinger afsat formodede befrugtede æg.
    6. Overvej desuden en sgrna/injektion kontrol ved at injicere 15 – 25 embryoner med Cas9 kompleks med en sgrna mod et gen, der ikke er til stede i genomet. GFP-genet anbefales til vildtype embryoner. Optag antallet af æg, forældre, IVF tid, og dato på hver Petri skål. Medtag sgRNA-mål eller-etiket som ikke-injiceret. Flyt til en 29 °C inkubator.

6. husdyrhold

  1. Omsorg for æggene.
    1. Kontrollér æglevedygtig heden 4 – 6 timer efter indsprøjtninger.
    2. Optag antallet af døde æg, samt enhver, der er ubefrugtede. De ubefrugtede æg vil arrestere omkring de otte-cellede stadier og have et Rosette mønster af cellerne på dyre stangen (figur 6). Afhængigt af antallet af døde æg og mængden af ægge affald i vandet, fjerne mindst 50%-80% af vandet og erstatte med filtreret system vand. Det kan være nyttigt at skrubbe bunden af Petri skålen, hvis en cellulær vragrester film eller biofilm former.
    3. For de næste 2 – 3 dage, check æg 1 – 2x dagligt. Gentag trin 6.1.2-6.1.3, hver gang æggene kontrolleres.
    4. Efter 2 − 3 dage vil larverne luge. Fjern alle ægge hylster, mens de klækkes. Blid pipettering kan hjælpe med at frigøre halv-klækket larver.
  2. Pas på larverne.
    1. Check æg 1 − 2x dagligt. Gentag trin 6.1.2-6.1.3, hver gang larverne kontrolleres.
    2. Fra 6 – 14 DPF, foder eddike ål til larverne. Et lille overskud af fødevarer er godt, fordi eddike ål vil forblive i live i skålen. Tilsæt eddike ål hver gang skålen kontrolleres og rengøres.
    3. Fra 11 – 14 DPF tilsættes 5 – 10 frisk klækket artemia pr. larver ud over eddike ål. I løbet af denne tid larverne vil lære at spise den gratis svømning artemia.
    4. Ved 15 DPF flyttes larverne til æggebægre (se pkt. 6.2.5) i en tank med strømmende vand, filtrering og luftning. Der må ikke være mere end ca. 25 embryoner pr. kop. Ægge kopper er plastik kopper med en mesh netting på bunden. En 100 mm Petri skål top/bund kan tilsættes til bunden af ægge koppen for at hjælpe med at stoppe fødevarer i at falde gennem masken. Æggebægre tillader fiskene at blive anbragt i en større mængde vand af hensyn til vandkvaliteten, samtidig med at diskrete grupper bevares. Fortsæt med at tilføje både eddike ål og 15 − 30 frisk klækket artemia per larver fra dag 15 – 18. Rengør Petri skål stykke dagligt og brug en pipette til at fjerne masser af døde artemia.
    5. Fra dag 18 – 30, foder kun frisk klækket artemia. Øg mængden af fodring, når fiskene vokser, og hvis der ses hale bidende.
    6. Efter ca. 30 dage, Flyt fisk til 10 L (2,5 gallon) tanke, ca. 25 individer pr. tank. Sørg for, at der er filtrering, beluftning, og steder for at skjule. Overvej cylindriske biofiltrationsmedier og PVC-rør med lille diameter.
    7. Feed frisk klækket artemia og blackworms fra ca. 30 – 45 dage og fremefter. Vedligehold standard rengøring og vand ændringer for tanken (dvs. på minimum ~ 10% – 20% vandskift pr. 1 uge).
    8. Efter ~ 45 DPF, fodre kun blackworms indtil ~ 60 DPF.
    9. Efter ~ 60 DPF, flytte kohorter af ca 15 fisk til 40 L (10 gallon) tanke og begynde voksen opdræt procedurer. Tilsæt PVC-rør og et garn "MOP" (en masse af brunt garn bundet sammen omkring en kork) til skjulesteder (figur 3c). Fisk skal nærme sig avls størrelse (10 − 12 cm) efter ca. 3 − 4 måneders befrugtning.

7. voksen opdræt

  1. Fodre fisk dagligt med nok blackworms, så en lille mængde af blackworms er til stede ved den næste fodring. Denne annonce libitum fodring giver maksimal vækst.
  2. Et par gange om ugen, kan det være nyttigt at supplere blackworm fodring med blod orme.
  3. Rengør tanke hver 2 – 4 uger med en 20%-30% vand ændring. Hvis Garnet moppe bliver fuld af biofilm/alger, gnid det ren under RO vand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SgRNA-målstederne blev identificeret inden for exon 1 af scn4aa i både b. Gauderio og b. brachyistius som beskrevet i afsnit 1. SgRNAs blev genereret som beskrevet i afsnit 2. Efter vellykket sgRNA-udvælgelse og-syntese (figur 1) blev in vitro-spaltning afprøvet (figur 2). SgRNAs, der demonstrerer in vitro-skæring, blev derefter udvalgt til mikroinjektioner med enkelt celle.

Voksne fisk var konditioneret til reproduktion (punkt 4,1), derefter injiceres med et gyde middel (afsnit 4,2) og efterfølgende klemt (b. gauderio) for IVF som beskrevet i afsnit 4,4 eller lov til at gyde naturligt (b. brachyistius) som beskrevet i afsnit 4,3. Disse bestræbelser gav enkelt celle embryoner til mikroinjektion i begge arter. Som beskrevet i afsnit 5, 1.5 − 2.0 nL af scn4aa sgrna/Cas9/phenol Red complex (65-190 ng/UL sgrna, 450 ng/UL Cas9, 1% − 10% phenol rød, endelige koncentrationer) blev injiceret i en-celle fase. Æg fra samme kobling blev anvendt som ikke-injicerede kontroller. Alle embryoner blev passet som beskrevet i punkt 6. Efter IVF blev 40%-90% af æggene befrugtet, og 70%-90% af embryonerne overlevede til klækning efter injektion.

Omkring 75% af fiskene overlevede til 6 − 11 DPF og blev derefter fænotype. Larve fisk blev anbragt i en 35 mm Petri skål indlejret i en større skål med Sylgard immobiliserede AG/CL-optagelses elektroder (figur 7a). Embryo bevægelsen blev begrænset ved hjælp af 3% agopstået forme lavet med system vand og skåret til at passe til embryonet (figur 7b). Det samme optagelses kammer blev brugt til begge arter, og den samme agopstået skimmel blev brugt blandt Arts sammenligninger. Embryoner blev registreret for 60 s, hvilket er tilstrækkeligt til at fange hundredvis af EODs. Alders-og størrelses matchede ikke-injicerede kontrolelementer blev valgt til sammenligning. På dette tidspunkt, 10%-30% af de overlevende embryoner viser en reduceret amplitude EOD. Embryoner, der viser en reduktion i EOD amplitude uden indlysende morfologiske defekter og kontrol uinjicerede hele embryoner blev fordøjet for DNA-ekstraktion og efterfølgende PCR af scn4aa Target site. Der var ofte en række penetrans af fænotype, med nogle personer, der har en stærkere reduktion i EOD amplitude end andre.

Efter PCR oprydning og kloning blev 30 + kloner fra hvert embryo udvalgt til sanger sekvensering. CRISPR/Cas9 inducerede mutationer blev identificeret i b. gauderio (figur 8a,b) og b. brachyistius (figur 9a,b) personer med kraftig EOD amplitude reduktion (figur 8c og figur 9c ), hvor ikke-injicerede Kontroller kun havde reference genotyper. Visualisering af EOD amplitude mellem bekræftede mutanter ("CRISPR") og alder/størrelse matchede uinjicerede kontroller viste, at både scn4aa mutant B. brachyistius (figur 10a) og b. gauderio (figur 10b ) embryonerne havde signifikant lavere EOD amplitude end kontrol (p < 2,2 x 10-16, Welch to-Sample t-test). CRISPR/Cas9 målretning af scn4aa var vellykket i både b. brachyistius og b. gauderio og impliceret scn4aa i larval/tidlig elektro Cyt udledning i begge arter.

Figure 1
Figur 1: sgRNA skabelon syntese og transskription. (A) gel billede af sgRNA skabelon syntese. Etiketterne svarer til forskellige sgRNAs for myod (MYO2, MYO1) og tre sgrnas for scn4aa (S1 − S3). Efter udglødning oligomerer, en ~ 120 BP skabelon er produceret. B) gel-billede af sgRNA-transskription for tre sgRNAs for b. gauderio (bg2017) og to for b. brachyistius (bb2016, 2017). SgRNA vil fremstå som to bands på grund af sekundær struktur og vil være mellem 50 − 150 BP, når du bruger en dsDNA stigen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentativt gel-billede af vellykket (SG1) og mislykket (SG) in vitro-CRISPR assays. En tilsvarende mængde skabelon uden CRISPR-komponenter vises i scn4aa Lane. Bemærk de dobbelte bånd i SG1, der viser, at skæring har fundet sted. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: avl tank opsætninger for svagt elektriske fisk. (A) skematisk af den typiske opsætning for trådløs videoovervågning af gyde adfærd. Tre kommercielt tilgængelige CCTV-kameraer (Swann, Inc.), der kan producere infrarødt lys, er rettet mod toppen af vandet og forbundet til en digital videooptager (DVR). Video overvåges i realtid for gyde adfærd i et tilstødende rum fra en netværkstilsluttet computer (PC). (B) gyde adfærd fanget med en sådan opsætning i B. brachyistius. C) en typisk avls opsætning for B. GAUDERIO med PVC-skjulende rør og garn-Mops. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: opdræt af hanner og hunner. A) b. brachyistius og b . gauderio. Begge arter er seksuelt dimorfe og let skelnes visuelt når seksuelt moden. Begge hunner er gravid i disse billeder, udviser karakteristisk hævede brystflæsk, der er fulde af modne æg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: mikroinjektion. (A) spidser af glas kapillar nåle skal brydes for at levere et passende mikroinjektionvolumen. Spidsen til venstre er ubrudt. De midterste og højre spidser er brudt med en lidt vinklet facet for at gennembore ægget chorion. B) æggene er foret med et glas skred (1%-10% phenol rød er inkluderet som en Tracer til at visualisere tilførslen af injektionen) og injiceres med glas kapillær nåle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: udviklingsstadier. A) b. gauderio og b . brachyistius. Alle æg antages befrugtet og udvikling overvåges til 24 HPF. Mellem 12 − 24 HPF-embryoner er synlige i levedygtige æg, ellers udviser æg nedbrydning. Flere divisioner synes at finde sted på ægaktivering, uanset befrugtning. Ubefrugtede æg udviser usædvanlige mønstre af kavalergang, der er meget mere symmetriske i befrugtede æg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: fotografi af larve optage kammer anvendt i dette studie. (A) elektroderne er indlejret i sylguard, men strækker sig ind i 35mm skålen indeholdende et embryon begrænset via en 3% agopstået skimmel. B) et højere forstørrelses billede, som fremhæver embryoens begrænsede bevægelse på grund af agopstod. Bemærk de stykker af agopstået, der kan fjernes, da embryonet ændrer størrelse. B. gauderio embryo står over for den positive elektrode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: CRISPR/Cas9 inducerede mutationer i B. gauderio. (A) 32 klon sekvenser fra genomisk DNA af Cas9-inducerede mutationer i en enkelt scn4aa målrettet F0B. gauderio embryo (11 DPF). Reference sekvensen er understreget med sgRNA-målwebstedet fremhævet med gråt, protospacer-tilstødende Motif (PAM) sekvens fremhævet med rødt, og Cas9 cut site markeret med "|". Ændringen fra den forventede Wild type sekvens er givet, og antallet af kloner for hver sekvens er angivet i parentes. (Forkortelser: + = indsættelse,-= sletning, ± = Indel) Eventuelle ikke-CRISPR associerede sekvens forskelle er fed. Figur modelleret efter Jao et al.60. B) aminosyresekvens forudsagt fra sekvenserede kloner af Scn4aa Knockdown B. gauderio fra (A). Cas9-inducerede ændringer fra Wild type sekvensen er fremhævet med rødt, og det nukleotidinducerede ændringsnummer er givet. (C) enogtyvende elektriske optagelser fra fem størrelses matchede larver, alle optaget 6 DPF i samme optagelses kammer. Gain-indstillinger er identiske for alle spor. Spor i rødt er fra b. gauderio larver med bekræftede mutationer (en person vist i figur 8a, B ovenfor), spor i sort er fra ikke-injiceret B. gauderio larver. Samlet set, CRISPR/Cas9 redigering af scn4aa viste en reduktion i EOD amplitude, selv om effekten var heterogene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: CRISPR/Cas9-inducerede mutationer i B. brachyistius. A) 42 klon sekvenser fra genomisk DNA af Cas9-inducerede mutationer i et enkelt scn4aa målrettet F0B. brachyistius -embryo (11 DPF). Reference sekvensen er understreget med sgRNA-målwebstedet fremhævet med gråt, protospacer-tilstødende Motif (PAM) sekvens fremhævet med rødt, og Cas9 cut site markeret med "|". Ændringen fra den forventede Wild type sekvens er givet, og antallet af kloner for hver sekvens er angivet i parentes. (Forkortelser: + = indsættelse,-= sletning, ± = Indel) Eventuelle ikke-CRISPR associerede sekvens forskelle er fed. Figur modelleret efter Jao et al.60. B) aminosyresekvens forudsagt fra sekvenserede kloner fra Scn4aa Knockdown B. brachyistius i litraa). Cas9-inducerede ændringer fra Wild type sekvensen er fremhævet med rødt og nukleotidinduceret ændringsnummer er givet. (C) ti sekunder elektriske optagelser fra fire størrelses matchede larver, alle indspillet 10 DPF i samme optagelses kammer. Gain-indstillinger er identiske for alle spor. Spor i rødt er fra b. brachyistius larver med bekræftede mutationer (en person vist i A, B ovenfor), spor i sort er fra uinjiceret B. brachyistius larver. Samlet set, CRISPR/Cas9 redigering af scn4aa viste en reduktion i EOD amplitude, selv om effekten var heterogene. Inverterede EODs er fra fiskene skiftende retning under optagelsen. Ingen forskel er mærkbar mellem eksperimentelle fisk og kontrol på trods af dette. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: boks plots af gennemsnitlig EOD amplitude af CRISPR og uinjiceret størrelse/alder matchede søskende. (A) EOD amplitude af B. brachyistius LARVER ved 10 DPF. Indspillet med en gevinst på 100, CRISPR n = 56 EODs fra to individer, uinjiceret n = 114 EODs fra tre individer. (B) EOD amplitude af b. gauderio larver ved 6 DPF. Indspillet med en gevinst på 500, CRISPR n = 34 EODs fra to individer, uinjiceret n = 148 EODs fra tre individer. Amplitude af CRISPR fisk var signifikant mindre end uinjicerede kontroller (p < 2,2 x 10-16, Welch to-Sample t-test). Alle individer blev indspillet med optagelses kammeret beskrevet i figur 7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Beskrivelse Sekvens
Konstant oligomer 5 '-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGC TATTTCTAGCTCTAAAAC-3 '
Target oligomer backbone (GG-N18, no PAM) 5 '-TAATACGACTCACTATAGG-N18-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Mål oligomer backbone (N20, no PAM) 5 '-TAATACGACTCACTATAG-N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Brienomyrus brachyistius
scn4aa BB sgRNA Target (N18, med PAM): 5 '-TCTTCCGCCCCTTCACCACGG-3 '
Scn4aa BB sgRNA oligomer (GG-N18): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG TCTTCCGCCCCTTCACCA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
scn4aa BB PCR primer (218 BP)
Scn4aa_bb_exon1_F: 5 '-ATGGCCGGCCTTCTCAATAA-3 '
Scn4aa_bb_exon1_R: 5 '-TCTTCCAGGGGAATATTCATAAACT-3 '
Brachyhypopomus gauderio
Scn4aa BG sgRNA Target (N17, med PAM): 5 '-CAAGAAGGATGTAGTGGAGG-3 '
Scn4aa BG sgRNA oligomer (GG-N17): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG CAAGAAGGATGTAGTGG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Scn4aa BG PCR primer-par (204 BP)
scn4aa_bg_exon1_F: 5 '-CGCCTTGTCCCTCCTTCAG-3 '
scn4aa_bg_exon1_R: 5 '-ATCTTCAGGTGGCTCTCCAT-3 '

Tabel 1: oligonukleotider, der er nødvendige for protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den fænotypiske rigdom af svagt elektriske fisk, sammen med en nylig spredning af genomforskning ressourcer, motiverer et stærkt behov for funktionelle genomiske værktøjer i svagt elektrisk fisk model. Dette system er særligt attraktivt på grund af den konvergerende udvikling af talrige fænotypiske træk i parallelle nedstamningens af fisk, som let holdes i laboratoriet.

Den protokol, der er beskrevet her, viser effekten af crispr/Cas9-teknikken i nedstamningens af svagt elektriske fisk, som udviklede electrogenesis og electroreception parallelt, og derfor udgør et stort skridt for denne model løfte om at tackle fremtidigt arbejde inden for Komparativ genomforskning af fænotypisk Evolution.

Denne enkle metodiske tilgang kræver kun grundlæggende molekylærbiologiske færdigheder og uddannelse, efter en grundlæggende vedtagelse af Gagnon-protokollen38, der er almindeligt anvendt til zebrafish. Det er værd at bemærke, at som teknologien skrider frem, er der flere kommercielle kits til sgRNA produktion samt virksomheder, der kan syntetisere guide RNAs, hvilket gør denne protokol mere tilgængelig for laboratorier, der mangler molekylær biologi erfaring og udstyr. Vi bemærker først, at den høje mutagenese effektivitet muliggør direkte fænotype af injiceret larver. Der synes imidlertid at være en betydelig grad af fænotypiske mosaisme, som ikke er ualmindeligt og er i overensstemmelse med litteraturen41,42,43,44. For eksempel, i denne scn4aa undersøgelse, nogle personer, der bærer mutationer udstillet meget større amplitude EODS end andre, der var forholdsvis tavse (figur 7, figur 8). Det er i øjeblikket uklart, hvor mange af disse mutationer transporteres ind i germline. Umiddelbare fremtidige bestræbelser vil blive rettet mod at skabe stabile mutante linjer.

Udnytte nhej vej for knockouts er kun en af de mange potentielle anvendelser af crispr/Cas9 gene redigering: de metoder, der er skitseret her er et springbræt for mere avancerede applikationer55,56. Fremtidige bestræbelser bør være rettet mod at designe Co-injiceres DNA donor skabeloner med sgRNA/Cas9 kompleks. Denne enkle modifikation ville udnytte endogene skabelon-baserede reparationsmekanismer (dvs. homologi rettet reparation, eller HDR) og tillade præcise Knock-ins. Selvom HDR forekommer på en lavere effektivitet end nhej tilgange, er der gjort fremskridt for at øge dens effektivitet57,58. Denne lavere effektivitet vil kræve bestræbelser på at optimere designet af DNA donor Template/CRISPR/Cas9 konstruktionen, gøre de endogene reparationsmekanismer mere effektive og øge embryo produktionen (se nedenfor). Hvis dette spørgsmål om effektivitet kan løses, knockins kunne udnyttes til at tilføje fluorescerende Tags, udtrykke en muteret form af genproduktet, eller ændre promotor eller forstærker sekvenser.

Mens molekylær biologi bag denne teknik er ret ligetil, er opdræts kravene betydelige, men ikke uovervindelige. B. gauderio er bredt tilgængelige og race hurtigt nok til enhver forskning program til at have en koloni i under et år. I modsætning hertil udvikler B. brachyistius langsomt, og anatomiske særegenheder har bevist forsøg på IVF hidtil mislykket. Andre, større arter, såsom Campylomormyrus59 kan være mere befordrende for denne tilgang. For B. brachyistiusblev alle injicerede embryoner indsamlet ved hjælp af den naturlige gyde tilgang, som er betydeligt mere arbejdskraftintensiv. Fremtidige bestræbelser på at øge effektiviteten i B. brachyistius IVF vil give mulighed for et højere udbytte af embryoner for de effektivitetsproblemer, der er beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender den heroiske indsats af Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, og Hope Healey for at få hjælp til fiskeopdræt, dataindsamling og tidlig protokol udvikling. Vi vil også gerne takke de tre anmeldere for deres forslag til manuskriptet. Vi mener, at det endelige produkt er af bedre kvalitet efter at have rettet deres kommentarer. Dette arbejde blev finansieret af støtte fra National Science Foundation #1644965 og #1455405 til JRG, og Generaldirektoratet for naturvidenskab og ingeniør forskning giver VLS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 mg/mL RNA grade Glycogen Thermo Scientific R0551
50 bp DNA ladder NEB N3236L
Borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF100-58-10 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL PNA Biology CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector Fisher Scientific E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific 10289651
Hamilton syringe Fisher Scientific 14-824-654 referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe Fisher Scientific 06-666 referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
NEBuffer 3 NEB B7003S used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit NEB M0480L
Ovaprim Syndel USA https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm Fisher Scientific S37440 referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller WPI SU-P97 sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Reusable needle- requires customization Fisher Scientific 7803-02 Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase NEB M0203L Use with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated tools bonefolder.com T-SPATULA4PIECE referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system--twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, Pt 10 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, Pt 6 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, Pt 11 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
  29. Futuyma, Evolution. Third Edition. , Sinauer Associates Inc. (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist's Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G. Encyclopedia of Animal Behavior. Breed, M. D., Moore, J. 1, Academic Press. 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. , Springer. 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , Univ. of Oregon Press. (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 3 Pt B 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).

Tags

Biologi CRISPR/Cas9 elektriske fisk enkelt celle mikroinjektion scn4aa elektrisk organ udledning genom modifikation mormyrid gymnotiform
Lyddæmpnings spark: CRISPR/Cas9 Genome redigering i svagt elektrisk fisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Constantinou, S. J., Nguyen, L.,… More

Constantinou, S. J., Nguyen, L., Kirschbaum, F., Salazar, V. L., Gallant, J. R. Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (152), e60253, doi:10.3791/60253 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter