Summary
Cet article décrit la génération d'un modèle orthotopic de souris du mésothéliome pleural humain par l'implantation des cellules de mésothéliome de H2052/484 dans la cavité pleurale des souris athymiques immunocompromised. La surveillance longitudinale du développement des tumeurs intrapleural a été évaluée par la tomographie multimodal non-invasive[18F]-2-fluoro-2-deoxy-deoxy-D-glucose positron et la formation image de tomographie calculée.
Abstract
Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur rare et agressive surgissant dans le mésothélium qui couvre les poumons, le coeur, et la cavité thoracique. Le développement de MPM est principalement associé à l'amiante. Les traitements n'assurent qu'une survie modeste puisque la moyenne médiane de survie est de 9 à 18 mois à partir du moment du diagnostic. Par conséquent, des traitements plus efficaces doivent être identifiés. La plupart des données décrivant de nouvelles cibles thérapeutiques ont été obtenues à partir d'expériences in vitro et doivent être validées dans des modèles précliniques in vivo fiables. Cet article décrit un tel modèle orthotopic fiable de MPM obtenu après injection d'une ligne humaine de cellules de MPM H2052/484 dans la cavité pleurale des souris athymiques immunodeficient. La transplantation dans le site orthotopic permet d'étudier la progression de la tumeur dans l'environnement naturel in vivo. La tomographie par émission de positrons/tomographie calculée (TEP/TC) imagerie moléculaire utilisant le radiotracer clinique [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]FDG) est la méthode de diagnostic de choix pour l'examen des patients atteints de MPM. En conséquence, [18F]FDG-PET/CT a été employé pour surveiller longitudinalement la progression de la maladie du modèle orthotopic de H2052/484. Cette technique a un potentiel 3R élevé(Réduquant le nombre d'animaux, Refine pour diminuer la douleur et l'inconfort, et Replace expérimentation animale avec des alternatives) puisque le développement de la tumeur peut être surveillé non-invasivement et le nombre d'animaux requis pourrait être considérablement réduite.
Ce modèle affiche un taux de développement élevé, une croissance tumorale rapide, est rentable et permet une traduction clinique rapide. En utilisant ce modèle orthotopic de xénogreffe MPM, les chercheurs peuvent évaluer des réponses biologiques d'un modèle fiable de MPM suivant des interventions thérapeutiques.
Introduction
Le mésothéliome pleural malin (MPM) est un cancer le plus souvent associé à l'exposition aux fibres d'amiante1,2,3. Bien que l'amiante a été interdit dans la plupart des pays occidentaux4,5,6, l'incidence de MPM est encore en augmentation de7,8. Récemment, l'exposition des souris aux nanotubes de carbone suggère qu'ils peuvent entraîner un risque important pour la santé chez l'homme9,10. Les données suggèrent que l'exposition à ces produits puisse induire l'inflammation chronique et les changements moléculaires (par exemple, perte des voies de tumeur-suppresseur) qui sous-tendent la progression au mésothéliome malin. À l'heure actuelle, les nanotubes de carbone multimurs sont l'un des produits les plus importants de la nanotechnologie et sont de plus en plus incorporés dans divers produits tels que les composites, les matériaux de stockage d'énergie, la médecine, l'électronique et les matériaux d'assainissement de l'environnement.
MPM est un cancer avec le pronostic pauvre, et la plupart des patients meurent dans les deux ans après diagnostic dû à une efficacité limitée des modalités actuelles de traitement11. Le choix du traitement pour MPM dépend du stade du cancer. Pour la plupart des MPM à un stade précoce (stade 1 et peut-être quelques tumeurs de stade 2 ou 3), l'approche clinique est une thérapie multimodale comprenant la résection chirurgicale des tumeurs, associée à la radiothérapie et à la chimiothérapie12. Une chimiothérapie combinée avec le cisplatine et le pemetrexed est indiquée pour le traitement de la plupart des patients diagnostiqués avec la maladie localement invasive avancée, qui n'est pas favorable à la résection chirurgicale, ou qui autrement ne sont pas des candidats pour la chirurgie curative13,14. Il est donc urgent de développer des traitements plus efficaces pour les patients atteints de MPM. Cependant, il y a peu de modèles animaux in vivo validés qui reflètent la pertinence clinique de MPM. Plusieurs modèles murine MPM ont été développés, mais la plupart d'entre eux ne récapitulent pas fidèlement les aspects complexes de la tumeur MPM microenvironnement15,16,17,18. L'utilisation de MPM induite par l'amiante chez la souris, les modèles de souris Génétiquement modifiés ou les modèles de transplantation syngénique des lignées cellulaires murines mpm sont limités par des différences phénotypiques et fonctionnelles fondamentales et, par conséquent, traduisent mal de nouvelles découvertes à la clinique. D'autres modèles précliniques de MPM murine s'appuient principalement sur les xénogreffes sous-cutanées ou péritonéales des lignées cellulaires humaines chez les souris immunodéficientes. Bien que ces modèles soient faciles à surveiller et à fournir des données fondamentales, le microenvironnement de ces xénogreffes n'est pas comparable aux tumeurs humaines qui altèrent la puissance translationnelle de la plupart de ces études précliniques17,19. Inversement, les xénogreffes orthopiques reflètent mieux le comportement et la réponse de tumeur patiente au traitement car ils sont entourés d'un microenvironnement semblable à celui trouvé dans le site de tumeur original16.
L'imagerie moléculaire par [18F]FDG-PET/CT est la méthode de choix pour surveiller longitudinalement la progression de la maladie chez les patients atteints de MPM20,21. Par conséquent, le recours à cette méthode d'imagerie non invasive favorise grandement la traduction des études précliniques aux essais cliniques16,22. En outre, il contribue à réduire le nombre requis d'animaux car chaque animal représente son propre contrôle dans le temps.
Dans cet article, nous présentons un modèle orthotopic fiable de xénograft MPM obtenu après injection de la ligne humaine de cellules de MPM H2052/484 dans la cavité pleurale des souris athymiques. Couplé à [18F]FDG-PET/CT imaging, ce modèle est une méthode précieuse et reproductible pour étudier les effets fonctionnels et mécanistes de nouvelles stratégies diagnostiques et traitements pour la MPM humaine.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux et par le bureau d'État vétérinaire de Genève, En Suisse (Autorisation GE/106/16). La lignée cellulaire MPM H2052/484 a été établie et caractérisée dans notre laboratoire comme détaillé dans l'article de Colin DJ et coll.23. En bref, la ligne cellulaire De2052/484 a été établie à partir d'une tumeur thoracique obtenue après une injection intrapleural des cellules DeNCI-H2052 (ATCC) chez des souris nues immunodéficientes.
1. Conception expérimentale
- Déterminer combien de souris sont nécessaires selon l'expérience à l'aide du calcul statistique de la puissance (p. ex. http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
- Au moins une semaine avant l'implantation, achetez des souris nues femelles athymiques de huit à dix semaines Foxn1nu nu/nu et hébergez-les dans un environnement spécifique-pathogène-libre (SPF) pendant au moins une semaine.
2. Préparation des cellules pour l'implantation
- Calculez le nombre de cellules H2052/484 nécessaires à l'injection de 1 x 106 cellules (étape 1.1). Préparer un nombre supplémentaire de cellules comme injection à des souris impliquera l'échantillonnage de seringues.
- Culture la lignée cellulaire MPM H2052/484 dans le milieu RPMI 1640 complétée par 10 % (v/v) sérum bovin fœtal (FBS), 100 unités/pénicilline mL et 100 oG/mL de streptomycine dans un incubateur de culture tissulaire à 37 oC avec 5 % de CO2.
- Cellules de culture pour l'implantation à environ 80% de confluence (7 x 106 cellules par plat Petri de 15 cm).
- Environ 1 h avant la greffe, préparer les cellules.
- Jeter les médias, laver les cellules avec du PBS stérile sans calcium et magnésium (10 ml par plat Petri de 15 cm) et détacher les cellules en coucuba pendant 5 min avec 0,05 % de trypsine-2 mM EDTA (2 ml par plat Petri de 15 cm).
- Recueillir les cellules dans le milieu RPMI (10 ml par plat Petri 15 cm) et compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
- Recueillir le nombre approprié de cellules pour le nombre de souris à injecter en considérant que calculé selon l'étape 1.2.
- Centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min, laver la pastille cellulaire dans 10 ml de milieu RPMI sans FBS et centrifugeuse à nouveau à 300 x g pendant 3 min.
- Resuspendre les cellules dans un volume approprié de milieu RPMI sans FBS à une concentration de 1 x 106 cellules par 50 L car chaque souris doit être injectée avec un volume de 50 l.
3. Implantation de cellules tumorales
- Avant l'implantation, préparer le système d'anesthésie et la zone chirurgicale dans une hotte à écoulement laminaire en pulvérisant toutes les surfaces avec un désinfectant. Préparer des fournitures stériles ou désinfectées dans le capot à débit laminaire, y compris le système d'anesthésie, le coussin chauffant pour maintenir la température du corps de la souris, la solution d'iode de polyvidone, une seringue Hamilton de 30 G (p. ex., seringue 705RN, 30 G aiguille-20 mm-Point Style 4), gaze stérile et coton swabs, scalpels jetables stériles et instruments de chirurgie et micropipettes et pointes stériles.
- Gardez et ouvrez les cages de FPS microisolées dans le capot d'écoulement désinfecté et anesthésiez une souris après l'autre en fonction de la vitesse de greffe. La durée de greffe est d'environ 5 à 10 minutes pour les techniciens expérimentés.
- Anesthésiez les souris en induisant d'abord avec 4 à 5 % d'isoflurane. Ensuite, maintenir sous anesthésie sur le coussin chauffant tout en greffant avec 3% isoflurane. Déterminer la profondeur de l'anesthésie par la perte du réflexe de redressement par la souris.
- Une fois qu'une souris est anesthésiée, injectez sous-cutanée0te 0,05 mg/kg de buprénorphine comme analgésique/soulagement de la douleur postopératoire.
- Placer la souris sur le côté droit (décubitus latéral droit) sur le coussin chauffant.
- Nettoyez la zone chirurgicale avec une solution d'iode de polyvidone et faites une incision de 5 mm de la peau et éclaircissez la graisse et les muscles environnants avec des ciseaux émoussés pour exposer les côtes.
- Homogériser la suspension cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules par 50 oL de milieu RPMI sans SFB et charger 50 ll de la suspension avec la seringue Hamilton. Évitez les bulles d'air et essuyez l'aiguille avec 70% d'alcool pour éviter la greffe non orthotopique des cellules. Homogénéiser la suspension cellulaire avant chaque injection.
- Injectez lentement les cellules dans la cavité pleurale entre les côtes de 6e et 7e avec un angle de 30 et une profondeur de 2-3 mm juste sous les muscles intercostaux. Assurez-vous de ne pas injecter dans les poumons en gardant l'aiguille juste sous les côtes. L'aiguille doit être visible par transparence à travers les muscles (Figure 1A).
- Fermez la plaie avec trois à quatre sutures absorbables.
- Conservez les souris dans un environnement réchauffé jusqu'à ce qu'elles se réveillent.
- Le lendemain, répétez l'injection de buprénorphine. Surveiller les souris selon la conception et l'autorisation expérimentales.
4. [18F]FDG-PET/CT Imaging
REMARQUE: Toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être approuvées par les installations locales de logement et d'imagerie pour animaux. Assurez-vous que les matières radioactives sont importées, entreposées et manipulées conformément aux règles locales de sécurité en matière de rayonnement (p. ex., activité des solutions de stock, manutention de hotte blindée). Les conditions du FPS peuvent être maintenues en manipulant les animaux dans une hotte à débit laminaire et en les chargeant dans un lit de scanner compatible SPF (Figure 1B, C).
- Surveiller le développement tumoral en imagerie TEP/CT, une fois par semaine, à partir du 7e jour après l'implantation des cellules H2052/484. Chaque animal représente son propre contrôle dans le temps.
- Évitez la détresse des animaux avant l'imagerie en transportant des souris jusqu'au logement des installations d'imagerie si elles sont disponibles ou en les maintenant près de l'installation.
- Souris rapides de 12 à 16 h avant [18F]FDG-PET/CT qui réduit les signaux de fond. Voir Fueger24 qui a décrit l'impact de la manipulation des animaux sur [18F]FDG-PET/CT scans.
- Décontaminer et entreposer le lit de souris selon les règles locales.
- Enregistrez toutes les périodes de mesures de doses de radioactivité, d'injections et de TEP pour être en mesure de calculer les VUS.
- Pré-chaud souris à 30 oC pendant 30 min avant l'injection de [18F]FDG qui réduit le métabolisme du tissu adipeux brun (BAT). Par exemple, réchauffez-vous dans les chambres chauffantes, en utilisant des coussins chauffants ou en utilisant des lampes infrarouges.
- Préparer des doses de 3 à 4 MBq de [18F]FDG à partir d'une solution de stock dans 150-200 l de seringues à insuline de 1 ml à l'aide d'un étalonneur à dose. Les seringues à insuline ont l'avantage de n'avoir presque pas de volume mort et pourraient éviter la mesure de l'activité restante après l'injection.
- Anesthésiez les souris avec l'isoflurane tel que décrit à l'étape 3.3. Pesez les souris, puis injectez par voie intraveineuse 3 à 4 MBq [18F]FDG. L'injection rétro-orbitale est une méthode de choix car elle est rapide, facile et évite les problèmes d'injection de veine de queue ou l'adoption retardée de l'injection intrapéritonéale.
- Après l'injection, laisser les souris éveillées pendant 45 min dans leurs cages dans les conditions chaudes initiées à l'étape 3.5. La durée de [18F]FDG prise est de 1 h; 15 min sont normalement suffisants pour charger des souris sur le lit et effectuer la ToMode usinée avant le PET.
- Anesthésiez les souris à l'isoflurane tel que décrit à l'étape 3.3 et chargez-les sur le lit du scanner (figure 1B).
- Transférer le lit au scanner et soumettre les animaux à un tomodensitomètre centré sur les poumons. Acquérir des scans à 80 kVp, 160 'A, 1024 projections au cours d'une rotation de 360 degrés, avec un champ de vision de 74 mm (1,6x grossissement, exemple d'acquisition de Triumph) (Figure 1C).
- Déplacez le lit vers le sous-système PET et commencez l'acquisition 1 h après [18F]FDG injection pour une durée de 15 min. Avec la plupart des systèmes PET/CT, le lit peut être déplacé automatiquement de la ToMode à la TEP pour garder le FOV centré sur la même zone.
- Retirez les souris de la chambre d'imagerie et laissez-les récupérer dans leur cage.
- Gardez les souris dans une zone dédiée à la désintégration radioactive selon les règles locales.
5. Analyses de [18F]FDG-PET/CT Scans
- Reconstruire les tomodensitomes effectuées dans les conditions mentionnées ci-dessus avec une matrice de 512 et une taille de voxel de 0,144 mm (algorithme de projection-FBP de retour filtré, logiciel intégré). Reconstruire les teP à l'aide de 20 itérations d'un algorithme D'attente sous-ensemble ordonné maximum-3 Dimension-OSEM3D. Calibrer les images dans Bq/mL en scannant un cylindre fantôme. Co-enregistrer automatiquement les tomodensitomes et TEP en fonction de votre solution logicielle intégrée.
- Analyser les volumes de poumons à l'aide du logiciel d'analyse (Tableau des matériaux).
- Chargez les données CT en référence (Ref) en cliquant sur l'icône Open Data. Ensuite, chargez les données PET en entrée (Inp1) en cliquant sur l'icône Données annexes.
- Ajuster les échelles de couleur (« WL ») de CT et de PET pour contraster les images pour l'inspection visuelle.
- Sélectionnez l'outil de retour sur investissement 3D dans le menu déroulant, cliquez sur Ajouter le retour sur investissement et nommez le fichier Poumons. Cliquez sur les algorithmes de segmentation Seuil de voisinage. Définir Input as Background and Image as Ref. Entrez Min et Max selon les valeurs de densité pulmonaire de la souris, généralement -800 et -300 HU. Inspectez les poumons rendus en 3D en cliquant sur l'icône vtk et récupérez le volume dans la table générée en cliquant sur l'icônede la table d'exposition .
- Analyser [18F]FDG prise dans les tumeurs en extrayant les valeurs standard maximales d'apprise (SUVmax).
- Convertir les images PET calibrées en Bq/mL en VUS en sélectionnant l'arithmétique dans le menu déroulant, puis Scalar Multiply et utiliser inp1 comme Sélectionné et Scalar est Bq/mL au facteur SUV calculé comme suit : SUV (Bq/mL)/(dose injectée (Bq)/body weight(g)).
- Sélectionnez l'outil de retour sur investissement 3D dans le menu déroulant, cliquez sur Ajouter le retour sur investissement et nommez le fichier Tumeurs. Cliquez sur le mode Peinture 3D Sphère. Décochez 2D seulement. Ajuster la taille de la forme et entourer les tumeurs. Assurez-vous de ne pas inclure les signaux d'interférence provenant du cœur par exemple. Récupérez la valeur SUVmax dans la table générée en cliquant sur l'icône de la table d'exposition.
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Representative Results
Le modèle orthotopic H2052/484
Les modèles orthotopiques de MPM par injection intra-thoracique des cellules cancéreuses cultivées, particulièrement les cellules h2052/484 sont relativement faciles à installer. Les différentes étapes décrites ci-dessus ne nécessitent que des connaissances modestes sur la culture cellulaire et les étapes de chirurgie sont accessibles aux expérimentateurs d'animaux modérément formés. Les souris nues et les cellules doivent être manipulées dans des conditions stériles afin de maximiser le résultat des implantations. En suivant attentivement ce protocole, qui implique une anesthésie courte et une chirurgie minimale, nous avons rencontré seulement 1 décès parmi 266 souris injectées avec différentes lignées cellulaires MPM. Aucun pneumothorax ou implantations intra-pulmonaires des cellules de tumeur n'a été observé parmi ces 266 souris soigneusement injectées comme décrit. Plus précisément, le taux de développement de tumeur orthotopique de la lignée cellulaire H2052/484 est élevé puisque 93,8 % des souris injectées ont développé des tumeurs (n - 118). Les tumeurs H2052/484 peuvent être détectées par imagerie TEP/CT à partir de 14 jours après l'injection et la durée médiane de l'expérience selon nos critères de point de terminaison était de 31 jours dans une expérience représentative21. Comme nous l'avons décrit dans cette autre étude21, les tumeurs ont été localisées dans la cavité thoracique, librement distribuées ou attachées sur les poumons, les muscles thoraciques, l'arc aortique ou le cava inférieur de veine. Les métastases n'ont pas été trouvées.
Surveillance MPM par [18F]FDG-PET/CT imaging
MPM orthotopic ont été surveillés chaque semaine par la formation image combinée de PET/CT avec le radiotracer largement utilisé [18F]FDG qui s'accumule dans les tumeurs fortement métaboliques. Les balayages anatomiques longitudiaux de CT ont permis de visualiser l'impact du développement de MPM sur la morphologie des poumons. La segmentation automatique des poumons fortement contrastés sur des balayages de CT est simple due à leur basse densité comparée aux tissus environnants. Les rendus 3D donnent un aperçu de la localisation des tumeurs et les volumes longitudinals des poumons peuvent être extraits (Figure 2A). Les mesures des volumes pulmonaires par CT ont diminué de manière significative au fil du temps après l'injection de MPM de souris avec des tumeurs intrapleural (ipl) H2052/484 (figure 2B). En effet, les tumeurs MPM se développent à l'intérieur de la cavité pleurale et créent des pressions sur les poumons, réduisant leurs volumes. Les analyses de corrélation ont démontré que les volumes pulmonaires étaient inversement corrélés au moment de la surveillance avec un coefficient de détermination R2 de 0,8 (figure 2C). Au total, ces données montrent la fiabilité de la tomodensitomètre pour surveiller le développement de ce modèle MPM.
Combiné avec CT, un balayage de [18F]FDG-PET fournit l'information supplémentaire et valable sur l'état métabolique des tumeurs de MPM. Alors que parfois il peut être compliqué d'interpréter cT et TEP scanne les images par eux-mêmes, en particulier aux premiers moments, une combinaison des deux modalités donne plus de robustesse au diagnostic. En effet, la surveillance longitudinale représentative [18F]FDG-PET/CT effectuée entre 10 jours et 44 jours d'une souris avec des tumeurs ipl H2052/484 montre que les tumeurs commencent à être distinguables 2 semaines après la greffe (Figure 3A). Cet exemple met en évidence la croissance et [18F]FDG avidité des tumeurs situées à la périphérie de la cavité thoracique et le long des grands vaisseaux du cœur (flèches blanches). [18F] L'absorption de FDG dans les tumeurs a été quantifiée en extrayant leSUV max dans les ROIs dessinés au-dessus des tumeurs, avec l'aide des balayages de CT, et montre des augmentations significatives de temps-dépendants de leur métabolisme de glucose (figure 3B). Les analyses de corrélation ont démontré que le VUSmax était positivement corrélé au moment de la surveillance avec un coefficient de détermination R2 de 0,7 (figure 3C). Ces données démontrent la fiabilité des balayages de [18F]FDG-PET pour surveiller le sort des tumeurs orthotopiques H2052/484. Enfin, les volumes pulmonaires et [18F]FDG avidité, respectivement, analysés par CT et PET, corrèlent les uns avec les autres avec un R2 de 0,6 soutenant la force de ces mesures pour étudier le développement des tumeurs orthotopic MPM (Figure 4).
Figure 1 : Modèle de xénogreffe orthotopic de souris nue. (A) Injection intrapleural (ipl) des cellules humaines de MPM dans la cavité pleurale gauche comme décrit dans la section de protocole. (B,C) Les souris sont anesthésiés et chargées dans le lit PET/CT dans une hotte à débit laminaire, puis transférées au scanner. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Croissance tumorale du modèle orthotopic H2052/484 MPM surveillé par CT. (A) Reconstructions 3D représentatives des balayages de CT montrant des tumeurs d'ipl de H2052/484 de MPM et leur effet sur le volume de poumon (Vp) à divers moments dans les jours après l'implantation. Les pointes de flèche blanches montrent l'emplacement des tumeurs ipl de MPM. (B) Plot de violon montrant un cours de temps représentatif des volumes de poumon (VL), n - 6. Le test ANOVA à sens unique avec les statistiques de comparaisons multiples de Tukey est indiqué. Les lettres indiquent des différences significatives entre les modèles avec a, b, c, d, e, f indiquant respectivement D10, D16, D23, D29, D36 et D44. Valeurs p correspondantes : x, p 'lt; 0.05; xx, p 'lt; 0.01; xxx, p 'lt; 0.001; xxxx, p 'lt; 0.0001. (C) Corrélation entre la diminution du volume pulmonaire liée au développement de MPM ipl et le temps après l'injection. La régression linéaire est tracée comme une ligne colorée épaisse et SD connexe en tant que lignes noires pointillées. Des graphiques et des analyses statistiques ont été réalisés avec un logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Métabolisme tumoral du modèle ipl MPM suivi de [18F]FDG-microPET/CT. (A) Les balayages représentatifs de PET/CT montrant des tumeurs ipl de MPM. Les images de PET/CT montrent des tranches trans-axiales de la zone thoracique contenant les tumeurs[18FDG-avid, avec CT (échelle grise) fournissant l'information anatomique et PET (échelle pseudo-couleur calibrée) montrant l'emplacement et l'intensité de l'utilisation élevée de glucose de tumeur et d'organe. Les jours de post-injection sont indiqués. CT: CT mediastinal fenêtre; [18F] FDG-PET/CT : image fusionnée des TEP et des tomodensitomes. Les pointes de flèche blanches montrent des tumeurs ipl de MPM. L - poumon, H et coeur, BAT et tissu adipeux brun. (B) Terrain de violon montrant un cours de temps représentatif de SUVmax lié au métabolisme MPM, n ' 6. Le test ANOVA à sens unique avec les statistiques de comparaisons multiples de Tukey est indiqué. Les lettres indiquent des différences significatives entre les modèles avec a, b, c, d, e, f indiquant respectivement D10, D16, D23, D29, D36 et D44. Valeurs p correspondantes : x, p 'lt; 0.05; xx, p 'lt; 0.01; xxx, p 'lt; 0.001; xxxx, p 'lt; 0.0001. (C) Corrélation entre l'augmentation duSUV max dans les tumeurs ipl MPM et le temps après l'injection. La régression linéaire est tracée comme une ligne colorée épaisse et SD connexe en tant que lignes noires pointillées. Des graphiques et des analyses statistiques ont été réalisés avec un logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Corrélation entre le développement de MPM surveillé par le volume de poumon et l'activité métabolique de tumeur. Corrélation entre SUVmax et le volume pulmonaire (VL) affiché comme une régression linéaire tracée comme une ligne de couleur épaisse et SD connexes comme lignes noires pointillées. Des graphiques et des analyses statistiques ont été réalisés avec un logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cet article décrit un modèle orthotopic original des cellules de MPM H2052/484 injectées dans la cavité pleurale des souris athymiques et une méthode de surveillance par la formation image de PET/CT de petit animal. Ce modèle peut être mis en œuvre avec des compétences modérées de manipulation et de chirurgie des animaux et affiche un très bon taux de développement. Il permet une grande fenêtre expérimentale d'environ 10 semaines chez les souris non traitées et la détection longitudinale non invasive des tumeurs dès 2 semaines après l'injection.
Les modèles orthotopiques reposent sur l'implantation de cellules vivantes ou de tissus directement dans l'environnement initial de la tumeur. La principale différence entre les modèles mPM sous-cutanés ou intrapéritonés largement utilisés et les modèles intrapleural réside dans leur microenvironnement. En effet, le microenvironnement des tumeurs contient de multiples types de cellules stromales (fibroblastes, leucocytes, macrophages) en plus des cellules cancéreuses25. Ces cellules stromales sécrètent des facteurs de croissance et des cytokines contribuant au microenvironnement de tumeur qui modulent la croissance de tumeur. Le microenvironnement de tumeur varie avec le site anatomique suggérant qu'un xénogreffe orthopique se développera et répondra différemment à un traitement qu'un sous-cutané25. Par conséquent, comme les xénogreffes orthotopiques sont entourées d'un microenvironnement comparable à celui trouvé dans les patients MPM, leur comportement et leur réponse au traitement devraient mieux refléter la situation clinique17,19.
De nombreux modèles précliniques dans la recherche sur le cancer impliquent des souris immunodéficientes pour assurer le succès du xénogreffe humain. Les souris nues ne possèdent pas de thymus mature et n'ont pas une partie vitale du microenvironnement tumoral26. Bien que les souris nues ne possèdent pas de thymus mature et sont par conséquent déficientes en lymphocytes T, elles présentent des lymphocytes matures B, des neutrophiles, des monocytes et des macrophages dans leur microenvironnement pleural contrairement aux souris SCID plus permissives et très déficientes26. Dans les premiers stades du développement de MPM, les lymphocytes T régulateurs ont un rôle suppressif important. Cependant, dans les stades plus avancés, les cellules myéloïdes, y compris les neutrophiles et les macrophages, remplacent les cellules Treg; dans cette fonction, le rôle suppressif des lymphocytes T régulateurs n'est important que pendant les premiers stades du développement mPM23,27. Par conséquent, bien que les études impliquant une réponse immunitaire complète (p. ex., immunothérapies impliquant une réponse à T) ne puissent pas être étudiées dans le modèle présenté ici, nous postulons que ce modèle orthotopique garde tout son intérêt pour évaluer de nouveaux traitements ou de nouveaux outils diagnostiques de MPM.
Dans un point de vue méthodologique, il y a des étapes critiques à garder à l'esprit pour maximiser le développement des tumeurs intrapleural de MPM. Avant d'établir des modèles de souris, avoir accès à des cellules en croissance exponentielle (moins de 80% de confluence, selon les lignées cellulaires) et à 8 à 10 mois de souris acclimatées. En effet, l'injection de jeunes petites souris est difficile et peut entraîner des injections ectopiques et modifier la survie. Pendant la procédure d'implantation, des précautions chirurgicales standard doivent être prises, et des ciseaux émoussés doivent être utilisés en particulier lors de l'incision pour éviter les saignements, ce qui pourrait conduire à la mort des animaux. Le choix de la seringue (par exemple, le modèle décrit ici) et le protocole présenté ici permettent l'injection précise et douce d'un petit volume de cellules tumorales moyennes pour assurer l'injection intrapleurale (angle de 30 degrés, 2 à 3 mm de profondeur).
La surveillance longitudinale des modèles orthopiques de MPM ne peut être exécutée non-invasivement par la technique d'imagerie. Le TEP/CT est la méthode conseillée dans la pratique clinique pour diagnostiquer MPM et a par conséquent été employé dans cette étude20,21. Par rapport à l'imagerie optique largement utilisée, l'imagerie TEP/CT implique l'utilisation de composés radioactifs et est donc plus délicate à installer en raison de la sécurité, de la logistique des radiotraceurs et de son coût28. Néanmoins, l'imagerie TEP/CT ne repose pas sur la modification génétique des cellules tumorales et fournit des informations tomographiques, anatomiques et moléculaires à haute résolution. L'imagerie optique est également plus rapide que le PET/CT, mais le système d'imagerie présenté dans cet article implique un lit à 3 souris et environ 20 souris peuvent être numérisées par jour, ce qui est un débit raisonnable compte tenu de l'information recueillie. L'utilisation du radiotracer clinique très disponible [18F]FDG justifie une puissance translationnelle élevée à la recherche effectuée avec cette technique29. Bien que [18F]FDG-PET scan lectures et analyses pourraient exiger une certaine expérience en raison de l'utilisation élevée dans le coeur environnant et les tissus adipeux bruns, sa combinaison avec CT affine le diagnostic. Pendant [18F]FDG PET/CT expériences, le jeûne et le réchauffement des souris ainsi que l'exécution d'un temps d'utilisation de [18F]FDG de 1 h peut améliorer de manière significative la visualisation des tumeurs depuis les conditions de balayage fortement impact CONTRASTEs PET comme déjà décrit24. D'autres études sur des modèles orthopiques précliniques impliquant d'autres radiotraceurs cliniquement utilisés comme [18F]Fluorothymidine (FLT) ou [18F]Fluoromisonidazole (FMISO), qui surveille la prolifération et l'hypoxie respectivement, pourraient fournir plus d'informations sur ces modèles orthopiques fiables MPM29.
Enfin, ce modèle translationnel pertinent combiné à l'imagerie non invasive est parfaitement en ligne avec le concept 3R : Rédulence le nombre d'animaux, Refine pour diminuer la douleur et l'inconfort et Replace expérimentation animale avec des alternatives22. En effet, au sein d'un même ensemble d'animaux, le suivi thérapeutique et la réponse peuvent être surveillés de manière non invasive permettant des mesures longitudinales tout au long des expériences, réduisant ainsi le nombre d'animaux requis par expérience. De plus, comme chaque animal représente son propre contrôle au fil du temps, l'imagerie non invasive augmente également fortement la puissance statistique, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des données fiables16.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la Ligue Genevoise contre le Cancer (à V.S.-B.) et par le Centre d'Imagerie Biomédicale (CIBM) des Universités et Hôpitaux de Genève et Lausanne (à D.J.C., O.B. et S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
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