Summary
Bu makalede, h2052/484 mezotelyoma hücrelerinin immünazatlı atimik farelerin plevral kaviteye implantasyonu ile insan plevral mezotelyoma bir ortopik fare modeli nin üretimi açıklanmaktadır. İntraplevral tümörlerin gelişiminin uzunlamasına takibi non-invaziv multimodal[18F]-2-floro-2-deoksi-D-glukoz pozitron emisyon tomografisi ve bilgisayarlı tomografi görüntüleme ile değerlendirildi.
Abstract
Malign plevral mezotelyoma (MPM), mezotelyumda akciğerleri, kalbi ve göğüs boşluğunu kaplayan nadir ve agresif bir tümördür. MPM gelişimi esas olarak asbest ile ilişkilidir. Ortanca sağkalım ortalaması tanı konduktan 9-18 ay olduğu için tedaviler sadece mütevazı bir sağkalım sağlar. Bu nedenle daha etkili tedaviler tespit edilmelidir. Yeni terapötik hedefleri açıklayan verilerin çoğu in vitro deneylerden elde edilebildi ve güvenilir in vivo preklinik modellerde doğrulanması gerekiyor. Bu makalede, immünofik atimik farelerin plevral kavite içine bir insan MPM hücre hattı H2052/484 enjeksiyonu sonrasında elde edilen böyle bir güvenilir MPM ortotopik modeli açıklanmaktadır. Ortotopik bölgede transplantasyon, doğal in vivo ortamda tümörün ilerlemesinin incelenmesini sağlar. Pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT) moleküler görüntüleme klinik [18F]-2-floro-2-deoksi-D-glukoz([18F]FDG) radyotracer, MPM'li hastaların incelenmesinde tercih edilen tanı yöntemidir. Buna göre [18F]FDG-PET/CT H2052/484 ortotopik modelin hastalık ilerlemesini uzunlaizlemek için kullanıldı. Tümör gelişimi non-invaziv olarak izlenebilir ve gerekli hayvan sayısı önemli ölçüde azaltılabilir beri bu teknik yüksek bir 3R potansiyele sahiptir(Reduce hayvan sayısı, ağrı ve rahatsızlık azaltmak için Refine ve alternatifler iyer Replace hayvan deneyleri).
Bu model yüksek bir gelişme hızı görüntüler, hızlı bir tümör büyüme, maliyet-etkin ve hızlı klinik çeviri sağlar. Bu ortotopik ksenogreft MPM modelini kullanarak, araştırmacılar terapötik müdahaleler sonrasında güvenilir bir MPM modelinin biyolojik yanıtlarını değerlendirebilirler.
Introduction
Malign plevral mezotelyoma (MPM) en sık asbest liflerine maruz kalma ile ilişkili bir kanserdir1,2,3. Asbest çoğu Batı ülkesinde yasaklanmış olmasına rağmen4,5,6, MPM insidansı halaartmaktadır 7,8. Son zamanlarda, karbon nanotüpler farelerin maruz kalma onlar insanlarda önemli sağlık riski neden olabileceğini düşündürmektedir9,10. Veriler, bu ürünlere maruz kalmanın kronik inflamasyona ve malign mezotelyoma ilerlemenin altında yatan moleküler değişikliklere (örneğin, tümör baskılayıcı yolların kaybına) yol açabileceğini düşündürmektedir. Şu anda, multiwall karbon nanotüpler nanoteknolojinin en önemli ürünlerinden biridir ve giderek kompozitler, enerji depolama malzemeleri, tıp, elektronik ve çevresel iyileştirme malzemeleri gibi çeşitli ürünler dahil edilmektedir.
MPM kötü prognoz ile bir kanser, ve çoğu hasta mevcut tedavi yöntemleri sınırlı etkinliği nedeniyle tanı dan sonra iki yıl içinde ölür11. MPM için tedavi seçimi kanser evrelerine bağlıdır. En erken evre MPM için (evre 1 ve muhtemelen bazı evre 2 veya 3 tümörler), klinik yaklaşım tümörlerin cerrahi rezeksiyonu da dahil olmak üzere multimodal bir tedavi, radyoterapi ve kemoterapi ile ilişkili12. Sisplatin ve pemetrexed ile kombine kemoterapi cerrahi rezeksiyon için uygun değildir, ileri lokal invaziv hastalık tanısı çoğu hastanın tedavisinde endikedir, ya da aksi takdirde küratif cerrahi için aday değildir13,14. Bu nedenle, MPM hastaları için daha etkili tedaviler geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Ancak, MPM klinik alaka yansıtan vivo hayvan modelleri birkaç doğrulanmış vardır. Birkaç murine MPM modelleri geliştirilmiştir ama bunların çoğu sadakatle MPM tümör mikroçevre15,16,17,18karmaşık yönlerini özetlemek yok . Farelerde asbestkaynaklı MPM kullanımı, genetiği değiştirilmiş MPM fare modelleri veya murine MPM hücre hatlarının synjenik transplantasyon modelleri temel phenotipik ve fonksiyonel farklılıklar la sınırlıdır ve sonuç olarak, yeni keşifleri kliniğe kötü bir şekilde çevirir. Diğer preklinik murine MPM modelleri çoğunlukla immünoffik farelerde insan hücre hatlarının deri altı veya periton ksenogreftlerine dayanır. Bu modelleri izlemek ve temel verileri sağlamak kolay olsa da, bu ksenogreftlerin mikroortamı bu preklinik çalışmaların çoğunun çeviri gücünü bozan insan tümörleri ile karşılaştırılabilir değildir17,19. Tersine, ortotopik ksenogreftler daha iyi hasta tümör davranışı ve tedaviye yanıt yansıtmak gibi orijinal tümör sitede bulunan benzer bir mikroçevre ile çevrilidir16.
[18F]FDG-PET/BT moleküler görüntüleme MPM20,21olan hastalarda hastalık ilerlemesini uzunlamasına izlemek için tercih edilen bir yöntemdir. Bu nedenle, bu non-invaziv görüntüleme yöntemine başvurmak klinik çalışmalara preklinik çalışmaların çevirisini büyük ölçüde teşvik etmektedir16,22. Ayrıca, her hayvan zaman içinde kendi kontrolünü temsil ettiği için gerekli hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur.
Bu yazıda, atimik farelerin plevral kaviteye insan MPM hücre hattı H2052/484 enjeksiyonu sonrasında elde edilen güvenilir bir ortotopik ksenogreft MPM modeli saılmaktadır. [18F]FDG-PET/CT görüntüleme ile birleştiğinde, bu model insan MPM için yeni tanı stratejileri ve tedavilerin fonksiyonel ve mekanistik etkilerini incelemek için değerli ve tekrarlanabilir bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi ve İsviçre'nin Cenevre veteriner devlet ofisi tarafından onaylanmıştır (Yetki GE/106/16). MPM hücre hattı H2052/484 kuruldu ve Colin DJ ve ark.23makalesinde ayrıntılı olarak bizim laboratuvarda karakterize . Kısaca, NCI-H2052 (ATCC) hücrelerinin immüneksik Nude farelere intrapleural enjeksiyonu sonrasında elde edilen torasik tümörden H2052/484 hücre hattı oluşturuldu.
1. Deneysel Tasarım
- Istatistiksel güç hesaplamasını kullanarak deneye göre kaç fareye ihtiyaç duyulduğunu belirleyin (örn. http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
- İmplantasyondan en az bir hafta önce, sekiz ila on haftalık atimik dişi çıplak fareler Foxn1nu nu/nu satın alın ve onları en az bir hafta süreyle özel patojensiz (SPF) bir ortamda barındırın.
2. İmplantasyon için Hücrelerin Hazırlanması
- Her fareye 1 x 106 hücre enjekte edildiği için kaç H2052/484 hücresine ihtiyaç duyulduğunu hesaplayın (adım 1.1). Farelere enjeksiyon şırınga örnekleme içerecektir gibi hücrelerin ekstra sayıda hazırlayın.
- RPMI 1640 orta sındaki MPM H2052/484 hücre hattı %10 (v/v) fetal büyükbaş serum (FBS), 100 Adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile 37 °C'de bir doku kültürü kuvözde %5 CO2.
- Yaklaşık% 80 biraraya implantasyon için kültür hücreleri (~ 7 x 106 hücre 15 cm Petri çanak başına).
- Aşılamadan önce yaklaşık 1 saat, hücreleri hazırlayın.
- Ortamı atın, hücreleri kalsiyum ve magnezyum olmadan steril PBS ile yıkayın (15 cm Petri kabıbaşına 10 mL) ve hücreleri %0,05 trippsin-2 mM EDTA (15 cm Petri kabıbaşına 2 mL) ile 5 dakika kuluçkaya yatırarak ayırın.
- RPMI ortamda hücreleri toplamak (15 cm Petri çanak başına 10 mL) ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak.
- Adım 1.2'ye göre hesaplanan fare sayısı için uygun sayıda hücre toplayın.
- 3 dk için 300 x g santrifüj, FBS olmadan RPMI orta 10 mL hücre pelet yıkama ve 3 dk için 300 x g tekrar santrifüj.
- Her fare50 μL hacim enjekte edilmelidir gibi 50 μL başına 1 x 106 hücre konsantrasyonu FBS olmadan RPMI orta uygun bir hacimde hücreleri yeniden askıya.
3. Tümör Hücre İmplantasyonu
- İmplantasyondan önce, tüm yüzeylere dezenfektan püskürterek anestezi sistemini ve cerrahi alanı laminar akış kaputunda hazırlayın. Anestezi sistemi, fare vücut ısısını korumak için ısıtma yastığı, poliviyoiyot çözeltisi, 30 G Hamilton şırınga (örneğin, 705RN şırınga, 30 G iğne-20 mm-Point Style 4), steril gazlı bez ve pamuk lu bezler, steril tek kullanımlık neşterler ve ameliyat aletleri ile steril mikropipetler ve ipuçları.
- Mikroizole SPF kafeslerini dezenfekte edilmiş akış başlığında tutun ve açın ve aşılama hızına göre bir fareyi birbiri ardına uyuştururun. Aşılama süresi deney yapılan teknisyenler için yaklaşık 5-10 dakikadır.
- % 4-5 isofluran ile ilk indükleyerek fareler anestezik. Daha sonra % 3 izofluran ile greftleme sırasında ısıtma yastığı üzerinde anestezi altında korumak. Fare ile düzeltme refleks kaybı ile anestezi derinliğini belirleyin.
- Bir fare anestezi edildikten sonra, subkutan olarak 0.05 mg/kg buprenorfini analjezik/postoperatif ağrı kesici olarak enjekte edin.
- Fareyi sağ tarafına (sağ yan dekübitus) ısıtma yastığına yerleştirin.
- Cerrahi bölgeyi polivito iyot solüsyonu ile temizleyin ve kaburgaları ortaya çıkarmak için cildin 5 mm'lik bir kesisini yapın ve çevredeki yağ ve kasları künt makasla temizleyin.
- FBS olmadan RPMI orta 50 μL başına 1 x 10 6 hücre konsantrasyonu 1 x 106 hücre konsantrasyonu hücre süspansiyon homojenize ve Hamilton şırınga ile süspansiyon 50 μL yükleyin. Hava kabarcıkları kaçının ve hücrelerin non-ortotopik greftleme önlemek için% 70 alkol ile iğne silin. Her enjeksiyondan önce hücre süspansiyonu homojenize.
- Hücreleri 6ve 7 kaburga arasındaki plevral kaviteye 30° açı ve interkostal kasların hemen altında 2-3 mm derinlikte yavaşça enjekte edin. İğneyi kaburgaların altında tutarak akciğerlere enjekte etmemeye özen. İğne kaslar aracılığıyla saydamlık la görülmelidir(Şekil 1A).
- Yarayı 3-4 emilebilir dikişle kapatın.
- Fareleri uyanana kadar Sıcak bir ortamda saklayın.
- Ertesi gün, buprenorfin enjeksiyonu tekrarlayın. Fareleri deneysel tasarım ve yetkilendirmeye göre izleyin.
4. [18F]FDG-PET/CT Görüntüleme
NOT: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler yerel hayvan barınma ve görüntüleme tesisleri tarafından onaylanmalıdır. Radyoaktif maddelerin yerel radyasyon güvenliği kurallarına (örn. stok çözümleri aktivitesi, korumalı başlık kullanımı) göre ithal edildik, depolandı ve işlendiğinden emin olun. SPF koşulları, laminar akış kaputunda ki hayvanları manipüle ederek ve SPF uyumlu tarayıcı yatağına yüklenerek korunabilir(Şekil 1B, C).
- H2052/484 hücrelerinin implantasyonundan sonra 7. Her hayvan zaman içinde kendi kontrolünü temsil eder.
- Varsa fareleri görüntüleme tesisine taşıyarak veya tesise yakın tutarak hayvanların sıkıntısını önleyin.
- [18F]F]FDG-PET/CT'den önce 12-16 saat boyunca hızlı fareler arka plan sinyallerini azaltır. [18F]F]FDG-PET/CT taramaları üzerindeki hayvan işlemeetkisini açıklayan Fueger24'e bakınız.
- Farelerin yatağını yerel kurallara göre dezenfekte edin ve saklayın.
- SUV'ları hesaplamak için radyoaktivite dozları ölçümleri, enjeksiyonlar ve PET taramalarının tüm zamanlarını kaydedin.
- [18F]FDG enjeksiyonundan önce 30 °C'de 30 °C'de önceden ısınmış fareler kahverengi yağ dokusu (BAT) metabolizmasını azaltır. Örneğin, ısıtma odalarında, ısıtma pedleri kullanarak veya kızılötesi lambalar kullanarak önceden ısıtın.
- Bir doz kalibratör kullanarak 1 mL insülin şırıngalarında 150-200 μL salinde stok çözeltisinden 3-4 MBq doz[18F]FDG hazırlayın. İnsülin şırıngaları neredeyse hiç ölü hacime sahip olma avantajına sahiptir ve enjeksiyon dan sonra kalan aktivitenin ölçülmesini önleyebilir.
- Adım 3.3 açıklandığı gibi isoflurane ile fareler anestezi. Fareleri tartın ve intravenöz olarak 3-4 MBq enjekte edin [18F]FDG. Retro-orbital enjeksiyon hızlı olduğu için tercih bir yöntemdir, kolay ve kuyruk damar enjeksiyonu sorunları veya intraperitoneal enjeksiyon gecikmiş alımı önler.
- Enjeksiyondan sonra, 3.5 adımda başlatılan sıcak koşullarda fareleri kafeslerinde 45 dk uyanık bırakın. [18F]FDG alımının süresi 1 saattir; 15 dk normalde yatağa fareler yüklemek ve PET önce CT gerçekleştirmek için yeterlidir.
- Adım 3.3'te açıklandığı gibi isofluran ile fareleri uyuşturun ve tarayıcı yatağına yükleyin (Şekil 1B).
- Yatağı tarayıcıya aktarın ve hayvanları akciğerlere odaklanmış bir TOM ografiye aktarın. 74 mm (1.6x büyütme, Triumph edinimi örneği)(Şekil 1C)görüş alanı ile 360° dönüş sırasında 80 kVp, 160 μA, 1024 projeksiyonlar taramaları elde edin.
- Yatağı PET alt sistemine taşıyın ve [18F]FDG enjeksiyonundan 15 dakika sonra 1 saat alıma başlayın. PET/CT sistemlerinin çoğunda yatak, FOV'u aynı alanda ortalamak için CT'den PET'e otomatik olarak taşınabilir.
- Fareleri görüntüleme odasından çıkarın ve kafeslerinde iyileşmelerine izin verin.
- Fareleri yerel kurallara göre radyoaktif bozunmaya adanmış bir alanda tutun.
5. [18F]FDG-PET/CT Taramalarının Analizi
- 512 matrisi ve 0,144 mm voxel boyutu (Filtrelenmiş Geri Projeksiyon-FBP algoritması, dahili yazılım) ile yukarıda belirtilen koşullarda gerçekleştirilen CT taramaları yeniden yapılandırmak. Bir Sipariş Alt Küme Beklenti Maksimum-3 Boyut-OSEM3D algoritmasının 20 yinelemesini kullanarak PET taramalarını yeniden yapılandırın. Bir hayalet silindirtileterek Bq/mL'deki görüntüleri kalibre edin. Yerleşik yazılım çözümünüze göre CT ve PET taramalarını otomatik olarak birlikte kaydedin.
- Analiz yazılımı(Tablo Malzemeler)kullanarak akciğer hacimlerini analiz edin.
- Açık Veri simgesine tıklayarak CT verilerini referans olarak(Ref)yükleyin. Ardından, Append Data simgesine tıklayarak PET verilerini giriş olarak(Inp1)yükleyin.
- CT ve PET'in renk terazilerini ("WL") görsel inceleme için kontrast görüntülere göre ayarlayın.
- Açılan menüden 3D Yatırım Getirisi Aracı'nı seçin, YG Ekle'ye tıklayın ve dosyayı Akciğerlerolarak adlandırın. Segmentasyon Algoritmaları tıklayınız | Mahalle Eşik. Girişi Arka Plan ve Görüntü olarak Ref olarak tanımlayın. Fare akciğer yoğunluğu değerlerine göre Min ve Max girin, genellikle -800 ve -300 HU. VTK simgesine tıklayarak 3B işlenmiş akciğerleri inceleyin ve Tablo Simgesini Göster'etıklayarak oluşturulan tablodaki sesi alın.
- Maksimum Standart Alım Değerleri (SUVmax) çıkararak tümörlerde[18F]FDG alımını analiz edin.
- Açılan menüden Aritmetikler seçerek Bq/mL'de kalibre edilmiş PET görüntülerini SUV'a dönüştürün, daha sonra Scalar Çarpma ve inp1'i Seçili olarak kullanın ve Scalar Bq/mL'dir VE SUV faktörü aşağıdaki gibi hesaplanır: SUV = (Bq/mL)/(enjekte edilen doz (Bq)/vücut ağırlığı(g)).
- Açılan menüden 3D Yatırım Getirisi Aracı'nı seçin, RoI Ekle'ye tıklayın ve tümördosyasını adlandırın. 3D Boya moduna tıklayın | Küre. Yalnızca 2B'nindenetimini kaldırın. Şeklin boyutunu ayarlayın ve tümörleri çevreleyen. Örneğin kalpten gelen herhangi bir müdahale sinyali eklemeyin. TabloYu Göster Simgesi'netıklayarak oluşturulan tablodaki SUVmax değerini alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
H2052/484 ortotopik model
Ortotopik MPM modelleri kültürlü kanser hücrelerinin intra-torasik enjeksiyonu ile, özellikle H2052/484 hücreleri kurulumu nispeten kolaydır. Yukarıda açıklanan farklı adımlar sadece mütevazı hücre kültürü bilgisi gerektirir ve cerrahi adımlar orta eğitimli hayvan deneyciler için erişilebilir. Çıplak fareler ve hücreler implantasyonların sonucunu en üst düzeye çıkarmak için steril koşullar altında manipüle edilmelidir. Kısa anestezi ve minimal cerrahi içeren bu protokolü dikkatle izleyerek, farklı MPM hücre hatları enjekte edilen 266 fare arasında sadece 1 ölümle karşılaştık. Açıklandığı gibi özenle enjekte edilen 266 fare arasında tümör hücrelerinin pnömotoraks veya intrapulmoner implantasyonları gözlenmedi. Özellikle, H2052/484 hücre hattının ortotopik tümör gelişim hızı enjekte edilen farelerin %93.8'inden (n = 118) beri yüksektir. H2052/484 tümörleri enjeksiyondan 14 gün sonra PET/BT görüntüleme ile saptanabilir ve son nokta kriterlerimize göre deneyin ortanca süresi temsili bir deneyde 31 gün idi21. Bu çalışmada açıklandığı gibi21, tümörler torasik kavite lokalize edildi, serbestçe dağıtılan veya akciğerlerüzerinde bağlı, torasik kaslar, aort kemer veya inferior vena kava. Metastaz bulunamadı.
[18F]FDG-PET/CT görüntüleme ile MPM izleme
Ortotopik MPM, yüksek metabolik tümörlerde biriken yaygın olarak kullanılan radyotracer[18F]FDG ile kombine PET/BT görüntüleme si ile haftalık olarak izlendi. Uzunlamasına anatomik BT taramaları, MPM gelişiminin akciğerlerin morfolojisi üzerindeki etkisini görselleştirmeyi sağladı. CT taramalarında yüksek kontrastlı akciğerlerin otomatik segmentasyonu, çevre dokulara göre düşük yoğunlukları nedeniyle basittir. 3D render tümörlerin lokalizasyonuna genel bir bakış sağlar ve akciğerlerin uzunlamasına hacimleri ayıklanabilir(Şekil 2A). İntraplevral (ipl) H2052/484 tümörü olan farelerin MPM enjeksiyonu sonrasında BT ile akciğer hacimleri ölçümleri zaman içinde önemli ölçüde azalmıştır(Şekil 2B). Gerçekten de, MPM tümörlerplevral kavite içinde büyümek ve akciğerler üzerinde basınç oluşturmak, onların hacimleri azaltarak. Korelasyon analizleri akciğer hacimlerinin 0.8'in R2 saptama katsayısı ile izleme süresiyle ters orantılı olduğunu göstermiştir(Şekil 2C). Bu veriler, bu MPM modelinin gelişimini izlemek için CT taramasının güvenilirliğini gösterir.
BT ile birlikte [18F]FDG-PET taraması MPM tümörlerinin metabolik durumu hakkında ek ve değerli bilgiler sağlar. Bazen CT ve PET taramaları görüntüleri tek başlarına yorumlamak karmaşık olsa da, özellikle erken zaman noktalarında, her iki yöntemin bir kombinasyonu tanıya daha fazla sağlamlık kazandırır. Nitekim, ipl H2052/484 tümörlü bir farenin 10 gün ile 44 gün arasında yapılan temsili uzunlamasına [18F]FDG-PET/BT takibi, tümörlerin aşılamadan 2 hafta sonra ayırt edilebilir olmaya başladığını göstermektedir (Şekil 3A). Bu örnek, torasik boşluğun çevresinde ve kalp boyunca büyük damarlar (beyaz oklar) bulunan tümörlerin büyüme ve [18F]FDG avidite vurgulamaktadır. [18F] Tümörlerde FDG alımı, tümörler in üzerine çekilen ROI'larda SUVmax'in çıkarılmasıyla, CT taramaları yardımıyla ölçüldü ve glikoz metabolizmasında önemli zamana bağlı artışlar göstermektedir(Şekil 3B). Korelasyon analizleri, SUVmax'in 0.7'nin R2 tayini katsayısı ile izleme süresiyle pozitif korelasyon gösterdiğini göstermiştir(Şekil 3C). Bu veriler [18F]FDG-PET taramalarının güvenilirliğini gösterilmiş ve H2052/484 ortotopik tümörlerin akıbetini izleyin. Son olarak, akciğer hacimleri ve [18F]FDG aviditesi, sırasıyla, CT ve PET tarafından analiz edilerek, mpm ortotopik tümörlerin gelişimini incelemek için bu ölçümlerin gücünü destekleyen 0.6 R2 ile ilişkilidir(Şekil 4).
Şekil 1: Çıplak fare ortopik ksenogreft modeli. (A) Protokol bölümünde açıklandığı gibi insan MPM hücrelerinin sol plevral kaviteye intraplevral (ipl) enjeksiyonu. (B,C) Fareler anestezi edilir ve pet/CT yatağına laminar akış başlığıiçinde yüklenir ve tarayıcıya aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BT tarafından izlenen ortotopik H2052/484 MPM modelinin tümör büyümesi. (A) H2052/484 MPM ipl tümörleri gösteren BT taramalarının temsili 3D rekonstrüksiyonları ve implantasyondan sonraki günlerde çeşitli zamanda akciğer hacmi (Vp) üzerindeki etkileri. Beyaz ok uçları MPM ipl tümörlerinin yerini gösterir. (B) Akciğer hacimlerinin temsili zaman rotalarını gösteren keman çizimi (VL), n = 6. Tukey'in çoklu karşılaştırma istatistikleri ile tek yönlü ANOVA testi gösterilir. Harfler sırasıyla D10, D16, D23, D29, D36 ve D44'ü gösteren a, b, c, d, e, f modelleri arasında anlamlı farklar gösterir. Karşılık gelen p değerleri: x, p < 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p < 0.001; xxxx, p < 0.0001. (C) Ipl MPM gelişimi ile ilgili akciğer hacminin azalması ile enjeksiyon sonrası zaman arasındaki korelasyon. Doğrusal regresyon kalın renkli bir çizgi ve ilgili SD kesikli siyah çizgiler olarak çizilir. Yazılım ile grafikler ve istatistiksel analizler yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ipl MPM modelinin tümör metabolizması [18F]F]FDG-microPET/BT. (A) Temsilci PET/BT taramaları MPM ipl tümörlerini gösterir. PET/BT görüntüleri, göğüs bölgesinin [18F]FDG-avid tümörlerini içeren trans-eksenel dilimler, CT (gri skala) anatomik bilgi ve yüksek tümör ve organ glikozunun konumunu ve yoğunluğunu gösteren PET (kalibre edilmiş sözde renk ölçeği) gösterir. Enjeksiyon sonrası günler belirtilir. BT: BT mediastinal pencere; [18F] FDG-PET/CT: PET ve CT taramalarının erimiş görüntüsü. Beyaz ok başları MPM ipl tümörleri gösterir. L = akciğer, H = kalp, BAT = kahverengi yağ dokusu. (B) MPM metabolizmasına bağlı SUVmax'in temsili zaman rotasını gösteren keman çizimi, n = 6. Tukey'in çoklu karşılaştırma istatistikleri ile tek yönlü ANOVA testi gösterilir. Harfler sırasıyla D10, D16, D23, D29, D36 ve D44'ü gösteren a, b, c, d, e, f modelleri arasında anlamlı farklar gösterir. Karşılık gelen p değerleri: x, p < 0.05; xx, p < 0.01; xxx, p < 0.001; xxxx, p < 0.0001. (C) IPL MPM tümörlerinde SUVmax artışı ile enjeksiyon sonrası zaman arasındaki korelasyon. Doğrusal regresyon kalın renkli bir çizgi ve ilgili SD kesikli siyah çizgiler olarak çizilir. Yazılım ile grafikler ve istatistiksel analizler yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Akciğer hacmi ile izlenen MPM gelişimi ile metabolik tümör aktivitesi arasındaki korelasyon. SUVmax ve akciğer hacmi arasındaki korelasyon (VL)kalın renkli bir çizgi ve kesik li siyah çizgiler olarak ilgili SD olarak çizilmiş doğrusal bir regresyon olarak görüntülenir. Yazılım ile grafikler ve istatistiksel analizler yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, atimik farelerin plevral kavitesinde enjekte edilen MPM H2052/484 hücrelerinin orijinal ortotopik modeli ve küçük hayvan PET/CT görüntüleme siyumlama yöntemi açıklanmaktadır. Bu model orta hayvan işleme ve cerrahi becerileri ile uygulanabilir ve çok iyi bir gelişme oranı görüntüler. Tedavi edilmeyen farelerde yaklaşık 10 haftalık büyük bir deneysel pencere ve enjeksiyondan 2 hafta sonra tümörlerin non-invaziv longitudinal tespitine olanak sağlar.
Ortotopik modeller, canlı hücrelerin veya dokuların doğrudan tümörün ilk ortamına yerleştirilmesine dayanır. Yaygın olarak kullanılan deri altı veya intraperitoneal MPM modelleri ile intraplevral modeller arasındaki temel fark mikroçevrelerinde dir. Nitekim, tümörlerin mikroortamda kanser hücrelerine ek olarak birden fazla stromal hücre tipleri (fibroblastlar, lökositler, makrofajlar) içerir25. Bu stromal hücreler büyüme faktörleri ve tümör büyümesini modüle tümör mikroçevrekatkıda salgılar. Tümör mikroortamı anatomik bölgeye göre değişir ve ortotopik ksenogreft gelişeceğini ve bir tedaviye deri altı bir den farklı tepki verecektir25. Bu nedenle, ortotopik ksenogreftler MPM hastalarında bulunan bir karşılaştırılabilir mikroçevre ile çevrili olduğundan, onların davranış ve tedaviye yanıt daha iyi klinik durumu yansıtmalıdır17,19.
Kanser araştırmalarında birçok preklinik model insan ksenogreft başarısı sağlamak için immünoeksik fareler ima. Çıplak fareler olgun timus sahip değildir ve tümör mikroenvironment26hayati bir parçası eksikliği. Çıplak fareler olgun timus ait olmamasına ve sonuç olarak T hücrelerinde eksik olmasına rağmen, daha müsamahakar ve son derece eksik SCID fareler aksine kendi plevral mikroortamda olgun lenfositler B, nötrofiller, monositler ve makrofajlar mevcut26. MPM gelişiminin erken aşamalarında, düzenleyici T hücreleri önemli bir bastırıcı role sahiptir. Ancak, daha ileri aşamalarında, nötrofiller ve makrofajlar da dahil olmak üzere miyeloid hücreler Treg hücrelerinin yerini; Bu fonksiyonda, düzenleyici T hücrelerinin bastırıcı rolü sadece MPM gelişiminin erken aşamalarında önemlidir23,27. Sonuç olarak, tam bir immün yanıt içeren çalışmalar (örneğin, T yanıtı içeren immünoterapiler) burada sunulan modelde çalışılamaz, ancak bu ortotopik modelin yeni tedavileri veya MPM'nin yeni tanı araçlarını değerlendirmek için tüm ilgisini koruduğunu öne sokuyoruz.
Metodolojik bir bakış açısıyla, intraplevral MPM tümörlerinin gelişimini en üst düzeye çıkarmak için akılda tutulması gereken kritik adımlar vardır. Fare modelleri oluşturmadan önce, katlanarak büyüyen hücrelere (hücre hatlarına bağlı olarak %80'den az bir araya gelmek) ve 8 ila 10 ay boyunca acclimated farelere erişebilirler. Gerçekten de, genç küçük fareler enjekte zordur ve ektopik enjeksiyonlar neden olabilir ve hayatta kalma değiştirebilir. İmplantasyon işlemi sırasında standart cerrahi önlemler alınmalı ve özellikle kanamayı önlemek için aşındırMa sırasında künt makas kullanılmalıdır, bu da hayvanların ölümüne yol açabilir. Şırınga seçimi (örneğin, burada açıklanan model) ve burada sunulan protokol intraplevral enjeksiyon (30 ° açı, 2-3 mm derinlik) sağlamak için tümör hücreleri içeren orta küçük bir hacim hassas ve nazik enjeksiyon sağlar.
Ortotopik MPM modellerinin uzunlamasına takibi ancak görüntüleme teknikleri ile non-invaziv olarak yapılabilir. PET/BT klinik uygulamada MPM tanısı için tavsiye edilen bir yöntemdir ve sonuç olarak bu çalışmada20,21kullanılmıştır. Yaygın olarak kullanılan optik görüntüleme ile karşılaştırıldığında, PET / CT görüntüleme radyoaktif bileşiklerin kullanımını içerir ve bu nedenle güvenlik nedeniyle kurulum için daha hassas, radyotracers lojistik ve maliyeti28. Bununla birlikte, PET/BT görüntüleme tümör hücrelerinin genetik modifikasyonuna dayanmaz ve yüksek çözünürlüklü tomografik, anatomik ve moleküler bilgi sağlar. Optik görüntüleme de PET / CT daha hızlı ama bu makalede sunulan görüntüleme sistemi 3-fare yatak içerir ve yaklaşık 20 fareler günde taranabilir, toplanan bilgiler göz önüne alındığında makul bir iş kolu. Son derece mevcut klinik radyotracer kullanımı [18F]FDG bu teknik29ile yapılan araştırma için yüksek bir çeviri gücü garanti eder. [18F]FDG-PET taraması okumaları ve analizleri, çevredeki kalp ve kahverengi yağ dokularında yüksek alım nedeniyle biraz deneyim gerektirse de, BT ile kombinasyonu tanıyı geliştirir. [18F]FDG PET/CT deneyleri sırasında, oruç ve ısınma farelerin yanı sıra [18F]FDG 1 saat bir alım süresi gerçekleştirmek önemli ölçüde tümörlerin görselleştirme artırabilir çünkü tetkik koşulları son derece etkisi PET kontrastlar zaten açıklandığı gibi24. [18F]Fluorothyidin (FLT) veya [18F]Fluoromisonidazol (FMISO) gibi klinik olarak kullanılan diğer radyoizleyicileri içeren preklinik ortotopik modeller üzerinde yapılan çalışmalar, sırasıyla proliferasyon ve hipoksiyi izleyen, bu tür güvenilir ortotopik MPM modelleri hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir29.
Son olarak, non-invaziv görüntüleme ile birlikte bu ilgili çeviri modeli mükemmel 3R kavramı ile uyumludur: Reduce hayvan sayısı, Refine ağrı ve rahatsızlık ve alternatifleri ile Replace hayvan deneyi22. Gerçekten de, aynı hayvan kümesi içinde, terapötik takip ve yanıt non-invaziv deneyler boyunca uzunlamasına ölçümler izin izlenebilir, böylece deney başına gerekli hayvan sayısını azaltarak. Ayrıca, her hayvan zaman içinde kendi kontrolünü temsil ettiği için, non-invaziv görüntüleme de son derece güvenilir veri elde etmek için gerekli hayvanların sayısını azaltarak istatistiksel güç artırmak16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Ligue Genevoise contre le Cancer (V.S.-B.) ve Cenevre ve Lozan Üniversiteleri ve Hastaneleri Biyomedikal Görüntüleme Merkezi (CIBM) tarafından (D.J.C., O.B. ve S.G.)'ye finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
- Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
- Mossman, B. T., Gee, J. B. Asbestos-related diseases. The New England Journal of Medicine. 320 (26), 1721-1730 (1989).
- Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
- Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
- LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
- Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
- Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
- Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
- Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
- Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
- Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A. Malignant mesothelioma. The Lancet. 366 (9483), 397-408 (2005).
- Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
- Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
- Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
- Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
- de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
- Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
- Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
- Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
- Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
- Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
- Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).
