Summary
Denne artikkelen beskriver generering av en orthotopic mus modell av menneskelig pleural mesothelioma av implantation av H2052/484 Mesothelioma celler inn i pleural hulrom immunsupprimerte athymic mus. Den langsgående overvåking av utviklingen av intrapleural svulster ble vurdert av ikke-invasiv multimodal [18F] -2-fluoro-2-Deoxy-D-glukose positron utslipp tomografi og beregnede tomografi Imaging.
Abstract
Ondartet pleural mesothelioma (MPM) er en sjelden og aggressiv svulst som oppstår i Mesothelium som dekker lungene, hjertet og bryst hulen. MPM utvikling er i hovedsak knyttet til asbest. Behandlinger gir bare beskjeden overlevelse siden median overlevelse gjennomsnittet er 9 – 18 måneder fra tidspunktet for diagnosen. Derfor må mer effektive behandlinger identifiseres. De fleste data som beskriver nye terapeutiske mål, ble innhentet fra in vitro-eksperimenter og må valideres i pålitelige in vivo prekliniske-modeller. Denne artikkelen beskriver en slik pålitelig MPM orthotopic modell innhentet etter injeksjon av en menneskelig MPM cellelinje H2052/484 i pleural hulrom immunodeficient athymic mus. Transplantasjon i orthotopic området kan studere progresjon av tumor i det naturlige in vivo miljø. Positron utslipps tomografi/beregnet tomografi (PET/CT) molekyl avbildning ved hjelp av klinisk [18f] -2-fluoro-2-Deoxy-D-glukose ([18F] FDG) radiotracer er diagnose metoden som er valgt for å undersøke pasienter med MPM. Følgelig [18F] FDG-pet/CT ble brukt til å lengderetningen overvåke sykdomsprogresjon av H2052/484 orthotopic modell. Denne teknikken har en høy 3R potensial (reduce antall dyr, refine å minske smerte og ubehag, og rErstatt dyr eksperimentering med alternativer) siden tumor utvikling kan overvåkes ikke-invasivt og antall dyr som kreves kan bli betydelig redusert.
Denne modellen viser en høy utviklings rate, en rask tumor vekst, er kostnadseffektiv og gir mulighet for rask klinisk oversettelse. Ved å bruke denne orthotopic xenograft MPM-modellen kan forskerne vurdere biologiske svar på en pålitelig MPM-modell etter terapeutiske intervensjoner.
Introduction
Ondartet pleural mesothelioma (MPM) er en kreft som oftest assosiert med eksponering for asbest fiber1,2,3. Selv om asbest har vært forbudt i de fleste vestlige land4,5,6, forekomsten av MPM er fortsatt økende7,8. Nylig, antyder eksponering av mus til Carbon nanorør at de kan føre til betydelig helserisiko hos mennesker9,10. Dataene tyder på at eksponering for disse produktene kan indusere kroniske betennelser og molekylære endringer (f. eks, tap av tumor-Suppressor trasé) som ligger til grunn progresjon til ondartet mesothelioma. For tiden er multiwall Carbon nanorør en av de viktigste produktene av nanoteknologi og er i økende grad innarbeidet i ulike produkter som kompositter, energi lagrings materialer, medisin, elektronikk og miljømessige Utbedring materialer.
MPM er en kreft med dårlig prognose, og de fleste pasientene dør innen to år etter diagnosen på grunn av en begrenset effekt av gjeldende behandlingsmetoder11. Valget av behandling for MPM avhenger av kreft fasen. For de fleste tidlig stadium MPM (trinn 1 og muligens noen trinn 2 eller 3 svulster), klinisk tilnærming er en multimodal terapi inkludert kirurgisk reseksjon av svulster, knyttet til strålebehandling og kjemoterapi12. En kombinert kjemoterapi med Cisplatin og pemetreksed er indisert for behandling av de fleste pasienter diagnostisert med avansert lokalt invasiv sykdom, som ikke er mottagelig for kirurgiske reseksjon, eller som ellers ikke kandidater til helbredende kirurgi13,14. Det er derfor et presserende behov for å utvikle mer effektive behandlinger for MPM pasienter. Men, det er få validerte in vivo dyremodeller som reflekterer den kliniske relevansen av MPM. Flere murine MPM modeller har blitt utviklet, men de fleste av dem ikke trofast recapitulate de komplekse aspektene av MPM tumor mikromiljøet15,16,17,18. Bruken av asbest-indusert MPM i mus, genetisk konstruerte MPM musemodeller, eller modeller av syngeneic transplantasjon av murine MPM cellelinjer er begrenset av grunnleggende fenotypiske og funksjonelle forskjeller, og følgelig dårlig oversette nye funn til klinikken. Andre prekliniske murine MPM-modeller er mest avhengige av subkutan eller xenotransplantater av humane cellelinjer i immunodeficient mus. Mens disse modellene er enkle å overvåke og gi fundamentale data, mikromiljøet av disse xenotransplantater er ikke så sammenlignbare med menneskelige svulster svekke den translational kraften i de fleste av disse prekliniske studier17,19. Omvendt, orthotopic xenotransplantater bedre reflektere pasienten svulst atferd og respons på behandling som de er omgitt av en lignende mikromiljøet som den finnes i den opprinnelige tumor området16.
Molekylær Imaging av [18F] FDG-pet/CT er metoden for valg å lengderetningen overvåke sykdomsprogresjon hos pasienter med MPM20,21. Derfor, ty til denne ikke-invasiv imaging metode sterkt fremmer oversettelsen av prekliniske studier til kliniske studier16,22. Dessuten, den hjelper å nedskrive det krevde antallet av dyrene idet hver dyr representerer dens egen administrere over tid.
I denne artikkelen presenterer vi en pålitelig orthotopic xenograft MPM-modell innhentet etter injeksjon av den menneskelige MPM cellelinjen H2052/484 inn i pleural hulrom av athymic mus. Sammen med [18F] FDG-pet/CT Imaging, denne modellen er en verdifull og reproduserbar metode for å studere funksjonelle og mekanistisk effekter av nye diagnostiske strategier og behandlinger for menneskelig MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene som er beskrevet nedenfor, ble godkjent av den institusjonelle dyre omsorgen og bruks komitéen og av veterinær Statens kontor i Genève, Sveits (Authorization GE/106/16). MPM cellelinje H2052/484 ble etablert og karakterisert i vårt laboratorium som beskrevet i artikkelen av Colin DJ og et al.23. Kort, H2052/484 cellelinje ble etablert fra en bryst svulst oppnådd etter en intrapleural injeksjon av NCI-H2052 (ATCC) celler til immunodeficient Nude mus.
1. eksperimentell design
- Bestem hvor mange mus som trengs i henhold til eksperimentet ved hjelp av statistisk kraft beregning (f.eks. http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
- Minst en uke før implantation, kjøpe åtte til ti uker gamle athymic kvinnelige nakne mus Foxn1nu nu/Nu og huset dem i et bestemt-patogen-fri (SPF) miljø i minst en uke.
2. utarbeidelse av celler for implantation
- Beregn hvor mange H2052/484 celler er nødvendig som hver mus injiseres med 1 x 106 celler (trinn 1,1). Forbered et ekstra antall celler som injeksjon til mus vil innebære sprøyte prøvetaking.
- Kultur MPM H2052/484 cellelinjen i RPMI 1640 medium supplert med 10% (v/v) fosterets storfe serum (FBS), 100 enheter/mL penicillin og 100 μg/mL Streptomycin i en vev kultur inkubator ved 37 ° c med 5% CO2.
- Kultur celler for implantation til ca 80% samløpet (~ 7 x 106 celler per 15 cm Petri parabolen).
- Om 1 time før pode, forberede cellene.
- Kast mediene, vask celler med steril PBS uten kalsium og magnesium (10 mL per 15 cm Petri parabol) og løsne celler ved incubating i 5 min med 0,05% Trypsin-2 mM EDTA (2 mL per 15 cm Petri parabol).
- Samle cellene i RPMI medium (10 mL per 15 cm Petri parabol) og telle cellene ved hjelp av en hemocytometer.
- Samle det aktuelle antall celler for antall mus som skal injiseres vurderer som beregnet i henhold til trinn 1,2.
- Sentrifuger på 300 x g i 3 min, vask celle pellet i 10 ml RPMI medium uten FBS og sentrifuger igjen ved 300 x g i 3 min.
- Resuspend cellene i et passende volum av RPMI medium uten FBS til en konsentrasjon på 1 x 106 celler per 50 μL som hver mus må injiseres med et volum på 50 μL.
3. tumor celle implantation
- Før implantation, forberede anestesi systemet og operasjonsområdet i en laminær Flow hette ved sprøyting alle overflater med et desinfeksjonsmiddel. Forbered sterile eller desinfiseres forsyninger i laminær Flow hette inkludert anestesi system, oppvarming pad for å opprettholde musen kroppstemperatur, den polyvidone jod løsning, en 30 G Hamilton sprøyte (f. eks 705RN sprøyte, 30 G nål-20 mm-Point Style 4), steril gasbind og bomullspinner, sterile en gangs skalpeller og Kirurgiske instrumenter og sterile Mikropipetter og spisser.
- Oppbevare og åpen det microisolated SPF-burene inne det desinfiseres flyte Hood og dop ettall musen etter det annet alt etter det pode fart. Pode varighet er ca 5-10 min for eksperimenterte teknikere.
- Dop mus ved å indusere først med 4-5% isoflurane. Deretter opprettholde under anestesi på varmeputen mens pode med 3% isoflurane. Bestem dybden av anestesi ved tap av rettende refleks med musen.
- Når en mus er anesteserte, injiserer du subkutant 0,05 mg/kg buprenorfin som en smertelindrende/etter operasjon.
- Plasser musen på høyre side (høyre lateral ligge) på varmeputen.
- Rengjør operasjonsområdet med polyvidone jod løsning og lage en 5 mm snitt av huden og klare rundt fett og muskler med stump saks for å avdekke ribbeina.
- Homogenisere celle fjæringen ved en konsentrasjon på 1 x 106 celler per 50 ΜL av RPMI medium uten FBS og Last 50 μL av suspensjonen med Hamilton-sprøyten. Unngå luftbobler og tørk nålen med 70% alkohol for å unngå ikke-orthotopic pode av celler. Homogenisere celle fjæringen før hver injeksjon.
- Langsomt injisere cellene i pleural hulrom mellom 6th og 7th ribbeina med en vinkel på 30 ° og en dybde på 2-3 mm like under interkostalrom musklene. Pass på at du ikke injiserer i lungene ved å holde nålen rett under ribbeina. Nålen skal være synlig ved åpenhet gjennom musklene (figur 1A).
- Lukk såret med tre til fire absorberbare sting.
- Oppbevar musene i et varmet miljø til de våkner.
- Dagen etter, gjenta injeksjon med buprenorfin. Overvåk mus i henhold til eksperimentell design og autorisasjon.
4. [18F] FDG-pet/CT tenkelig
Merk: Alle prosedyrene som er beskrevet nedenfor, må godkjennes av lokale dyre boliger og bildebehandlings anlegg. Sørg for at radioaktive materialer importeres, lagres og håndteres i henhold til lokale sikkerhetsregler for stråling (f.eks. lager løsnings aktivitet, skjermet hette håndtering). SPF forhold kan opprettholdes ved å manipulere dyr i en laminær Flow hette og ved å laste dem i SPF-kompatible skanneren seng (figur 1B, C).
- Overvåke tumor utviklingen utfører PET/CT Imaging, en gang i uken, som starter på dag 7 etter implantation av H2052/484 celler. Hvert dyr representerer sin egen kontroll over tid.
- Unngå nød av dyrene tidligere å tenkelig av transport mus å tenkelig Letter huset hvis anvendelig eller oppbevare seg i nærheten av fasiliteten.
- Raske mus for 12 – 16 timer før [18F] FDG-pet/CT som reduserer bakgrunns signalene. Se Fueger24 som beskrev virkningen av dyr håndtering på [18F] FDG-pet/CT skanninger.
- Decontaminate og lagre mus seng i henhold til lokale regler.
- Ta opp alle tider med radioaktivitet doser målinger, injeksjoner og PET skanner for å kunne beregne SUV-er.
- Pre-Warm mus ved 30 ° c i 30 min før injeksjon av [18F] FDG som reduserer brunt fettvev (bat) metabolisme. For eksempel, pre-varm i varme kamre, ved hjelp av varme pads eller ved hjelp av infrarøde lamper.
- Forbered 3 – 4 MBq doser [18F] FDG fra lagerløsning i 150-200 μL av saltvann i 1 ml insulinsprøyter ved bruk av en dose kalibratoren. Insulin sprøyter har fordelen av å ha nesten ingen død volum og kan unngå måling av gjenværende aktivitet etter injeksjon.
- Dop mus med isoflurane som beskrevet i trinn 3,3. Veie mus og deretter injisere intravenøst 3 – 4 MBq [18F] FDG. Retro-orbital injeksjon er en metode for valg siden det er raskt, enkelt og unngår hale vene injeksjon problemer eller forsinket opptak av intraperitoneal injeksjon.
- Etter injeksjon, la mus våken i 45 minutter i sine bur under de varme forholdene initiert i trinn 3,5. Varigheten av [18F] FDG opptak er 1 time; 15 min er normalt nok til å laste mus på sengen og utføre CT før PET.
- Dop mus med isoflurane som beskrevet i trinn 3,3, og legg dem på skannerens seng (figur 1B).
- Overfør sengen til skanneren og dyr til en CT-skanning sentrert på lungene. Skaff skanninger på 80 kVp, 160 μA, 1024 anslag under en 360 ° rotasjon, med et synsfelt på 74 mm (1,6 x forstørrelse, eksempel på Triumph oppkjøp) (figur 1C).
- Flytte sengen til PET-delsystemet og starte oppkjøpet 1 time etter [18F] FDG injeksjon for en varighet på 15 min. Med det meste av PET/CT systemer, sengen kan flyttet automatisk fra det CT å det PET å oppbevare det FOV sentrert på likt område.
- Fjerne det mus fra det tenkelig kammeret og tillate seg å komme seg inne deres bur.
- Hold mus i et område dedikert til radioaktivt forfall i henhold til lokale regler.
5. analyser av [18F] FDG-pet/CT skanner
- Rekonstruere CT skanninger utført i de forhold som er nevnt ovenfor med en matrise av 512 og en Voxel størrelse på 0,144 mm (filtrert tilbake projeksjon-FBP algoritme, innebygd programvare). Rekonstruere PET avsøker benytter en 20 gjentakelser av en bestilt delsett forventningen maksimum-3 dimensjon-OSEM3D algoritmen. Kalibrer bildene i BQ/mL ved å skanne en fantom sylinder. Registrer CT-og PET-skanninger automatisk i henhold til den innebygde Programvareløsningen.
- Analysere lungene volumer ved hjelp av analyseprogramvare (tabell av materialer).
- Last inn CT-data som referanse (REF) ved å klikke på Åpne data -ikonet. Så belaste PET data idet input (Inp1) av klikker på tilføye data ikon.
- Juster fargeskalaer ("WL") for CT og PET til kontrast bilder for visuell inspeksjon.
- Velg 3D ROI Tool fra rullegardinmenyen, klikk på Legg til avkastning og navngi filen lungene. Klikk på Segmentering algoritmer | Nabolaget terskelverdi. Definer inn data som bakgrunn og bilde som REF. Angi min og Maks i henhold til mus lunge tetthet verdier, typisk-800 og-300 Hu. Inspiser 3D gjengitte lungene ved å klikke på VTK -ikonet og hente volumet i tabellen som genereres ved å klikke på Vis tabell-ikonet.
- Analyser [18F] FDG opptak i svulster ved å trekke ut maksimalt standard opptak verdier (SUVmax).
- Konverter PET bilder kalibrert i BQ/mL til SUV ved å velge aritmetikk fra rullegardinmenyen, deretter skalerbare multiplisere og bruke inp1 som valgt og skalerbare er BQ/ml til SUV faktor beregnet som følger: SUV = (BQ/ml)/(injisert dose (BQ)/Body vekt (g)).
- Velg 3D ROI Tool fra rullegardinmenyen, klikk på Legg til avkastning og navngi filen svulster. Klikk på 3D Paint-modus | Sfære. Fjern merkingen bare 2D. Juster størrelsen på formen og omgi svulster. Sørg for å ikke inkludere forstyrrende signaler som kommer fra hjertet for eksempel. Gjenerverve SUVmax salgsverdi inne bordet utviklet av klikker på viser bord ikon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den H2052/484 orthotopic modellen
Orthotopic MPM modeller ved intra-bryst injeksjon av kultivert kreftceller, spesielt H2052/484 celler er relativt lett å sette opp. Det annerledes skritt beskrevet over bare forlange beskjeden cellen kulturen kunnskap og kirurgi skritt er tilgjengelighet å moderat utdannet dyr forskere. Nakne mus og celler bør manipuleres under sterile forhold for å maksimere utfallet av implantat IONS. Ved nøye å følge denne protokollen, som innebærer kort anestesi og minimal kirurgi, møtte vi bare 1 død blant 266 mus injisert med ulike MPM cellelinjer. Ingen pneumotoraks eller intra-lunge implantat IONS av tumorceller ble observert blant disse 266 musene nøye injisert som beskrevet. Nærmere bestemt er orthotopic tumor utvikling rate av H2052/484 cellelinjen høy siden 93,8% av injisert mus utviklet svulster (n = 118). H2052/484 svulster kan oppdages av PET/CT Imaging fra 14 dager etter injeksjon og median varighet av eksperimentet i henhold til våre endepunkt kriterier var 31 dager i et representativt eksperiment21. Som vi beskrev i denne andre studien21, ble svulster lokalisert i bryst hulen, fritt distribuert eller festet på lungene, brystmusklene, aorta buen eller dårligere vena cava. Metastaser ble ikke funnet.
MPM overvåking av [18F] FDG-pet/CT Imaging
Orthotopic MPM ble overvåket ukentlig ved kombinert PET/CT Imaging med mye brukt radiotracer [18F] FDG som akkumuleres i svært metabolske svulster. Langsgående anatomiske CT skanninger tillot visualisere virkningen av MPM utvikling på morfologi av lungene. Automatisk segmentering av svært kontrast lungene på CT skanninger er enkel på grunn av deres lave tettheten i forhold til omkringliggende vev. 3D-gjengivelser gir en oversikt over lokalisering av svulster og langsgående volumer av lungene kan trekkes ut (figur 2A). Lunge volumer målinger ved CT redusert betydelig over tid etter at MPM injeksjon av mus med intrapleural (IPL) H2052/484 svulster (figur 2B). Faktisk, MPM svulster vokse inne i pleural hulrom og skape press på lungene, redusere sine volumer. Korrelasjons analyser viste at lunge volumer var omvendt korrelert til tidspunktet for overvåking med en koeffisient på bestemmelse R2 av 0,8 (figur 2C). Alt i alt viser disse dataene påliteligheten til CT-skanningen for å overvåke utviklingen av denne MPM-modellen.
Kombinert med CT, en [18F] FDG-pet avsøke skaffer i tillegg og kostbar beskjed på metabolsk rang av MPM svulst. Stund en gang imellom den kan innviklet å tolke CT og PET avsøker profilen av dem selv, særlig for tidlig tid meningene, en kombinasjonen av begge to modaliteter gir fremme robusthet å diagnosis. Faktisk, representative langsgående [18F] FDG-pet/CT overvåking utført mellom 10 dager og 44 dager med en mus med IPL H2052/484 svulster viser at tumorer begynner å være gjenkjennelig 2 uker etter pode (Figur 3a). Dette eksempelet fremhever veksten og [18F] FDG avidity av svulster som ligger i utkanten av bryst hulen og langs hjertet store fartøy (hvite piler). [18F] FDG opptak i svulster ble kvantifisert ved å trekke ut SUVMax i ROIs trukket over svulster, ved hjelp av CT-skanninger, og viser betydelige tidsavhengige økninger av deres glukose metabolisme (Figur 3B). Korrelasjons analyser viste at SUVMax var positivt korrelert til tidspunktet for overvåking med en koeffisient på bestemmelse R2 av 0,7 (Figur 3C). Disse dataene viser påliteligheten til [18F] FDG-pet skanner for å overvåke skjebnen til H2052/484 orthotopic svulster. Til slutt, lunge volumer og [18F] FDG avidity, henholdsvis ANALYSERT av CT og pet, samsvarer med hverandre med en R2 av 0,6 som støtter styrken av disse MÅLINGENE for å studere MPM Orthotopic svulster utvikling (Figur 4).
Figur 1: Nude mus orthotopic xenograft modell. (A) Intrapleural (IPL) injeksjon av menneskelig MPM celler inn i venstre pleural hulrom som beskrevet i protokollen delen. (B, C) Mus er anesthetized og lagt i PET/CT seng i en laminær Flow hette deretter overført til skanneren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: tumor vekst i Orthotopic H2052/484 MPM-modellen overvåkes av CT. (A) representative 3D-REKONSTRUKSJONER av CT-skanninger som viser H2052/484 MPM IPL svulster og deres effekt på lunge volumet (VP) på ulike tidspunkt i dager etter implantation. Hvite pilspisser viser plasseringen av MPM IPL svulster. (B) fiolin plot viser en representativ gang løpet av lunge volumer (VL), n = 6. Enveis ANOVA-test med Tukey statistikk for flere sammenligninger indikeres. Bokstaver indikerer vesentlige forskjeller mellom modeller med a, b, c, d, e, f indikerer henholdsvis D10, D16, D23, D29, D36 og D44. Tilsvarende p-verdier: x, p < 0,05; xx, p < 0,01; XXX, p < 0,001; xxxx, p < 0,0001. (C) korrelasjon mellom reduksjon av lungevolum knyttet til IPL MPM utvikling og tid etter injeksjon. Lineær regresjon tegnes som en tykk farget linje og tilhørende SD som stiplede svarte linjer. Grafer og statistiske analyser ble utført med programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: tumor metabolisme i IPL MPM-modellen etterfulgt av [18F] FDG-MICROPET/CT. (A) representant pet/CT skanner viser MPM IPL svulster. PET/CT bilder viser trans-aksial skiver av brystet området inneholder [18F] FDG-Avid svulster, med CT (gråskala) gir anatomisk informasjon og pet (kalibrert pseudo-fargeskala) som viser plasseringen og intensiteten av høy tumor og organ glukose utnyttelse. Dager etter injeksjon er angitt. CT: CT mediastinale vindu; [18F] FDG-PET/CT: smeltet bilde av PET og CT skanninger. Hvite pilspisser viser MPM IPL svulster. L = lunge, H = hjerte, BAT = brunt fettvev. (B) fiolin plot viser en representativ tid løpet av SUVMax knyttet til MPM metabolisme, n = 6. Enveis ANOVA-test med Tukey statistikk for flere sammenligninger indikeres. Bokstaver indikerer vesentlige forskjeller mellom modeller med a, b, c, d, e, f indikerer henholdsvis D10, D16, D23, D29, D36 og D44. Tilsvarende p-verdier: x, p < 0,05; xx, p < 0,01; XXX, p < 0,001; xxxx, p < 0,0001. (C) korrelasjon mellom ØKNINGEN av SUVMax i IPL MPM svulster og tid etter injeksjon. Lineær regresjon tegnes som en tykk farget linje og tilhørende SD som stiplede svarte linjer. Grafer og statistiske analyser ble utført med programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: korrelasjon mellom MPM utvikling overvåkes av lungevolum og metabolsk tumor aktivitet. Korrelasjon mellom SUVMax og lungevolum (VL) vises som en lineær regresjon plottet som en tykk farget linje og tilhørende SD som stiplede svarte linjer. Grafer og statistiske analyser ble utført med programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret beskriver en original orthotopic modell av MPM H2052/484 celler injisert i pleural hulrom av athymic mus og en metode for overvåking av små dyr PET/CT Imaging. Denne modellen kan implementeres med moderat dyr håndtering og kirurgi ferdigheter og viser en meget god utvikling rate. Det gjør at en stor eksperimentell vindu på ca 10 uker i ubehandlede mus og ikke-invasiv langsgående påvisning av svulster så tidlig som 2 uker etter injeksjon.
Orthotopic modeller stole på implantation av levende celler eller vev direkte inn i den opprinnelige miljøet av svulsten. Den største forskjellen mellom mye brukt subkutan eller intraperitoneal MPM modeller og intrapleural modeller ligger i deres mikromiljøet. Faktisk, mikromiljøet av svulster inneholder flere stromal celletyper (fibroblaster, leukocytter, makrofager) i tillegg til kreftceller25. Disse stromal celler skiller ut vekstfaktorer og cytokiner bidra til tumor mikromiljøet som modulere tumor vekst. Tumor mikromiljøet varierer med det anatomiske området som tyder på at en orthotopic xenograft vil utvikle og reagere forskjellig på en behandling enn en subkutan en25. Derfor, som orthotopic xenotransplantater er omgitt av en sammenlignbar mikromiljøet til den som finnes i MPM pasienter, bør deres atferd og respons på behandling bedre gjenspeile den kliniske situasjonen17,19.
Mange prekliniske modeller i kreftforskning implisere immunodeficient mus for å sikre menneskelig xenograft suksess. Nude mus ikke har modne thymus og mangler en viktig del av tumor mikromiljøet26. Selv om nakne mus ikke har modne thymus og er følgelig mangelfull i T-celler, presenterer de modne lymfocytter B, nøytrofile, monocytter og makrofager i sine pleural mikromiljøet i motsetning til mer ettergivende og svært mangelfull SCID mus26. I de tidlige stadiene av MPM-utbyggingen har regulatoriske T-celler en viktig undertrykkende rolle. Men i mer avanserte stadier, myelogen celler inkludert nøytrofile og makrofager erstatte treg celler; i denne funksjonen er den undertrykkende rollen av regulatoriske T-celler bare viktig i tidlige stadier av MPM utvikling23,27. Selv om studier som involverer en fullstendig immunrespons (f.eks. immunterapi som involverer et T-svar) ikke kan bli undersøkt i den modellen som presenteres her, postulatet vi at denne orthotopic modellen beholder all sin interesse for å vurdere nye behandlinger eller nye diagnostiske verktøy for MPM.
I en metodisk synspunkt, er det kritiske skritt å huske på å maksimere utviklingen av intrapleural MPM svulster. Før du etablerer mus modeller, har tilgang til eksponentielt voksende celler (mindre enn 80% confluency, avhengig av cellelinjer) og til 8 til 10 måneder acclimated mus. Faktisk er sprøytebruk yngre små mus vanskelig og kan føre til svangerskap utenfor livmoren og endre overlevelse. Under bruk av implantation prosedyren bør standard kirurgi forholdsregler tas, og stump saks bør brukes spesielt når incising for å unngå blødning, noe som kan føre til død av dyr. Valget av sprøyten (f. eks modellen som er beskrevet her) og protokollen som presenteres her tillater presis og skånsom injeksjon av et lite volum av medium som inneholder tumorceller for å sikre intrapleural injeksjon (30 ° vinkel, 2 – 3 mm dybde).
Langsgående overvåking av orthotopic MPM-modeller kan bare utføres ikke-invasivt av bildeteknikk. Pet/CT er den anbefalte metoden i klinisk praksis for å diagnostisere MPM og har følgelig blitt brukt i denne studien20,21. Idet sammenlignet med vidt anvendt optisk tenkelig, PET/CT tenkelig medfører bruken av radioaktive forbindelser og er derfor flere delikat å setup med hensyn til sikkerheten, logistikken av radiotracers og dens bekostning28. Ikke desto mindre, PET/CT tenkelig er ikke ha tillit til genetisk modifisering av svulst celler og skaffer høy-resolution klare, anatomisk og molekylær beskjed. Optisk tenkelig er likeledes hurtigere enn PET/CT bortsett fra det tenkelig system forevist i denne gjenstand medfører en 3-mus seng og om 20 mus kan avsøkte per dag, hvilke er en fornuftig produksjon betenke informasjonen avhentet. Bruken av den høyt tilgjengelige kliniske radiotracer [18F] FDG garanterer en høy translational kraft til forskning utført med denne teknikken29. Selv om [18F] FDG-pet skanning opplesninger og analyser kan kreve litt erfaring på grunn av den høye opptak i omkringliggende hjerte og brunt fettvev, sin kombinasjon med CT foredler diagnosen. Under [18f] FDG pet/CT eksperimenter, faste og oppvarming mus samt utføre en opptakstid på [18f] FDG av 1 h kan signifikant forbedre visualisering av svulster siden SKANNINGEN forhold svært innvirkning pet kontraster som allerede er beskrevet24. Videre studier på prekliniske orthotopic modeller som involverer andre klinisk brukte radiotracers som [18f] FLUOROTHYMIDINE (flt) eller [18f] Fluoromisonidazole (FMISO), som overvåker spredning og hypoksi henholdsvis, kan gi mer informasjon om slike pålitelige orthotopic MPM-modeller29.
Til slutt, denne relevant translational modell kombinert med ingen-invasjonen tenkelig er aldeles inne line med det 3R begrep: reduce antallet av dyrene, refine å minske smerte og ubehag og RErstatt dyr eksperimentering med alternativer22. Faktisk, innenfor samme sett av dyr, terapeutisk oppfølging og respons kan overvåkes ikke-invasivt slik at langsgående målinger gjennom eksperimenter, og dermed redusere antall dyr som kreves per eksperiment. Videre, som hvert dyr representerer sin egen kontroll over tid, ikke-invasiv Imaging også svært øke statistisk kraft redusere antall nødvendige dyr for å få pålitelige data16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Ligue Genevoise contre Le Cancer (til V.S.-B.) og ved Center for Biomedical Imaging (CIBM) av universiteter og sykehus i Genève og Lausanne (til D.J.C., O.B. og S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
- Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
- Mossman, B. T., Gee, J. B.
- Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
- Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
- LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
- Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
- Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
- Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
- Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
- Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
- Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A.
- Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
- Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
- Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
- Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
- de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
- Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
- Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
- Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
- Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
- Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
- Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).
