Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

غرس ورصد من قبل PET/CT من نموذج المجسم من ورم الظهاره المخروطية البشرية الجنبي في الفئران Athymic

Published: December 21, 2019 doi: 10.3791/60272
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1MicroPET/SPECT/CT Imaging Laboratory, Centre for BioMedical Imaging (CIBM), Division of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, University Hospitals and University of Geneva, 2Division of Thoracic and Endocrine Surgery, University Hospitals and University of Geneva

Summary

توضح هذه المقالة الجيل من نموذج الماوس الخاصة بالورم الظهاره الجوفية الجنبي البشرية عن طريق غرس H2052/484 خلايا الورم الظهاره الجوفية في التجويف الجنبي من الفئران athymic المناعية. تم تقييم الرصد الطولي لتطور الأورام الجنبي من قبل الوسائط المتعددة غير الغازية [18و] -2-فلورو-2-ديكسي-د-الجلوكوز بوزيترون التصوير المقطعي والصور المقطعية المحسوبة.

Abstract

ورم الظهاره السرطانية الجنبي الخبيثة (MPM) هو أورام نادره وعدوانيه تنشا في الmesothelium التي تغطي الرئتين والقلب والتجويف الصدري. ويرتبط التنمية MPM أساسا مع الاسبستوس. العلاجات لا توفر سوي البقاء علي قيد الحياة متواضعة منذ متوسط البقاء علي قيد الحياة هو 9-18 أشهر من وقت التشخيص. ولذلك ، يجب تحديد العلاجات الأكثر فعاليه. تم الحصول علي معظم البيانات التي تصف الأهداف العلاجية الجديدة من التجارب في المختبر وتحتاج إلى التحقق من صحتها في النماذج المجرية قبل السريرية موثوق بها. توضح هذه المقالة واحده مثل هذا النموذج MPM التي يمكن الاعتماد عليها التي تم الحصول عليها بعد حقن الإنسان MPM خط الخلية H2052/484 في تجويف الجنبي من الفئران athymic ناقص المناعة. الزرع في موقع العظام يسمح بدراسة تطور الورم في البيئة الطبيعية في الجسم. بوزيترون الاشعه المقطعية/التصوير المقطعي (PET/CT) الصور الجزيئية باستخدام السريرية [18f] -2-فلورو-2-ديكسي-د-الجلوكوز ([18f] fdg) الراسم الإشعاعي هو طريقه التشخيص الاختيار لفحص المرضي الذين يعانون من mpm. وفقا لذلك ، تم استخدام [18F] fdg-PET/CT لطوليا رصد تطور المرض من نموذج H2052/484 المجسم. هذه التقنية لديها إمكانات 3r عاليه (rأدوس عدد من الكائنات ، rأدوس لتخفيف الم وعدم الراحة ، و rأدوس التجارب الحيوانية مع البدائل) لأنه يمكن رصد تطور الورم غير اينفاسيفيلي ويمكن خفض عدد الماشية المطلوبة بشكل كبير.

هذا النموذج يعرض معدل التنمية العالية ، ونمو الورم السريع ، هو فعاله من حيث التكلفة ويسمح للترجمة السريرية السريعة. باستخدام هذا النموذج MPM المجسم لقياس الطعم ، يمكن للباحثين تقييم الاستجابات البيولوجية لنموذج MPM موثوق بعد التدخلات العلاجية.

Introduction

ورم الظهاره السرطانية الجنبي الخبيثة (mpm) هو السرطان في معظم الأحيان المرتبطة بالتعرض للألياف الاسبستوس1,2,3. علي الرغم من ان الاسبستوس قد حظرت في معظم البلدان الغربية4,5,6, الاصابه mpm لا يزال يتزايد7,8. مؤخرا, تعرض الفئران إلى الأنابيب النانويه الكربونية يوحي بأنها قد تؤدي إلى مخاطر صحية كبيره في البشر9,10. وتشير البيانات إلى ان التعرض لهذه المنتجات قد يحفز التهاب المزمن والتغيرات الجزيئية (علي سبيل المثال ، فقدان المسارات المثبطة للورم) التي تكمن وراء التقدم إلى ورم الظهاره المتوسطة الخبيث. حاليا ، الأنابيب النانويه الكربونية متعددة الجدران هي واحده من أهم منتجات تكنولوجيا النانو ويتم دمجها بشكل متزايد في مختلف المنتجات مثل المركبات ، ومواد تخزين الطاقة ، والطب ، والكترونيات ، ومواد المعالجة البيئية.

MPM هو سرطان مع سوء التشخيص ، ومعظم المرضي يموتون في غضون عامين بعد التشخيص بسبب فعاليه محدوده من طرائق العلاج الحالية11. اختيار العلاج ل MPM يعتمد علي مرحله السرطان. بالنسبة لمعظم المرحلة المبكرة MPM (المرحلة 1 وربما بعض المرحلة 2 أو 3 الأورام), النهج السريري هو العلاج متعدد الوسائط بما في ذلك استئصال الجراحية للأورام, المرتبطة بالمعالجة الاشعاعيه والعلاج الكيميائي12. ويشار إلى العلاج الكيميائي المشترك مع سيسبلاتين و بيماتريكسيد لمعالجه معظم المرضي الذين تم تشخيصهم بمرض متقدم محليا الغازية ، وهذا ليس قابلا لاستئصال الجراحية ، أو من هم خلاف ذلك لا المرشحين للجراحة العلاجية13،14. ولذلك هناك حاجه ماسه لتطوير علاجات أكثر فعاليه للمرضي المصابين بمرض الإيدز. ومع ذلك ، هناك عدد قليل من المصادق عليها في النماذج الحيوانية المجرية التي تعكس الصلة السريرية لل MPM. وقد وضعت عده نماذج murine mpm ولكن معظمها لا تلخص بإخلاص الجوانب المعقدة من الورم mpm البيئة المجهرية15,16,17,18. استخدام الاسبستوس المستحث MPM في الفئران, نماذج الماوس MPM المهندسة وراثيا, أو نماذج من الزرع المتزامن لخطوط الخلايا MPM murine محدوده بالاختلافات الظاهرية الاساسيه والوظيفية, التالي, ترجمه سيئه الاكتشافات الجديدة إلى العيادة. الأخرى السريرية murine MPM نماذج تعتمد في الغالب علي xenografts تحت الجلد أو البريتوني من خطوط الخلايا البشرية في الفئران نقص المناعة. في حين ان هذه النماذج هي سهله لرصد وتوفير البيانات الاساسيه ، والبيئة المجهرية لهذه xenografts ليست مماثله للأورام البشرية اضعاف القوه الانتقالية لمعظم هذه الدراسات السريرية17،19. وعلي العكس من ذلك ، فان الطعوم الهجائية تعكس بشكل أفضل سلوك المريض السرطاني واستجابته للعلاج حيث انها محاطه ببيئة مجهريه مماثله لتلك الموجودة في موقع الورم الأصلي16.

التصوير الجزيئي بواسطة [18F] fdg-PET/CT هو طريقه الاختيار لطوليا رصد تطور المرض في المرضي الذين يعانون من20،21. ولذلك ، اللجوء إلى هذه الطريقة التصوير غير الغازية يعزز إلى حد كبير ترجمه الدراسات قبل السريرية إلى التجارب السريرية16،22. وعلاوة علي ذلك ، فانه يساعد علي تقليل العدد المطلوب من الماشية لان كل الحيوانية تمثل سيطرتها الخاصة مع مرور الوقت.

في هذه المقالة ، ونحن نقدم التي يمكن الاعتماد عليها النموذج المجسم MPM التي تم الحصول عليها بعد حقن الإنسان MPM خط الخلية H2052/484 في تجويف الجنبي من الفئران athymic. بالاضافه إلى التصوير بالاشعه المقطعية [18F] FDG-PET/CT ، يعد هذا النموذج طريقه قيمه وقابله للتكرار لدراسة التاثيرات الوظيفية واليه للاستراتيجيات والعلاجات التشخيصية الجديدة للإنسان البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة علي جميع الإجراءات الموصوفة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية ومن قبل المكتب الحكومي البيطري في جنيف ، سويسرا (التفويض GE/106/16). تم تاسيس خط الخلية MPM H2052/484 ويتميز في مختبرنا كما هو مفصل في مقال كولن دي جي وآخرون23. لفتره وجيزة ، تم تاسيس H2052/484 خط الخلية من الورم الصدري الذي تم الحصول عليه بعد حقن داخل الغشاء الH2052 (ATCC) الخلايا في الفئران عاريه المناعية.

1. التصميم التجريبي

  1. تحديد عدد الفئران المطلوبة وفقا للتجربة باستخدام حساب الطاقة الاحصائيه (علي سبيل المثال http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
  2. علي الأقل أسبوع واحد قبل غرس, شراء ثمانيه إلى عشره أسابيع من العمر athymic الإناث عاريه الفئران Foxn1nu nu/nu ومنزل لهم في بيئة معينه خاليه من العوامل الممرضة (SPF) لمده أسبوع علي الأقل.

2. اعداد خلايا للزرع

  1. حساب عدد الخلايا H2052/484 المطلوبة كما يتم حقن كل الماوس مع 1 × 106 خلايا (الخطوة 1.1). اعداد عدد إضافي من الخلايا كما حقن للفئران سوف تنطوي علي أخذ العينات حقنه.
  2. ثقافة MPM H2052/484 خط الخلية في RPMI 1640 المتوسطة تستكمل مع 10 ٪ (v/v) مصل البقر الجنين (ار) ، 100 وحده/مل البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في حاضنه ثقافة الانسجه في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
  3. ثقافة خلايا لغرس إلى تقريبا 80% التقاء (~ 7 [اكس] 106 خلايا لكل 15 سم [بتري] طبق).
  4. حوالي 1 ساعة قبل تطعيم ، واعداد الخلايا.
  5. تجاهل وسائل الاعلام ، وغسل الخلايا مع العقيمة تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم (10 مل لكل 15 سم طبق بيتري) وفصل الخلايا عن طريق احتضان لمده 5 دقائق مع 0.05 ٪ تريبسين-2 مم أدتا (2 مل لكل 15 سم طبق بيتري).
  6. جمع الخلايا في RPMI المتوسطة (10 مل لكل 15 سم طبق بيتري) وعد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية.
  7. جمع العدد المناسب من الخلايا لعدد الفئران التي يتم حقنها باعتبارها محسوبة وفقا للخطوة 1.2.
  8. أجهزه الطرد المركزي في 300 x g لمده 3 دقائق ، وغسل بيليه الخلية في 10 مل من المتوسطة rpmi دون الجهاز الطرد المركزي والطاردة للطرد مره أخرى في 300 x g لمده 3 دقائق.
  9. أعاده التعليق الخلايا في حجم المناسبة من المتوسطة RPMI دون ان يكون لتركيز 1 × 106 خلايا لكل 50 μl كما يجب ان يتم حقن كل الماوس مع حجم 50 μl.

3. زرع الخلايا السرطانية

  1. قبل الغرس ، أعد نظام التخدير والمنطقة الجراحية في غطاء التيار الرقائقي عن طريق رش جميع الأسطح بمطهر. اعداد الإمدادات المعقمة أو تطهيرها في غطاء التيار الصفحي بما في ذلك نظام التخدير ، وساده التدفئة للحفاظ علي درجه حرارة الجسم الماوس ، ومحلول اليود بوليفيدون ، 30 ز هاملتون حقنه (علي سبيل المثال ، حقنه 705RN ، 30 G ابره-20 مم-نقطه نمط 4) ، شاش معقمه ومسحات القطن ، والعقيمة المتاح المستغل وأداات الجراحة والماصات الدقيقة والنصائح العقيمة.
  2. احفظ وافتح أقفاص SPF المعزولة في غطاء المحرك المعقم وتخدير الماوس بعد الآخر وفقا لسرعه التطعيم. مده التطعيم حوالي 5 – 10 دقيقه للفنيين المجربين.
  3. تخدير الفئران عن طريق حمل الاولي مع 4-5 ٪ ايزوفلواني. ثم الحفاظ علي تحت التخدير علي وساده التدفئة في حين تطعيم مع 3 ٪ ايزوفلواني. تحديد عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس اليمين عن طريق الماوس.
  4. مره واحده هو التخدير الماوس, حقن جلد 0.05 ملغ/كغ البوبرينورفين كمسكن/بعد العملية الجراحية لتخفيف الام.
  5. ضع الماوس علي الجانب الأيمن (decubitus الجانبية اليمني) علي لوحه التدفئة.
  6. نظف المنطقة الجراحية بمحلول اليود متعدد الاستخدامات وقم بعمل شق بحجم 5 مم من الجلد وامسح الدهون والعضلات المحيطة بالمقصات الحاده للكشف عن الأضلاع.
  7. تجانس تعليق الخلية في تركيز 1 × 106 خلايا لكل 50 ΜL من rpmi المتوسطة دون المنفذة وتحميل 50 μl من التعليق مع حقنه هاملتون. تجنب فقاعات الهواء ومسح الابره مع الكحول 70 ٪ لتجنب تطعيم غير التقويمية من الخلايا. تجانس تعليق الخلية قبل كل حقنه.
  8. قم بحقن الخلايا ببطء في التجويف الجنبي بينالأضلاع السادسة والسابعة بزاوية 30 درجه وعمق 2 – 3 مم تحت العضلات الوربيه. تاكد من عدم حقن في الرئتين عن طريق الحفاظ علي الابره فقط تحت الأضلاع. يجب ان تكون الابره مرئية عن طريق الشفافية من خلال العضلات (الشكل 1ا).
  9. اغلق الجرح بثلاثه إلى أربع غرز قابله للامتصاص.
  10. خزن الفئران في بيئة دافئه حتى تستيقظ.
  11. في اليوم التالي ، كرر حقن البوبرينورفين. مراقبه الفئران وفقا للتصميم التجريبي والترخيص.

4. [18و] fdg-PET/CT التصوير

ملاحظه: يجب ان تتم الموافقة علي جميع الإجراءات الموصوفة أدناه من قبل مرافق التصوير والإسكان الحيواني المحلي. تاكد من ان المواد المشعة يتم استيرادها وتخزينها ومعالجتها وفقا لقواعد السلامة الاشعاعيه المحلية (علي سبيل المثال ، نشاط حلول الأسهم ، مناوله غطاء المحرك المحمي). يمكن الحفاظ علي الظروف SPF من خلال التلاعب الحيوانية في غطاء المحرك الرقائقي التدفق وعن طريق تحميلها في السرير الماسح الضوئي متوافق مع SPF (الشكل 1ب ، ج).

  1. مراقبه تطور الورم تنفيذ التصوير PET/CT ، مره واحده في الأسبوع ، بدءا من اليوم 7 بعد غرس الخلايا H2052/484. كل الحيوانية تمثل سيطرتها الخاصة مع مرور الوقت.
  2. تجنب الكرب من الماشية قبل التصوير عن طريق نقل الفئران إلى السكن مرفق التصوير إذا كان متوفرا أو إبقائها قريبه من المرفق.
  3. الفئران السريعة ل 12-16 h قبل [18F] FDG-PET/CT الذي يقلل من إشارات الخلفية. انظر Fueger24 الذي وصف تاثير التعامل مع الحيوانية علي [18F] fdg-PET/CT الاشعه المقطعية.
  4. تطهير وتخزين الفئران السرير وفقا للقواعد المحلية.
  5. تسجيل جميع الأوقات من القياسات جرعات النشاط الإشعاعي ، والحقن والاشعه PET لتكون قادره علي حساب سيارات الرباعية الرياضية.
  6. الفئران قبل الحارة في 30 درجه مئوية لمده 30 دقيقه قبل حقن [18F] fdg التي تقلل من الانسجه الدهنية البني (BAT) الأيض. علي سبيل المثال ، قبل الحارة في غرف التدفئة ، وذلك باستخدام منصات التدفئة أو باستخدام مصابيح الاشعه تحت الحمراء.
  7. اعداد جرعات 3-4 MBq من [18F] fdg من محلول الأسهم في 150-200 μl من المحلول الملحي في 1 مل المحاقن الانسولين باستخدام معايره الجرعة. المحاقن الانسولين لديها ميزه وجود ما يقرب من اي حجم القتلى ويمكن تجنب قياس النشاط المتبقي بعد الحقن.
  8. تخدير الفئران مع ايزوفلواني كما هو موضح في الخطوة 3.3. تزن الفئران ثم حقن وريديا 3 – 4 MBq [18F] fdg. الرجعية المدارية الحقن هو وسيله للاختيار لأنها سريعة وسهله ويتجنب القضايا حقن الوريد الذيل أو تاخر امتصاص حقن داخل الصفاق.
  9. بعد الحقن ، وترك الفئران مستيقظا لمده 45 دقيقه في اقفاصهم تحت الظروف الحارة التي بدات في الخطوة 3.5. مده [18F] امتصاص fdg هو 1 h; 15 دقيقه عاده ما تكون كافيه لتحميل الفئران علي السرير وأداء CT قبل PET.
  10. تخدير الفئران مع ايزوفلواني كما هو موضح في الخطوة 3.3 وتحميلها علي سرير الماسح الضوئي (الشكل 1ب).
  11. نقل السرير إلى الماسح الضوئي والكائنات الموضوع إلى الاشعه المقطعية تركزت علي الرئتين. الحصول علي المسح الضوئي في 80 kVp ، 160 μA ، 1024 الإسقاطات خلال دوران 360 درجه ، مع مجال الرؤية من 74 مم (1.6 x التكبير ، مثال علي انتصار الاستحواذ) (الشكل 1ج).
  12. نقل السرير إلى النظام الفرعي PET وبدء الاستحواذ 1 ح بعد [18F] حقن fdg لمده 15 دقيقه. مع معظم نظم PET/CT ، يمكن نقل السرير تلقائيا من CT إلى PET للحفاظ علي فوف تركز علي نفس المنطقة.
  13. أزاله الفئران من غرفه التصوير والسماح لهم للتعافي في قفصهم.
  14. الحفاظ علي الفئران في منطقه مخصصه لتسوس المشعة وفقا للقواعد المحلية.

5. تحليلات [18F] fdg-PET/CT الاشعه المقطعية

  1. أعاده بناء الاشعه المقطعية التي أجريت في الظروف المذكورة أعلاه مع مصفوفة من 512 وحجم فوكسل من 0.144 مم (تصفيه الإسقاط الظهر-fbp خوارزميه ، المدمج في البرمجيات). أعاده بناء المسح الضوئي PET باستخدام 20 التكرارات من التوقعات مجموعه فرعيه الحد الأقصى-3 خوارزميه البعد OSEM3D. معايره الصور في بكريل/مل عن طريق مسح اسطوانه وهميه. اشترك تلقائيا في تسجيل الاشعه المقطعية ومسح PET وفقا لحل البرمجيات المدمج في الخاص بك.
  2. تحليل وحدات تخزين الرئتين باستخدام برنامج التحليل (جدول المواد).
    1. تحميل البيانات المقطعية كمرجع (Ref) عن طريق النقر علي أيقونه البيانات المفتوحة . ثم تحميل البيانات PET كادخال (Inp1) عن طريق النقر علي رمز إلحاق البيانات .
    2. ضبط موازين ألوان ("WL") من CT و PET للصور المتباينة للفحص البصري.
    3. حدد أداه Roi 3D من القائمة المنسدلة ، انقر علي أضافه roi واسم الملف الرئتين. انقر علي خوارزميات التقسيم | الحي الدرس. تعريف الإدخال كخلفيه وصوره كمرجع. ادخل Min و Max وفقا لقيم كثافة الماوس الرئة ، عاده-800 و-300 HU. فحص 3D الرئتين المقدمة عن طريق النقر علي أيقونه vtk واسترداد وحده التخزين في الجدول الذي تم إنشاؤه بالنقر علي أيقونه إظهار الجدول.
  3. تحليل [18F] امتصاص fdg في الأورام عن طريق استخراج القيم القصوى امتصاص القياسية (SUVmax).
    1. تحويل الصور أليفه معايره في بكريل/مل إلى سيارات الدفع الرباعي عن طريق اختيار الحسابية من القائمة المنسدلة ، ثم ضرب عددي واستخدام inp1 كما هو محدد والعددي هو bq/ml إلى عامل SUV محسوبة علي النحو التالي: suv = (bq/ml)/(جرعه حقن (bq)/وزن الجسم (ز)).
    2. حدد أداه Roi 3D من القائمة المنسدلة ، انقر علي أضافه roi واسم الملف الأورام. انقر علي وضع الطلاء ثلاثي الابعاد | مجال. الغ تحديد 2D فقط. اضبط حجم الشكل وأحط الأورام. تاكد من عدم تضمين اي إشارات التداخل القادمة من القلب علي سبيل المثال. استرداد قيمه SUVmax في الجدول الذي تم إنشاؤه بواسطة النقر فوق أيقونه إظهار الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نموذج H2052/484 المجسم
نماذج المجسم MPM من خلال حقن داخل الصدر من الخلايا السرطانية المستزرعة ، وخاصه خلايا H2052/484 هي سهله نسبيا لاعداد. الخطوات المختلفة الموصوفة أعلاه تتطلب فقط المعرفة المتواضعة لثقافة الخلايا وخطوات الجراحة متاحه لمجربي التجارب الحيوانية المدربين باعتدال. وينبغي التلاعب الفئران عاريه والخلايا في ظل ظروف معقمه لتعظيم نتائج عمليات الزرع. من خلال اتباع هذا البروتوكول بعناية ، والذي ينطوي علي التخدير القصير والجراحة الحد الأدنى ، واجهنا فقط 1 الموت بين 266 الفئران حقن مع خطوط الخلايا MPM مختلفه. ولوحظ عدم وجود استرواح الصدر أو زرع داخل الرئة من الخلايا السرطانية بين هذه الفئران 266 حقن بعناية كما هو موضح. وعلي وجه التحديد ، فان معدل نمو الورم المجسم لخط الخلية H2052/484 مرتفع منذ 93.8% من الفئران المحقونة التي طورت الأورام (ن = 118). H2052/484 يمكن الكشف عن الأورام عن طريق التصوير PET/CT من 14 يوما بعد الحقن ومتوسط مده التجربة وفقا لمعايير نقطه النهاية لدينا كان 31 يوما في تجربه تمثيليه21. كما وصفنا في هذه الدراسة الأخرى21، تم توطين الأورام في التجويف الصدري ، وتوزيعها بحريه أو تعلق علي الرئتين ، والعضلات الصدرية ، وقوس الابهر أو الوريد الأجوف السفلي. لم يتم العثور علي الانبثاث.

مراقبه MPM من قبل [18F] fdg-PET/CT التصوير
تم رصد MPM التقويمية أسبوعيا بالجمع بين PET/CT التصوير مع الكاشف الإشعاعي المستخدمة علي نطاق واسع [18F] fdg التي تتراكم في الأورام الايضيه للغاية. تسمح الاشعه المقطعية الطولية التشريحية بتصوير تاثير تطوير MPM علي مورفولوجية الرئتين. التقسيم التلقائي من الرئتين متناقضة للغاية علي الاشعه المقطعية بسيطه نظرا لكثافتها المنخفضة بالمقارنة مع الانسجه المحيطة بها. الأداءات 3D تعطي لمحه عامه عن توطين الأورام ويمكن استخراج كميات طوليه من الرئتين (الشكل 2ا). وانخفضت قياسات احجام الرئة بواسطة CT بشكل ملحوظ مع مرور الوقت بعد حقن MPM من الفئران مع الأورام في التجويف الجنبي (ipl) H2052/484 (الشكل 2ب). في الواقع ، تنمو أورام MPM داخل التجويف الجنبي وتخلق ضغوطا علي الرئتين ، مما يقلل من احجامها. وأظهرت تحليلات الارتباط ان احجام الرئة ترتبط ارتباطا عكسيا بوقت الرصد بمعامل التحديد R2 ال0.8 (الشكل 2ج). الإجمال ، تظهر هذه البيانات موثوقيه المسح المقطعي المحوسب لرصد تطور نموذج MPM هذا.

بالاضافه إلى التصوير المقطعي المحوسب ، يوفر فحص FDG-PET [18F] معلومات اضافيه وقيمه عن الحالة الايضيه لأورام mpm. في حين انه في بعض الأحيان يمكن ان تكون معقده لتفسير CT و PET بمسح الصور بأنفسهم ، وخصوصا في وقت مبكر النقاط ، ومزيج من كلا الأسلوبين يعطي مزيدا من المتانة للتشخيص. في الواقع ، تمثيلي طوليه [18F] FDG-PET/CT الرصد التي أجريت بين 10 أيام و 44 أيام من الماوس مع ipl H2052/484 الأورام يظهر ان الأورام تبدا في ان تكون مميزه 2 أسابيع بعد تطعيم (الشكل 3ا). هذا المثال يسلط الضوء علي النمو و [18F] العمق fdg من الأورام الموجودة في محيط التجويف الصدري وعلي طول الاوعيه الدموية الكبيرة (السهام البيضاء). [18و] تم قياس امتصاص FDG في الأورام عن طريق استخراج SUVmax في rois المسحوبة علي الأورام ، مع مساعده من الاشعه المقطعية ، ويظهر زيادات كبيره تعتمد علي الوقت من استقلاب الجلوكوز (الشكل 3ب). وأظهرت تحليلات الارتباط انالحد الأقصى لسيارات الدفع الرباعي يرتبط ارتباطا إيجابيا بوقت الرصد بمعامل التحديد R2 ال0.7 (الشكل 3ج). هذه البيانات تثبت موثوقيه [18F] fdg-PET المسح الضوئي لرصد مصير H2052/484 الأورام التقويمية. وأخيرا ، واحجام الرئة و [18F] fdg الافسيه ، علي التوالي ، وتحليلها من قبل CT و PET ، ترتبط مع بعضها البعض مع R2 من 0.6 دعم قوه هذه القياسات لدراسة mpm تطوير الأورام التقويمية (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: نموذج الماوس عاريه العظم المجسم. (ا) الحقن في التجويف الجنبي (ipl) للخلايا البشرية mpm في جوف الجنبي الأيسر كما هو موضح في قسم البروتوكول. (ب ، ج) يتم تخدير الفئران وتحميلها في السرير PET/CT في غطاء التدفق الصفحي ثم نقلها إلى الماسح الضوئي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نمو الورم في نموذج H2052/484 MPM الذي يرصده التصوير المقطعي المحوسب. (ا) أعاده البناء التمثيلي ثلاثي الابعاد لفحص الاشعه المقطعية التي تظهر H2052/484 mpm الأورام ipl وتاثيرها علي حجم الرئة (Vp) في وقت مختلف في أيام بعد غرس. الأبيض نصال عرض موقع أورام الشعيرات البيضاء MPM. (ب) مؤامرة الكمان التي تبين دوره زمنيه تمثيليه لاحجام الرئة (VL) ، n = 6. يتم الاشاره إلى اختبار ANOVA ذات الاتجاه الواحد مع إحصائيات المقارنات المتعددة ل Tukey. وتشير الرسائل إلى وجود اختلافات كبيره بين النماذج التي تحتوي علي (ا) و (ب) و (ج) و (د) و (ه) و (و) علي التوالي ، و D16 ، و D23 ، و D29 ، و D36 ، و D44. قيم p المناظرة: x, p < 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p < 0.001; xxxx ، ص < 0.0001. (ج) الارتباط بين الانخفاض في حجم الرئة المتعلقة IPL mpm التنمية والوقت بعد الحقن. يتم رسم الانحدار الخطي كخط ملون سميك و SD ذات الصلة كخطوط سوداء متقطعه. وأجريت الرسوم البيانية والتحليلات الاحصائيه مع البرامجيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: استقلاب الورم في نموذج MPM ipl متبوعا ب [18F] Fdg-micropet/CT. (ا) الفحص التمثيلي للحيوانات أليفه/الاشعه المقطعية التي تظهر أورام ipl mpm. تظهر الصور PET/CT الشرائح عبر المحورية من منطقه الصدر التي تحتوي علي [18F] الأورام متعطشا لل fdg ، مع CT (مقياس رمادي) توفير المعلومات التشريحية و PET (معايره مقياس اللون الزائف) تبين موقع وكثافة الورم العالي واستخدام الجلوكوز في الجهاز. يتم الاشاره إلى أيام ما بعد الحقن. Ct: ct الإطار المنصفيه; [18و] FDG-PET/CT: صوره تنصهر فيها PET والاشعه المقطعية. الأبيض نصال تظهر الأورام الشعيرات MPM. L = الرئة ، H = القلب ، BAT = الانسجه الدهنية البني. (ب) مؤامرة الكمان عرض دوره تمثيليه الوقت من SUVماكس مرتبطة بالأيض mpm ، ن = 6. يتم الاشاره إلى اختبار ANOVA ذات الاتجاه الواحد مع إحصائيات المقارنات المتعددة ل Tukey. وتشير الرسائل إلى وجود اختلافات كبيره بين النماذج التي تحتوي علي (ا) و (ب) و (ج) و (د) و (ه) و (و) علي التوالي ، و D16 ، و D23 ، و D29 ، و D36 ، و D44. قيم p المناظرة: x, p < 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p < 0.001; xxxx ، ص < 0.0001. (ج) الارتباط بين زيادة SUVmax في ipl mpm الأورام والوقت بعد الحقن. يتم رسم الانحدار الخطي كخط ملون سميك و SD ذات الصلة كخطوط سوداء متقطعه. وأجريت الرسوم البيانية والتحليلات الاحصائيه مع البرامجيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الارتباط بين التنمية MPM رصدها حجم الرئة والنشاط الأورام الايضيه. الارتباط بين SUVmax وحجم الرئة (VL) عرض كانحدار خطي رسم كخط ملون سميكه وذات الصلة SD كخطوط سوداء متقطعه. وأجريت الرسوم البيانية والتحليلات الاحصائيه مع البرامجيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصف هذه الورقة نموذجا أصليا للتقويمية من الخلايا MPM H2052/484 التي تم حقنها في التجويف الجنبي للفئران الاثيريه وطريقه للرصد بواسطة الصور الحيوانية الصغيرة PET/CT. ويمكن تنفيذ هذا النموذج مع التعامل مع المعاملات الحيوانية المعتدلة والمهارات الجراحية ويعرض معدل نمو جيد جدا. فانه يسمح نافذه تجريبية كبيره من حوالي 10 أسابيع في الفئران غير المعالجة والكشف الطولي غير الغازية من الأورام في وقت مبكر من 2 أسابيع بعد الحقن.

تعتمد نماذج العظام علي غرس الخلايا الحية أو الانسجه مباشره في البيئة الاوليه للورم. الفرق الرئيسي بين المستخدمة علي نطاق واسع تحت الجلد أو داخل نماذج MPM والنماذج داخل الغشاء الجلدي يكمن في بيئتها الصغرى. في الواقع ، تحتوي البيئة المجهرية للأورام علي أنواع متعددة من الخلايا اللحمية (الخلايا الليفية ، والكريات الخلوية ، والضامة) بالاضافه للخلايا السرطانية25. هذه الخلايا اللحمية تفرز عوامل النمو و السايتوكينات المساهمة في البيئة المجهرية الورم التي تعدل نمو الورم. تختلف البيئة المجهرية للورم مع الموقع التشريحي مما يوحي بان الكسب غير المرتبط بالعظام سيتطور ويستجيب بشكل مختلف للعلاج من الجلد الواحد25. لذلك, بما ان [اورتونوبيك] [اكسموتكتيبس] أحطت مع [ميكروسبرد] قابل للمقارنة إلى الواحدة يؤسس في [م] مريضات, تصرفهم واستجابه إلى معالجه ينبغي بشكل أفضل عكست الحالة سريريه17,19.

العديد من النماذج السريرية في أبحاث السرطان توريط الفئران المناعية لضمان نجاح الكسب غير المسبوق الإنسان. الفئران عاريه لا تملك الغدة التوتة ناضجه وتفتقر إلى جزء حيوي من الورم المجهري26. علي الرغم من ان الفئران عاريه لا تملك الغدة التوتة الناضجة التالي ناقصه في الخلايا T ، فانها تقدم اللمفاويات الناضجة ب ، العدلات ، البويضات والضامة في بيئتها المجهرية الجنبي علي النقيض من الفئران SCID أكثر تساهلا ونقصا للغاية26. في المراحل المبكرة من التنمية MPM ، الخلايا T التنظيمية لها دور القمعية الهامه. ومع ذلك ، في مراحل أكثر تقدما ، الخلايا النخاعية بما في ذلك العدلات والضامة استبدال خلايا Treg ؛ في هذه الوظيفة ، والدور القمعي للخلايا التنظيمية T مهم فقط خلال المراحل المبكرة من mpm التنمية23،27. التالي ، علي الرغم من ان الدراسات التي تنطوي علي استجابه مناعية كامله (علي سبيل المثال ، العلاجات المناعية التي تنطوي علي استجابه T) لا يمكن دراستها في النموذج المعروض هنا ، فاننا نفترض ان هذا النموذج المجسم يبقي كل اهتمامه لتقييم علاجات جديده أو أدوات تشخيصيه جديده.

في وجهه نظر منهجيه ، وهناك خطوات حاسمه لناخذ في الاعتبار لتعظيم التنمية في الأورام MPM داخل الجنبي. قبل إنشاء نماذج الفئران ، والوصول إلى خلايا تنمو بشكل مطرد (اقل من 80 ٪ كونفلوينسي ، اعتمادا علي خطوط الخلايا) والي 8 إلى 10 أشهر الفئران تاقلم. في الواقع ، من الصعب حقن الفئران الصغيرة الأصغر سنا ويمكن ان يؤدي إلى حقن الرحم وتغيير البقاء علي قيد الحياة. اثناء عمليه الغرس ، يجب اتخاذ احتياطات الجراحة القياسية ، وينبغي استخدام مقص حاد وخاصه عند التحريض علي تجنب النزيف ، مما قد يؤدي إلى موت الماشية. اختيار الحقنه (علي سبيل المثال ، النموذج الموصوف هنا) والبروتوكول المعروض هنا يسمح بالحقن الدقيق واللطيف لحجم صغير من الخلايا السرطانية المتوسطة المحتوية لضمان الحقن في التجويف الجنبي (زاوية 30 درجه ، عمق 2 – 3 مم).

يمكن اجراء الرصد الطولي لنماذج MPM المجسمة فقط غير اينفاسيفيلي بواسطة تقنيات التصوير. PET/CT هو أسلوب نصح في الممارسة السريرية لتشخيص mpm التالي تم استخدامها في هذه الدراسة20,21. المقارنة مع التصوير البصري المستخدم علي نطاق واسع ، فان التصوير المقطعي/المحوسب ينطوي علي استخدام المركبات المشعة التالي فهو أكثر حساسية للاعداد بسبب السلامة ، واللوجستيات الخاصة بالمتتبعين الإشعاعيين وتكلفته28. ومع ذلك ، فان التصوير PET/CT لا يعتمد علي التعديل الوراثي للخلايا السرطانية ويوفر معلومات عاليه الدقة والتشريحية والجزيئية. التصوير البصري هو أيضا أسرع من PET/CT ولكن نظام التصوير المعروض في هذه المقالة ينطوي علي سرير 3 الفئران ويمكن مسح حوالي 20 الفئران في اليوم الواحد ، وهي إنتاجيه معقولة بالنظر إلى المعلومات التي تم جمعها. استخدام التتبع الإشعاعي السريري المتاحة للغاية [18و] fdg يتطلب قدره عاليه الانتقالية للبحوث التي أجريت مع هذه التقنية29. علي الرغم من ان قراءات وتحاليل فحص FDG-PET [18F] قد تتطلب بعض الخبرة بسبب الامتصاص العالي في القلب المحيط والانسجه الدهنية البنية ، فان تركيبه مع التصوير المقطعي المحوسب ينقي التشخيص. خلال [18f] FDG PET/CT التجارب, الصيام والاحترار الفئران وكذلك أداء وقت امتصاص [18f] fdg من 1 ح يمكن ان تعزز إلى حد كبير التصور من الأورام منذ ظروف المسح الضوئي تاثيرا كبيرا التناقضات PET كما هو موضح بالفعل24. المزيد من الدراسات حول النماذج التقويمية قبل السريرية التي تنطوي علي غيرها من الاجهزه الاشعاعيه المستخدمة سريريا كما [18و] فلوثيروميمين (flt) أو [18f] فلوروميسونيدازولي (fmiso), التي تراقب الانتشار ونقص الأكسجين علي التوالي, يمكن ان توفر المزيد من المعلومات حول هذهالنماذج mpm

وأخيرا ، هذا النموذج الانتقالي ذات الصلة مع التصوير غير الغازية تماما تمشيا مع مفهوم 3r: rأدوس عدد الماشية ، rأدوس لتخفيف الم وعدم الراحة و rأدوس التجارب الحيوانية مع البدائل22. في الواقع ، داخل نفس مجموعه من الحيوانية ، يمكن رصد المتابعة العلاجية والاستجابة غير اينفاسيفيلي السماح القياسات الطولية في جميع انحاء التجارب ، التالي تقليل عدد الحيوانية المطلوبة لكل تجربه. وعلاوة علي ذلك ، كما ان كل الحيوانية تمثل سيطرتها الخاصة مع مرور الوقت ، والتصوير غير الغازية أيضا زيادة كبيره في الطاقة الاحصائيه خفض عدد الماشية اللازمة للحصول علي بيانات موثوقه16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل رابطه Genevoise مكافحه السرطان (إلى V.S.) ومركز التصوير الطبي الحيوي (CIBM) من الجامعات والمستشفيات في جنيف ولوزان (إلى D.J.C. ، نسائي و S.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-mice bed Minerve bed for mice imaging
Athymic Nude-Foxn1n nu/nu Envigo, Huntingdon, UK 6907F immunodeficient mouse
Betadine Mundipharma Medical Company, CH 111131 polyvidone iodine solution
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 14190094 Buffer for cell culture
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Pasching, Austria A15-101 cell culture medium supplement
Insulin syringes BD Biosciences, San Jose, CA, USA 324826 syringe for cell injection
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122 antibiotics for cell culture medium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 61870010 basal cell culture medium
Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) Alloga SA, CH 700320 opioid analgesic product
Triumph PET/SPECT/CT Trifoil, Chatsworth, CA, USA imaging equipment
Trypsin ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 25050014 enzymatic cell dissociation buffer
Virkon S 2% Milian, Vernier, CH 972472 disinfectant
Vivoquant Invicro, Boston, MA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
  2. Mossman, B. T., Gee, J. B. Asbestos-related diseases. The New England Journal of Medicine. 320 (26), 1721-1730 (1989).
  3. Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
  4. Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
  5. LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
  6. Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
  7. Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
  8. Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
  9. Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
  10. Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
  11. Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A. Malignant mesothelioma. The Lancet. 366 (9483), 397-408 (2005).
  12. Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
  13. Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
  14. Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
  15. Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
  16. de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
  17. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  18. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
  19. Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
  20. Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
  21. Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
  22. MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
  23. Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
  24. Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
  25. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
  26. Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
  27. Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
  28. James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
  29. Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 154 ، السرطان ، الغشاء المخروطي ، ورم الظهاره المتوسطة ، الشعاعية ، الماوس الأثيري ، التصوير غير الغازية ، PET/CT التصوير
غرس ورصد من قبل PET/CT من نموذج المجسم من ورم الظهاره المخروطية البشرية الجنبي في الفئران Athymic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, D. J., Bejuy, O., Germain,… More

Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice. J. Vis. Exp. (154), e60272, doi:10.3791/60272 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter