Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Имплантация и мониторинг ПЭТ/КТ ортотопической модели плевральной мезотелиомы человека у атимических мышей

Published: December 21, 2019 doi: 10.3791/60272
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1MicroPET/SPECT/CT Imaging Laboratory, Centre for BioMedical Imaging (CIBM), Division of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, University Hospitals and University of Geneva, 2Division of Thoracic and Endocrine Surgery, University Hospitals and University of Geneva

Summary

В этой статье описывается поколение ортотопической мыши модели человека плевральной мезотелиомы путем имплантации H2052/484 мезотелиомы клеток в плевральной полости иммунокомпромиссных атимических мышей. Продольный мониторинг развития интрафлеурных опухолей оценивался с помощью неинвазивной мультимодальной no18ФЗ-2-фторо-2-дезокси-D-глюкозы позитронно-глюкозной позитронной эмиссионной томографии и компьютерной томографии.

Abstract

Злокачественная плевральная мезотелиома (MPM) является редкой и агрессивной опухолью, возникающей в мезотелиии, которая покрывает легкие, сердце и грудную полость. Развитие MPM в основном связано с асбестом. Лечение обеспечивает лишь скромную выживаемость, так как средняя продолжительность выживаемости составляет 9-18 месяцев с момента постановки диагноза. Поэтому необходимо определить более эффективное лечение. Большинство данных, описывающих новые терапевтические цели, были получены в ходе экспериментов in vitro и должны быть проверены в надежных доклинических моделях in vivo. В этой статье описывается одна из таких надежных ортотопических моделей MPM, полученных после инъекции человеческой линии клеток MPM H2052/484 в плевральную полость иммунодефицитных атгимических мышей. Трансплантация в ортотопии позволяет изучать прогрессирование опухоли в естественной среде in vivo. Позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография (ПЭТ/КТ) молекулярная томография с использованием клинической no18F'-2-fluoro-2-deoxy-D-глюкозы(No 18F'FDG) радиотрейд является методом диагностики выбора для обследования пациентов с MPM. Соответственно, для продольного мониторинга прогрессирования заболевания ортотопической модели H2052/484 использовался18ФЗФГ-ПЭТ/КТ. Этот метод имеет высокий потенциал 3R(Reduce количество животных, Refine для уменьшения боли и дискомфорта, и Replace животных экспериментов с альтернативами), так как развитие опухоли можно контролировать неинвазивно и количество животных, необходимых может быть значительно сокращена.

Эта модель отображает высокий уровень развития, быстрый рост опухоли, является экономически эффективным и позволяет быстро ею клинический перевод. Используя эту ортотопическую модель xenograft MPM, исследователи могут оценить биологические реакции надежной модели MPM после терапевтических вмешательств.

Introduction

Злокачественная плевральная мезотелиома (MPM) является рак чаще всего связаны с воздействием асбеста волокон1,2,3. Хотя асбест был запрещен в большинстве западных стран4,5,6, заболеваемость MPM по-прежнему растет7,8. В последнее время воздействие мышей нананотрубки углерода предполагает, что они могут привести к значительному риску для здоровья людей9,10. Данные показывают, что воздействие этих продуктов может вызвать хроническое воспаление и молекулярные изменения (например, потеря опухолевых путей супрессора), которые лежат в основе прогрессии злокачественной мезотелиомы. В настоящее время многостенные углеродные нанотрубки являются одним из наиболее важных продуктов нанотехнологий и все чаще включаются в различные продукты, такие как композиты, материалы для хранения энергии, медицина, электроника и материалы для восстановления окружающей среды.

MPM является рак с плохим прогнозом, и большинство пациентов умирают в течение двух лет после постановки диагноза из-за ограниченной эффективности текущих методов лечения11. Выбор лечения МПМ зависит от стадии рака. Для большинства ранних стадиях MPM (стадия 1 и, возможно, некоторые стадии 2 или 3 опухоли), клинический подход мультимодальной терапии, включая хирургическую резекцию опухолей, связанных с лучевой терапией и химиотерапией12. Комбинированная химиотерапия с цисплатином и пеметрексом показана для лечения большинства пациентов с диагнозом прогрессирующее локально инвазивное заболевание, которое не поддается хирургической резекции, или которые в противном случае не являются кандидатами на лечебную операцию13,14. Поэтому существует настоятельная необходимость в разработке более эффективных методов лечения пациентов СМП. Тем не менее, Есть несколько проверенных моделей in vivo животных, которые отражают клиническую релевантность MPM. Было разработано несколько моделей murine MPM, но большинство из них не подытожают сложные аспекты микросреды опухоли MPM15,16,17,18. Использование асбеста индуцированной MPM у мышей, генетически модифицированных моделей мыши MPM, или моделей сингенной трансплантации линий клеток Murine MPM ограничены фундаментальными фенотипическими и функциональными различиями и, следовательно, плохо переводят новые открытия в клинику. Другие доклинические модели Murine MPM в основном полагаются на подкожные или перитонеальные ксенотранспланты клеточных линий человека у иммунодефицитных мышей. Хотя эти модели легко контролировать и предоставлять фундаментальные данные, микроокружение этих ксенотрансплантатов не то, что сопоставимы с человеческими опухолями, ухудшающих трансляционную силу большинства из этих доклинических исследований17,19. И наоборот, ортотопические ксенотрансплантаты лучше отражают поведение опухоли пациента и ответ на лечение, поскольку они окружены аналогичной микросредой, как один найти в первоначальном сайте опухоли16.

Молекулярная визуализация по No18F'FDG-PET/CT является методом выбора продольно контролировать прогрессирование заболевания у пациентов с MPM20,21. Поэтому прибегая к этому неинвазивный метод визуализации, значительно способствует переводу доклинических исследований на клинические испытания16,22. Кроме того, это помогает уменьшить необходимое количество животных, как каждое животное представляет свой собственный контроль с течением времени.

В этой статье мы представляем надежную ортотопическую модель ксенотрансплантата MPM, полученную после инъекции клеточной линии MPM человека H2052/484 в плевральную полость агимических мышей. Эта модель, в сочетании с изображением No18F'FDG-PET/CT, является ценным и воспроизводимым методом изучения функциональных и механистических эффектов новых диагностических стратегий и методов лечения МПМ человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, описанные ниже, были утверждены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию и ветеринарным государственным отделением в Швейцарии (Authorization GE/106/16). Линия клеток MPM H2052/484 была создана и охарактеризована в нашей лаборатории как подробно описано в статье Colin DJ и и др.23. Кратко, H2052/484 клеточная линия была создана из грудной опухоли, полученной после интраплеуальной инъекции клеток NCI-H2052 (ATCC) в иммунодефицитных обнаженных мышей.

1. Экспериментальный дизайн

  1. Определить, сколько мышей необходимо в соответствии с экспериментом с помощью статистического расчета мощности (например, http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
  2. По крайней мере за неделю до имплантации, купить от восьми до десяти недель атгимических самок обнаженных мышей Foxn1nu nu/nu и разместить их в конкретных патоген-бесплатно (SPF) окружающей среды, по крайней мере неделю.

2. Подготовка клеток для имплантации

  1. Рассчитайте, сколько h2052/484 клеток необходимо, как каждая мышь вводится с 1 х 106 клеток (шаг 1.1). Подготовка дополнительного количества клеток, как инъекция на мышей будет включать в себя выборку шприца.
  2. Культура MPM H2052/484 клеточной линии в RPMI 1640 средних дополнен 10% (v/v) сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг /мЛ streptomycin в ткани культуры инкубатора на 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
  3. Культурные клетки для имплантации примерно до 80% слияния (7 х 106 клеток на 15 см чашку Петри).
  4. Около 1 ч до прививки, подготовить клетки.
  5. Откажитесь от носителей, вымойте клетки стерильными PBS без кальция и магния (10 мл на 15 см петри блюдо) и отсоедините клетки путем инкубации в течение 5 мин с 0,05% трипсин-2 мМ EDTA (2 мл на 15 см Петри блюдо).
  6. Соберите клетки в среде RPMI (10 мл на 15 см чашку Петри) и посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  7. Соберите соответствующее количество клеток для количества мышей, которые будут введены рассматривается как рассчитывается в соответствии с шагом 1.2.
  8. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин, мыть клеточные гранулы в 10 мл rpMI среды без FBS и центрифуги снова на 300 х г в течение 3 мин.
  9. Повторное приостановку клеток в соответствующем объеме среды RPMI без FBS до концентрации 1 х 106 ячеек на 50 Л, так как каждая мышь должна быть введена с объемом 50 зл.

3. Имплантация опухолевых клеток

  1. Перед имплантацией подготовьте анестезию системы и хирургической области в ламинаре потока капот путем распыления всех поверхностей с дезинфицирующим средством. Подготовка стерильных или дезинфицированных поставок в ламинаре потока капот, включая анестезию системы, нагревательная площадка для поддержания температуры тела мыши, поливидон йод ный раствор, 30 G Гамильтон шприц (например, 705RN шприц, 30 G иглы-20 мм-точка стиль 4), стерильная марля и ватные тампоны, стерильные одноразовые скальпели и хирургические инструменты, стерильные микропипеты и наконечники.
  2. Храните и откройте микроизолированные SPF-клетки в дезинфицируемом капоте потока и анестезируйте одну мышь за другой в соответствии со скоростью прививки. Длительность прививки составляет около 5-10 мин для экспериментированных техников.
  3. Анестезируйских мышей, вызывая первый с 4-5% изолюран. Затем поддерживать под наркозом на грелке при прививке с 3% изолюран. Определить глубину анестезии при потере рефлекса высыхания мышью.
  4. После того, как мышь анестезируется, вводят подкожно 0,05 мг/кг бупренорфин в качестве обезболивающее/послеоперационное обезболивание.
  5. Поместите мышь на правой стороне (правый боковой decubitus) на грелку.
  6. Очистите хирургическую область с раствором йода поливидона и сделать 5 мм разрез кожи и очистить окружающие жир и мышцы тупыми ножницами, чтобы разоблачить ребра.
  7. Гомогенизировать суспензию клеток в концентрации 1 х 106 ячеек на 50 Л среды RPMI без FBS и загрузить 50 зл. Избегайте пузырьков воздуха и протрите иглу 70% алкоголя, чтобы избежать неортотопической прививки клеток. Гомогенизировать суспензию клетки перед каждой инъекцией.
  8. Медленно впрысните клетки в плевральную полость между6-м и7-м ребрами с углом 30 "и глубиной 2-3 мм только под межреберными мышцами. Убедитесь в том, чтобы не вводить в легкие, сохраняя иглу только под ребрами. Игла должна быть видна прозрачностью через мышцы(Рисунок 1А).
  9. Закройте рану тремя-четырьмя абсорбируемыми швами.
  10. Храните мышей в теплой среде, пока они не проснутся.
  11. На следующий день после, повторить бупренорфин инъекции. Мониторинг мышей в соответствии с экспериментальной конструкцией и разрешением.

4. No18F'FDG-PET/CT Imaging

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные ниже, должны быть одобрены местными объектами размещения животных и визуализации. Убедитесь, что радиоактивные материалы импортируются, хранятся и обрабатываются в соответствии с местными правилами радиационной безопасности (например, деятельность по складских растворов, обработка защитного капота). Условия SPF могут быть сохранены путем манипулирования животных в ламинарном капоте потока и путем загрузки их в SPF-совместимую кровать сканера(рисунок 1B, C).

  1. Мониторинг развития опухоли, выполняя ПЭТ/КТ-изображение, один раз в неделю, начиная с 7-го дня после имплантации клеток H2052/484. Каждое животное представляет свой собственный контроль с течением времени.
  2. Избегайте бедствия животных до изображения путем транспортировки мышей для визуализации жилья объекта, если имеются или держать их близко к объекту.
  3. Быстрые мыши на 12-16 ч до18F'FDG-PET/CT, который уменьшает фоновые сигналы. См. Fueger24, который описал влияние обработки животных на18F'FDG-PET/CT..
  4. Обеззараживание и хранение мышей кровать в соответствии с местными правилами.
  5. Запись все времена измерения радиоактивности, инъекции и ПЭТ-сканирования, чтобы иметь возможность вычислить внедорожники.
  6. Предварительно разогретые мыши при температуре 30 градусов по Цельсию в течение 30 мин до инъекции18F-FDG, что уменьшает коричневый жировой ткани (BAT) метаболизма. Например, предварительно подогреть в отопительных камерах, с помощью грелковых колодок или с помощью инфракрасных ламп.
  7. Приготовьте 3-4 МБК дозы18F-FDG из запасного раствора в 150-200 л сольника в 1 мл инсулиновых шприцев с помощью калибратора дозы. Инсулинш имеет то преимущество, что почти нет мертвого объема и может избежать измерения оставшейся активности после инъекции.
  8. Анестезируйских мышей с изофлураном, как описано в шаге 3.3. Взвешивать мышей, а затем вводить внутривенно 3-4 MBq18F'FDG. Ретро-орбитальной инъекции является методом выбора, поскольку это быстро, легко и позволяет избежать проблем ы впрыска хвостовой вена или задержки поглощения интраперитонеальной инъекции.
  9. После инъекции, оставьте мышей спать в течение 45 минут в своих клетках в теплых условиях, инициированных в шаге 3.5. Продолжительность поглощения18ФЗФГ составляет 1 ч; 15 мин, как правило, достаточно, чтобы загрузить мышей на кровать и выполнить КТ до ПЭТ.
  10. Анестезируйских мышей с изофлураном, как описано в шаге 3.3 и загрузить их на кровать сканера(Рисунок 1B).
  11. Перенесите кровать к сканеру и подвергните животных КТ по центру легких. Приобретайте скана на 80 кВт, 160 qA, 1024 проекции во время вращения 360 ", с полем зрения 74 мм (1,6x увеличение, пример Триумф приобретения) (Рисунок 1C).
  12. Переместите кровать в подсистему ПЭТ и начните приобретение 1 ч после инъекции18F'FDG в течение 15 минут. С большинством ПЭТ/ КТ систем, кровать может быть перемещена автоматически из КТ в ПЭТ держать FOV по центру на той же области.
  13. Удалить мышей из камеры изображения и позволить им восстановить в клетке.
  14. Держите мышей в области, посвященной радиоактивному распаду в соответствии с местными правилами.

5. Анализ18F'FDG-PET/CT сканирования

  1. Реконструкция КТ,3, выполненная в условиях, упомянутых выше, с матрицей 512 и размером с воксель 0,144 мм (алгоритм фильтровальной обратной проекции-FBP, встроенное программное обеспечение). Реконструкция ПЭТ-сканирования с помощью 20 итераций упорядоченного алгоритма ожидания подмноза Максимум-3 Размер-OSEM3D. Калибровать изображения в Bq/mL, сканируя фантомный цилиндр. Автоматически регистрируйте КТ и ПЭТ-сканирование в соответствии со встроенным программным решением.
  2. Анализ объемов легких с помощью аналитического программного обеспечения(Таблица материалов).
    1. Загрузите данные КТ в качестве ссылки(Ref), нажав на значок Open Data. Затем загрузите ПЭТ-данные в качестве ввода(Inp1), нажав на значок данных приложения.
    2. Отрегулируйте цветовые весы ("WL") КТ и ПЭТ, чтобы контрастировать изображения для визуального осмотра.
    3. Выберите 3D ROI Tool из выпадающего меню, нажмите на Добавить roI и назовите файл легких. Нажмите на алгоритмы сегментации (ru) Соседство Порогинг. Определите вход как фон и изображение как Ref. Введите Мин и Макс в соответствии с мышью значения плотности легких, как правило, -800 и -300 HU. Проинспектировать 3D оказанные легкие, нажав на значок vtk и получить объем в таблице, генерируемой, нажав на значок Таблицы Показать.
  3. Проанализируйтепоглощение 18F'FDG в опухолях, извлекая максимальные стандартные значения поглощения (SUVmax).
    1. Преобразуйте ПЭТ-изображения, откалиброванные в Bq/mL для внедорожника, выбрав арифметику из выпадающего меню, затем Scalar Multiply и используйте inp1 как Выбранный и Scalar - Bq/mL для фактора внедорожника, рассчитанного как последующий: SUV q (Bq/mL)/(впрыскаемая доза (Bq)/вес тела(g)).
    2. Выберите 3D ROI Tool из выпадающего меню, нажмите на Добавить ROI и назовите файл Опухоли. Нажмите на режим 3D краски (ru) Сфера. Uncheck 2D только. Отрегулируйте размер формы и окружите опухоли. Убедитесь в том, чтобы не включать каких-либо помех сигналов, поступающих от сердца, например. Получить значение SUVmax в таблице, генерируемой нажатием на значок таблицы Show.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ортотопическая модель H2052/484
Ортотопические модели MPM путем внутриторакальной инъекции культивированных раковых клеток, особенно H2052/484 клеток относительно легко настроить. Различные шаги, описанные выше, требуют только скромных знаний клеточной культуры, и этапы операции доступны для умеренно обученных экспериментаторов животных. Обнаженные мыши и клетки должны манипулировать в стерильных условиях, чтобы максимизировать результат ы имплантаций. Тщательно следуя этому протоколу, который включает в себя короткую анестезию и минимальную операцию, мы столкнулись только с 1 смертью среди 266 мышей, вводимых с различными линиями клеток MPM. Пневмоторакс или внутрилегочная имплантация опухолевых клеток не наблюдались среди этих 266 мышей, тщательно вводили, как описано. В частности, скорость развития ортотопической опухоли клеточной линии H2052/484 высока, так как у 93,8% инъекционных мышей развились опухоли (n No 118). Опухоли H2052/484 могут быть обнаружены с помощью ПЭТ/КТ-изображения с 14 дней после инъекции, а средняя продолжительность эксперимента в соответствии с нашими критериями конечной точки составила 31 день в репрезентативном эксперименте21. Как мы описали в этом другом исследовании21, опухоли были локализованы в грудной полости, свободно распределены или прикреплены на легкие, грудные мышцы, аортальной арки или нижней полы вены. Метастаза не найдена.

Мониторинг MPM по изображению No18F'FDG-PET/CT
Ортотопические MPM еженедельно отслеживались комбинированными ПЭТ/КТ-изображениями с широко используемым радиотрейстомNo 18ФЗФГ, который накапливается в высокометаболических опухолях. Продольная анатомическая кт-сканирование позволила визуализировать влияние развития MPM на морфологию легких. Автоматическая сегментация высоко контрастных легких на КТ проста из-за их низкой плотности по сравнению с окружающими тканями. 3D визуализации дают обзор локализации опухолей и продольных объемов легких могут быть извлечены(рисунок 2A). Измерения объемов легких по КТ значительно снизились с течением времени после инъекции MPM мышей с интраплеural (ipl) H2052/484 опухолей(рисунок 2B). Действительно, опухоли MPM растут внутри плевральной полости и создают давление на легкие, уменьшая их объемы. Анализ корреляции показал, что объемы легких были обратно коррелированы с временем мониторинга с коэффициентом определения R2 0,8(рисунок 2С). В целом, эти данные показывают надежность КТ для мониторинга развития этой модели MPM.

В сочетании с КТ, сканирование No18FDG-PET предоставляет дополнительную и ценную информацию о метаболическим состоянии опухолей MPM. Хотя иногда это может быть сложно интерпретировать КТ и ПЭТ-сканирования изображения сами по себе, особенно в ранние моменты времени, сочетание обоих условий дает дополнительную надежность для диагностики. Действительно, представитель продольный мониторинг18F'FDG-PET/CT, выполненный между 10 днями и 44 днями мыши с опухолями ipl H2052/484, показывает, что опухоли начинают быть различимыми через 2 недели после прививки(рисунок 3А). Этот пример подчеркивает рост иno 18F'FDG жадность опухолей, расположенных на периферии грудной полости и вдоль сердца большие сосуды (белые стрелки). 18ФЗ Поглощение FDG в опухолях было количественно путем извлечения внедорожникмакс в ROIs обращается над опухолями, с помощью КТ, и показывает значительное время зависит от их метаболизма глюкозы (Рисунок 3B). Анализ корреляции показал, чтомакс внедорожника положительно коррелировал со временем мониторинга с коэффициентом определения R2 0,7(рисунок 3С). Эти данные свидетельствуют о надежности сканирования18F'FDG-PET для мониторинга судьбы ортотопических опухолей H2052/484. Наконец, объемы легких ижадность 18FDG, соответственно, проанализированные КТ и ПЭТ, коррелируют друг с другом с R2 из 0,6, поддерживающих силу этих измерений для изучения развития ортотопических опухолей MPM (Рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1: Обнаженная модель ортотопического ксенотранспланта мыши. (A) Интраплеурная (ipl) инъекция клеток МПМ человека в левую плевральную полость, как описано в разделе протокола. (B, C) Мыши обезврежены и загружаются в ПЭТ/КТ в ламинарном капюшоне потока, а затем передаются на сканер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Рост опухоли ортотопической модели H2052/484 MPM, контролируемой КТ. (A) Представитель 3D реконструкции КТ показаны H2052/484 MPM IPL опухолей и их влияние на объем легких (Vp) в разное время в течение нескольких дней после имплантации. Белые наконечники стрел показывают расположение опухолей MPM ipl. (B) Скрипичный сюжет, показывающий репрезентативный курс времени объемов легких (VL),n No 6. Показаны односторонние тесты ANOVA с несколькими статистическими данными сравнения Tukey. Письма указывают значительные различия между моделями с a, b, c, d, e, f, указывая соответственно D10, D16, D23, D29, D36 и D44. Соответствующие значения p: x, p zlt; 0.05; хх, р Злт; 0,01; xxx, стр. 0.001; xxxx, стр. (C) Корреляция между уменьшением объема легких, связанных с ipl MPM развития и время после инъекции. Линейная регрессия построена как толстая цветная линия и связанная с ней SD как пунктирные черные линии. Графики и статистические анализы проводились с помощью программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Опухолевый метаболизм модели IPL MPM, за которым следуетNo 18F'FDG-microPET/CT. (A) Представитель ПЭТ / КТ сканирует показаны Опухоли MPM IPL. На изображениях ПЭТ/КТ показаны трансосевые фрагменты области грудной клетки, содержащие опухоли No18F'FDG-avid, а КТ (серая шкала) обеспечивает анатомическую информацию и ПЭТ (откалиброванная псевдоцветная шкала), показывающая расположение и интенсивность использования высокой опухоли и глюкозы органов. Указано послеинъекционные дни. КТ: КТ медиастинальное окно; 18ФЗ FDG-PET/CT: слитое изображение ПЭТ и КТ. Белые наконечники стрел показывают опухоли MPM ipl. Л и легкое, H и сердце, BAT и коричневая жировая ткань. (B) Скрипка участок, показывающий представительный курс временивнедорожникмакс связан с метаболизмом MPM, n No 6. Показаны односторонние тесты ANOVA с несколькими статистическими данными сравнения Tukey. Письма указывают значительные различия между моделями с a, b, c, d, e, f, указывая соответственно D10, D16, D23, D29, D36 и D44. Соответствующие значения p: x, p zlt; 0.05; хх, р Злт; 0,01; xxx, стр. 0.001; xxxx, стр. (C) Корреляция между увеличениеммакс внедорожника в IPL Опухоли MPM и время после инъекции. Линейная регрессия построена как толстая цветная линия и связанная с ней SD как пунктирные черные линии. Графики и статистические анализы проводились с помощью программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Корреляция между развитием MPM контролируется объемом легких и метаболической активностью опухоли. Корреляция между suvmax и объемом легких (VL) отображается как линейная регрессия, построенная как толстая цветная линия и связанная с ним SD как пунктирные черные линии. Графики и статистические анализы проводились с помощью программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье описывается оригинальная ортотопическая модель клеток MPM H2052/484, впрыскиваемых в плевральную полость агимических мышей, и метод мониторинга с помощью изображения ПЭТ/КТ у мелких животных. Эта модель может быть реализована с умеренной обработки животных и хирургии навыки и отображает очень хороший уровень развития. Это позволяет большое экспериментальное окно около 10 недель в необработанных мышей и неинвазивного продольного обнаружения опухолей уже через 2 недели после инъекции.

Ортотопические модели полагаются на имплантацию живых клеток или тканей непосредственно в исходную среду опухоли. Основное различие между широко используемыми подкожными или интраперитонеальными моделями MPM и интрафлеурными моделями заключается в их микроокружении. Действительно, микроокружение опухолей содержит несколько типов стромальных клеток (фибробласты, лейкоциты, макрофаги) в дополнение к раковым клеткам25. Эти стромальные клетки выделяют факторы роста и цитокины, способствующие микросреде опухоли, которая модулирует рост опухоли. Микроокружение опухоли меняет с анатомическим местом предлагая что orthotopic xenograft будет превратиться и ответить по-разному к обработке чем subcutaneous одно25. Поэтому, как ортотопические ксенотрансплантаты окружены сопоставимой микросреды, что найти у пациентов MPM, их поведение и ответ на лечение должны лучше отражать клиническую ситуацию17,19.

Многие доклинические модели в исследованиях рака вовлекают иммунодефицитных мышей, чтобы обеспечить успех ксенотрансплантата человека. Обнаженные мыши не обладают зрелым тимусом и не имеют жизненно важной части опухолевой микросреды26. Хотя обнаженные мыши не обладают зрелым тимусом и, следовательно, недостаточно в Т-клеток, они представляют зрелые лимфоциты B, нейтрофилов, моноцитов и макрофагов в их плевральной микросреды в отличие от более вседозволенных и крайне недостаточным SCID мышей26. На ранних стадиях разработки MPM регуляторные Т-клетки играют важную супрессивную роль. Однако на более поздних стадиях миелоидные клетки, включая нейтрофилы и макрофаги, заменяют клетки Трега; в этой функции, подавляющая роль регуляторных Т-клеток имеет важное значение только на ранних стадиях развития MPM23,27. Следовательно, хотя исследования, связанные с полным иммунным ответом (например, иммунотерапия с участием T ответ) не могут быть изучены в модели, представленной здесь, мы постулат, что эта ортотопическая модель сохраняет весь свой интерес для оценки новых методов лечения или новых диагностических инструментов MPM.

В методологической точки зрения, Есть критические шаги, чтобы иметь в виду, чтобы максимизировать развитие интрафлеурных опухолей MPM. До создания моделей мышей, иметь доступ к экспоненциально растущих клеток (менее 80% конфлюкс, в зависимости от клеточных линий) и от 8 до 10 месяцев акклиматизированных мышей. Действительно, инъекционные молодых маленьких мышей трудно и может привести к внематочной инъекции и изменить выживание. Во время процедуры имплантации следует принимать стандартные меры предосторожности, и при обрезке следует использовать тупые ножницы, чтобы избежать кровотечения, что может привести к смерти животных. Выбор шприца (например, описанная здесь модель) и представленный здесь протокол позволяют точно и щадящий инъекцию небольшого объема среды, содержащей опухолевые клетки, обеспечить интрафлеуральную инъекцию (угол 30 градусов, глубина 2-3 мм).

Продольное наблюдение ортотопических моделей MPM может выполняться неинвазивно только с помощью техники визуализации. ПЭТ / КТ является рекомендуемый метод в клинической практике для диагностики MPM и, следовательно, был использован в этом исследовании20,21. По сравнению с широко используемым оптическим изображением, ПЭТ/КТ-изображения включает в себя использование радиоактивных соединений и, следовательно, более деликатный для установки из-за безопасности, логистики радиотрассеров и его стоимость28. Тем не менее, ПЭТ/КТ-изображение не опирается на генетическую модификацию опухолевых клеток и обеспечивает томографическую, анатомическую и молекулярную информацию с высоким разрешением. Оптическая визуализация также быстрее, чем ПЭТ / КТ, но система визуализации, представленная в этой статье включает в себя 3-мышей кровать и около 20 мышей могут быть отсканированы в день, что является разумной пропускной однако, учитывая собранную информацию. Использование высокодоступного клинического радиотрейра No18F'FDG гарантирует высокую трансляционную силу для исследований, выполненных с помощью этой техники29. Несмотряна то, что показания и анализы f'FDG-PET могут потребовать некоторого опыта из-за высокого поглощения в окружающих тканях сердца и коричневого жирового уличения, его сочетание с КТ уточняет диагностику. Во время18экспериментов по ПЭТ/КТ, натощак и потепление мышей, а также выполнение времени поглощения18ФЗФГ 1 ч может значительно повысить визуализацию опухолей, так как условия сканирования сильно влияют на КОНТРАСТы ПЭТ, как уже описано24. Дальнейшие исследования по доклиническим ортотопическим моделям с участием других клинически используемых радиотрейдеров, таких как No18Фюророттимидин (ФЛТ) илиNo 18Фторомизонидазол (FMISO), который отслеживает пролиферацию и гипоксию соответственно, могли бы предоставить более подробную информацию о таких надежных ортотопических моделях MPM29.

Наконец, эта соответствующая переводческая модель в сочетании с неинвазивной визуализации идеально в соответствии с концепцией 3R: Rвоспитывать количество животных, Refine, чтобы уменьшить боль и дискомфорт и Replace животных экспериментов с альтернативами22. Действительно, в рамках одного и того же набора животных, терапевтическое наблюдение и ответ может контролироваться неинвазивно позволяет продольных измерений на протяжении экспериментов, тем самым уменьшая количество животных, необходимых для эксперимента. Кроме того, поскольку каждое животное представляет свой собственный контроль с течением времени, неинвазивная визуализация также значительно увеличивает статистическую мощность, уменьшая количество необходимых животных для получения надежных данных16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось Ligue Genevoise contre le Cancer (в V.S.-B.) и Центром биомедицинской визуализации (CIBM) университетов и больниц в Петербурге и Лозанне (в D.J.C., O.B. и S.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-mice bed Minerve bed for mice imaging
Athymic Nude-Foxn1n nu/nu Envigo, Huntingdon, UK 6907F immunodeficient mouse
Betadine Mundipharma Medical Company, CH 111131 polyvidone iodine solution
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 14190094 Buffer for cell culture
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Pasching, Austria A15-101 cell culture medium supplement
Insulin syringes BD Biosciences, San Jose, CA, USA 324826 syringe for cell injection
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122 antibiotics for cell culture medium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 61870010 basal cell culture medium
Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) Alloga SA, CH 700320 opioid analgesic product
Triumph PET/SPECT/CT Trifoil, Chatsworth, CA, USA imaging equipment
Trypsin ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 25050014 enzymatic cell dissociation buffer
Virkon S 2% Milian, Vernier, CH 972472 disinfectant
Vivoquant Invicro, Boston, MA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
  2. Mossman, B. T., Gee, J. B. Asbestos-related diseases. The New England Journal of Medicine. 320 (26), 1721-1730 (1989).
  3. Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
  4. Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
  5. LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
  6. Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
  7. Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
  8. Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
  9. Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
  10. Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
  11. Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A. Malignant mesothelioma. The Lancet. 366 (9483), 397-408 (2005).
  12. Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
  13. Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
  14. Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
  15. Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
  16. de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
  17. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  18. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
  19. Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
  20. Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
  21. Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
  22. MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
  23. Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
  24. Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
  25. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
  26. Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
  27. Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
  28. James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
  29. Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 154 Рак Плеура Мезотелиома Ортотопическая ксенотрансплантация Агмичная мышь Неинвазивная визуализация ПЭТ/КТ
Имплантация и мониторинг ПЭТ/КТ ортотопической модели плевральной мезотелиомы человека у атимических мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, D. J., Bejuy, O., Germain,… More

Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice. J. Vis. Exp. (154), e60272, doi:10.3791/60272 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter