Summary
Dieser Artikel beschreibt die Erzeugung eines orthotopischen Mausmodells des menschlichen Pleuramesothelioms durch Implantation von H2052/484 Mesotheliomzellen in die Pleurahöhle immungeschwächter athymischer Mäuse. Die Längsüberwachung der Entwicklung intrapleuraler Tumoren wurde durch nicht-invasive multimodale [18F]-2-Fluor-2-Deoxy-D-Glucose-Positronen-Emissionstomographie und Computertomographie untersucht.
Abstract
Das maligne Pleuramesotheliom (MPM) ist ein seltener und aggressiver Tumor, der im Mesothel entsteht und die Lunge, das Herz und die Brusthöhle bedeckt. Die MPM-Entwicklung ist hauptsächlich mit Asbest verbunden. Behandlungen bieten nur ein bescheidenes Überleben, da der mittlere Überlebensdurchschnitt 9-18 Monate ab dem Zeitpunkt der Diagnose liegt. Daher müssen wirksamere Behandlungen identifiziert werden. Die meisten Daten, die neue therapeutische Ziele beschreiben, wurden aus In-vitro-Experimenten gewonnen und müssen in zuverlässigen in vivo präklinischen Modellen validiert werden. Dieser Artikel beschreibt ein solches zuverlässiges MPM-Orthotopmodell, das nach Injektion einer menschlichen MPM-Zelllinie H2052/484 in die Pleurahöhle immundefizien athymischer Mäuse gewonnen wurde. Die Transplantation an der orthotopischen Stelle ermöglicht die Untersuchung des Fortschreitens des Tumors in der natürlichen in vivo Umgebung. Positronen-Emissionstomographie/Computertomographie (PET/CT) molekulare Bildgebung mit dem klinischen [18F]-2-Fluor-2-Deoxy-D-Glucose ([18F]FDG) Radiotracer ist die Diagnosemethode der Wahl für die Untersuchung von Patienten mit MPM. Dementsprechend wurde [18F]FDG-PET/CT verwendet, um das Krankheitsverlauf des orthotopischen Modells H2052/484 längs zu überwachen. Diese Technik hat ein hohes 3R-Potenzial(Reduce die Anzahl der Tiere, Refine, um Schmerzen und Beschwerden zu verringern, und Replace Tierexperimente mit Alternativen), da die Tumorentwicklung nicht-invasiv überwacht werden kann und die Anzahl der benötigten Tiere deutlich reduziert werden könnte.
Dieses Modell zeigt eine hohe Entwicklungsrate, ein schnelles Tumorwachstum, ist kosteneffizient und ermöglicht eine schnelle klinische Übersetzung. Mithilfe dieses orthotopischen Xenograft-MPM-Modells können Forscher biologische Reaktionen eines zuverlässigen MPM-Modells nach therapeutischen Interventionen bewerten.
Introduction
Malignes Pleuramesotheliom (MPM) ist ein Krebs, der am häufigsten mit der Exposition gegenüber Asbestfasern1,2,3verbunden ist. Obwohl Asbest in den meisten westlichen Ländern verboten wurde4,5,6, die Inzidenz von MPM ist immer noch steigen7,8. Kürzlich deutet die Exposition von Mäusen gegenüber Kohlenstoff-Nanoröhren darauf hin, dass sie zu einem erheblichen Gesundheitsrisiko beim Menschen führen können9,10. Die Daten deuten darauf hin, dass die Exposition gegenüber diesen Produkten chronische Entzündungen und molekulare Veränderungen (z. B. Verlust von Tumor-Suppressor-Signalwegen) hervorrufen kann, die dem Fortschreiten zu bösartigem Mesotheliom zugrunde liegen. Derzeit sind Multiwall-Kohlenstoff-Nanoröhren eines der wichtigsten Produkte der Nanotechnologie und werden zunehmend in verschiedene Produkte wie Verbundwerkstoffe, Energiespeichermaterialien, Medizin, Elektronik und Umweltsanierungsmaterialien integriert.
MPM ist ein Krebs mit schlechter Prognose, und die meisten Patienten sterben innerhalb von zwei Jahren nach der Diagnose aufgrund einer begrenzten Wirksamkeit der aktuellen Behandlungsmodalitäten11. Die Wahl der Behandlung für MPM hängt vom Krebsstadium ab. Bei den meisten MPM im Frühstadium (Stadium 1 und möglicherweise einige Tumoren im Stadium 2 oder 3) ist der klinische Ansatz eine multimodale Therapie, einschließlich der chirurgischen Resektion der Tumoren, verbunden mit Strahlentherapie und Chemotherapie12. Eine kombinierte Chemotherapie mit Cisplatin und Pemetrexed ist indiziert für die Behandlung der meisten Patienten mit fortgeschrittener lokalinvasiver Erkrankung diagnostiziert, die nicht für eine chirurgische Resektion geeignet ist, oder die sonst nicht Kandidaten für kurative Chirurgie13,14sind. Daher ist es dringend erforderlich, wirksamere Behandlungen für MPM-Patienten zu entwickeln. Es gibt jedoch nur wenige validierte In-vivo-Tiermodelle, die die klinische Relevanz von MPM widerspiegeln. Mehrere murine MPM-Modelle wurden entwickelt, aber die meisten von ihnen rekapitulieren nicht getreu die komplexen Aspekte der MPM-Tumor-Mikroumgebung15,16,17,18. Die Verwendung von asbestinduziertem MPM bei Mäusen, gentechnisch veränderten MPM-Mausmodellen oder Modellen der syngenischen Transplantation muriner MPM-Zelllinien wird durch fundamentale phänotypische und funktionelle Unterschiede begrenzt und übersetzt daher neue Entdeckungen schlecht in die Klinik. Andere präklinische murine MPM-Modelle verlassen sich meist auf subkutane oder peritoneale Xenografts menschlicher Zelllinien bei immundefizienten Mäusen. Während diese Modelle leicht zu überwachen sind und grundlegende Daten liefern, ist die Mikroumgebung dieser Xenografts nicht vergleichbar mit menschlichen Tumoren, die die Translationskraft der meisten dieser präklinischen Studien beeinträchtigen17,19. Umgekehrt spiegeln orthotopische Xenografts das Tumorverhalten und die Reaktion des Patienten auf die Behandlung besser wider, da sie mit einer ähnlichen Mikroumgebung umgeben sind, wie sie in der ursprünglichen Tumorstelle gefunden wurde16.
Die molekulare Bildgebung von [18F]FDG-PET/CT ist die Methode der Wahl, um das Krankheitsverlauf bei Patienten mit MPM20,21längs zu überwachen. Daher fördert der Rückgriff auf diese nicht-invasive bildgebende Methode die Übersetzung präklinischer Studien in klinische Studien16,22erheblich. Darüber hinaus trägt es dazu bei, die erforderliche Anzahl von Tieren zu reduzieren, da jedes Tier seine eigene Kontrolle im Laufe der Zeit darstellt.
In diesem Artikel stellen wir ein zuverlässiges orthotopisches Xenograft-MPM-Modell vor, das nach Injektion der menschlichen MPM-Zelllinie H2052/484 in die Pleurahöhle athymischer Mäuse erhalten wurde. In Verbindung mit [18F]FDG-PET/CT-Bildgebung ist dieses Modell eine wertvolle und reproduzierbare Methode, um funktionelle und mechanistische Effekte neuer diagnostischer Strategien und Behandlungen für menschliches MPM zu untersuchen.
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Protocol
Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden vom institutionellen Tierpflege- und Gebrauchsausschuss und vom Veterinäramt Genf, Schweiz, genehmigt (Genehmigung GE/106/16). Die MPM-Zelllinie H2052/484 wurde in unserem Labor etabliert und charakterisiert, wie im Artikel von Colin DJ und et al.23beschrieben. Kurz gesagt, H2052/484 Zelllinie wurde aus einem Thoraxtumor nach einer intrapleuralen Injektion von NCI-H2052 (ATCC) Zellen in immundefizienten Nacktmäuse erhalten festgestellt.
1. Experimentelles Design
- Bestimmen Sie anhand der statistischen Leistungsberechnung (z.B. http://powerandsamplesize.com/Calculators/), wie viele Mäuse gemäß dem Experiment benötigt werden.
- Kaufen Sie mindestens eine Woche vor der Implantation acht bis zehn Wochen alte athymische weibliche Nacktmäuse Foxn1nu nu/nu und beherbergen Sie sie mindestens eine Woche lang in einer spezifisch pathogenfreien (SPF) Umgebung.
2. Vorbereitung von Zellen zur Implantation
- Berechnen Sie, wie viele H2052/484-Zellen benötigt werden, wenn jede Maus mit 1 x 106 Zellen injiziert wird (Schritt 1.1). Bereiten Sie eine zusätzliche Anzahl von Zellen als Injektion an Mäuse wird Spritzen Probenahme beinhalten.
- Kultur der MPM H2052/484 Zelllinie in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2.
- Kulturzellen für die Implantation bis zu ca. 80% Zusammenfluss (ca. 7 x 106 Zellen pro 15 cm Petrischale).
- Etwa 1 H vor der Transplantation, bereiten Sie die Zellen.
- Entsorgen Sie die Medien, waschen Sie Zellen mit sterilem PBS ohne Kalzium und Magnesium (10 ml pro 15 cm Petrischale) und lösen Sie Zellen durch Inkubation für 5 min mit 0,05% Trypsin-2 mM EDTA (2 ml pro 15 cm Petrischale).
- Sammeln Sie die Zellen in RPMI Medium (10 ml pro 15 cm Petrischale) und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Zellen für die Anzahl der Mäuse, die injiziert werden sollen, wenn sie gemäß Schritt 1.2 berechnet wird.
- Zentrifuge bei 300 x g für 3 min, waschen Sie das Zellpellet in 10 ml RPMI-Medium ohne FBS und Zentrifuge wieder bei 300 x g für 3 min.
- Setzen Sie die Zellen in einem entsprechenden Volumen von RPMI-Medium ohne FBS auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen pro 50 l aus, da jede Maus mit einem Volumen von 50 l injiziert werden muss.
3. Tumorzellimplantation
- Bereiten Sie vor der Implantation das Anästhesiesystem und den Operationsbereich in einer laminaren Strömungshaube vor, indem Sie alle Oberflächen mit einem Desinfektionsmittel besprühen. Bereiten Sie sterile oder desinfizierte Vorräte in der laminaren Durchflusshaube einschließlich des Anästhesiesystems, des Heizkissens zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur der Maus, die Polyvidon-Jodlösung, eine 30 G Hamilton Spritze (z. B. 705RN Spritze, 30 G Nadel-20 mm-Point Style 4), vor. sterile Gaze und Wattestäbchen, sterile Einwegskalpelle und Operationsinstrumente sowie sterile Mikropipetten und Spitzen.
- Bewahren und öffnen Sie die mikroisolierten SPF-Käfige in der desinfizierten Durchflusshaube und beastheisieren Sie eine Maus nach der anderen entsprechend der Pfropfgeschwindigkeit. Die Grafting-Dauer beträgt für experimentierte Techniker etwa 5–10 min.
- Anästhesisieren Sie Mäuse, indem Sie zuerst mit 4–5% Isofluran eukken. Dann unter Anästhesie auf dem Heizkissen während der Pfropfung mit 3% Isofluran aufbewahren. Bestimmen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust des Rechtenreflexes per Maus.
- Sobald eine Maus beästhetisiert ist, subkutan 0,05 mg/kg Buprenorphin als analgetische/postoperative Schmerzlinderung injizieren.
- Legen Sie die Maus auf der rechten Seite (rechte seitliche Dekubitus) auf dem Heizkissen.
- Reinigen Sie den Operationsbereich mit Polyvidon-Jodlösung und machen Sie einen 5 mm Schnitt der Haut und reinigen Sie umgebendes Fett und Muskeln mit einer stumpfen Schere, um die Rippen freizulegen.
- Homogenisieren Sie die Zellsuspension in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen pro 50 l RPMI-Medium ohne FBS und laden Sie 50 l der Suspension mit der Hamilton-Spritze. Vermeiden Sie Luftblasen und wischen Sie die Nadel mit 70% Alkohol ab, um nicht-orthotopische Transplantationen von Zellen zu vermeiden. Homogenisieren Sie die Zellsuspension vor jeder Injektion.
- Injizieren Sie die Zellen langsam in die Pleurahöhle zwischen den6. und7. Rippen mit einem Winkel von 30° und einer Tiefe von 2–3 mm direkt unter den interkostalen Muskeln. Achten Sie darauf, nicht in die Lunge zu injizieren, indem Sie die Nadel direkt unter den Rippen halten. Die Nadel sollte durch Transparenz durch die Muskeln sichtbar sein (Abbildung 1A).
- Schließen Sie die Wunde mit drei bis vier resorbierbaren Nähten.
- Bewahren Sie die Mäuse in einer erwärmten Umgebung auf, bis sie aufwachen.
- Am Tag danach, wiederholen Buprenorphin Injektion. Überwachen Sie Mäuse gemäß dem experimentellen Design und der Genehmigung.
4. [18F]FDG-PET/CT Bildgebung
HINWEIS: Alle nachstehend beschriebenen Verfahren müssen von örtlichen Tierhaltungs- und Bildgebungseinrichtungen genehmigt werden. Stellen Sie sicher, dass radioaktive Materialien nach lokalen Strahlenschutzvorschriften (z. B. Bestandslösungsaktivität, geschirmte Haubenhandhabung) importiert, gelagert und behandelt werden. SPF-Bedingungen können aufrechterhalten werden, indem Tiere in einer laminaren Durchflusshaube manipuliert und in SPF-kompatibles Scannerbett geladen werden (Abbildung 1B, C).
- Überwachen Sie die Tumorentwicklung, die eine PET/CT-Bildgebung durchführt, einmal pro Woche, beginnend am 7. Tag nach der Implantation der H2052/484-Zellen. Jedes Tier repräsentiert seine eigene Kontrolle im Laufe der Zeit.
- Vermeiden Sie die Not der Tiere vor der Bildgebung, indem Sie Mäuse in bildgebende Einrichtungen transportieren, wenn verfügbar, oder halten Sie sie in der Nähe der Anlage.
- Schnelle Mäuse für 12–16 h vor [18F]FDG-PET/CT, was Hintergrundsignale reduziert. Siehe Fueger24, der die Auswirkungen des Umgangs mit Tieren auf [18F]FDG-PET/CT-Scans beschrieben hat.
- Dekontaminieren und lagern Sie das Mäusebett nach lokalen Regeln.
- Zeichnen Sie alle Zeiten von Radioaktivitätsdosenmessungen, Injektionen und PET-Scans auf, um SUVs berechnen zu können.
- Vorwärmte Mäuse bei 30 °C für 30 min vor der Injektion von [18F]FDG, die den Braunfettgewebestoffwechsel (BAT) reduziert. Zum Beispiel vorwärmen in Heizkammern, durch die Verwendung von Heizkissen oder durch Infrarotlampen.
- Bereiten Sie 3–4 MBq-Dosen von [18F]FDG aus Derstammlösung in 150-200 l Kochstoff in 1 ml Insulinspritzen mit einem Dosiskalibrator vor. Insulinspritzen haben den Vorteil, dass sie fast kein totes Volumen haben und die Messung der verbleibenden Aktivität nach der Injektion vermeiden könnten.
- Anästhesisieren Sie Mäuse mit Isofluran, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Wiegen Sie Mäuse und injizieren Sie dann intravenös 3–4 MBq [18F]FDG. Retro-Orbital-Injektion ist eine Methode der Wahl, da es schnell, einfach ist und vermeidet Schwanz Veneninjektion Probleme oder verzögerte Aufnahme der intraperitonealen Injektion.
- Nach der Injektion lassen Sie Mäuse 45 min in ihren Käfigen unter den in Schritt 3.5 eingeleiteten warmen Bedingungen wach. Die Dauer der [18F]FDG-Aufnahme beträgt 1 h; 15 min sind in der Regel ausreichend, um Mäuse auf das Bett zu laden und CT vor PET durchzuführen.
- Anästhesisieren Sie Mäuse mit Isofluran, wie in Schritt 3.3 beschrieben, und laden Sie sie auf das Scannerbett (Abbildung 1B).
- Übertragen Sie das Bett auf den Scanner und unterwerfen Sie die Tiere einem CT-Scan, der auf der Lunge zentriert ist. Erfassen Sie Scans bei 80 kVp, 160 A, 1024 Projektionen während einer 360°-Drehung, mit einem Sichtfeld von 74 mm (1,6-fache Vergrößerung, Beispiel Triumph-Erfassung) (Abbildung 1C).
- Bewegen Sie das Bett in das PET-Subsystem und starten Sie die Erfassung 1 h nach [18F]FDG Injektion für eine Dauer von 15 min. Bei den meisten PET/CT-Systemen kann das Bett automatisch vom CT zum PET bewegt werden, um den FOV auf demselben Bereich zentriert zu halten.
- Entfernen Sie die Mäuse aus der Bildkammer und lassen Sie sie sich in ihrem Käfig erholen.
- Halten Sie Mäuse in einem Gebiet, das dem radioaktiven Zerfall nach lokalen Regeln gewidmet ist.
5. Analysen von [18F]FDG-PET/CT-Scans
- Rekonstruieren Sie CT-Scans, die unter den oben genannten Bedingungen mit einer Matrix von 512 und einer Voxelgröße von 0,144 mm durchgeführt wurden (Filtered Back Projection-FBP-Algorithmus, integrierte Software). Rekonstruieren Sie PET-Scans mit 20 Iterationen eines ordered subset Expectation Maximum-3 Dimension-OSEM3D-Algorithmus. Kalibrieren Sie die Bilder in Bq/mL, indem Sie einen Phantomzylinder scannen. Automatische Co-Registrierung der CT- und PET-Scans nach Ihrer integrierten Softwarelösung.
- Analysieren Sie Lungenvolumina mit der Analysesoftware (Tabelle der Materialien).
- Laden Sie CT-Daten als Referenz (Ref), indem Sie auf das Symbol "Daten öffnen" klicken. Laden Sie dann PET-Daten als Eingabe (Inp1), indem Sie auf das Symbol Daten anhängen klicken.
- Passen Sie die Farbskalen ("WL") von CT und PET an Kontrastbilder für die visuelle Inspektion an.
- Wählen Sie 3D ROI Tool aus dem Dropdown-Menü, klicken Sie auf ROI hinzufügen und nennen Sie die Datei Lungs. Klicken Sie auf Segmentierungsalgorithmen | Nachbarschaftsschwellenwerte. Definieren Sie Input als Hintergrund und Bild als Ref. Geben Sie Min und Max nach Denklungendichtewerten der Maus ein, typischerweise -800 und -300 HU. Überprüfen Sie die 3D-gerenderte Lunge, indem Sie auf das vtk-Symbol klicken, und rufen Sie das Volume in der Tabelle ab, das durch Klicken auf das Symbol Tabellensymbol anzeigengeneriert wird.
- Analysieren Sie [18F]FDG-Aufnahme bei Tumoren durch Extraktion maximaler Standardaufnahmewerte (SUVmax).
- Konvertieren Sie PET-Bilder, die in Bq/mL kalibriert sind, in SUV um, indem Sie Arithmetik aus dem Dropdown-Menü auswählen, dann Scalar Multiply und verwenden Sie inp1 als Ausgewählt und Scalar ist Bq/mL zu SUV-Faktor berechnet wie folgt: SUV = (Bq/mL)/(injizierte Dosis (Bq)/Körpergewicht(g)).
- Wählen Sie 3D ROI Tool aus dem Dropdown-Menü, klicken Sie auf ROI hinzufügen und nennen Sie die Datei Tumors. Klicken Sie auf 3D Paint-Modus | Kugel. Deaktivieren Sie nur 2D. Passen Sie die Größe der Form an und umgeben Sie die Tumore. Achten Sie darauf, keine störenden Signale aus dem Herzen zum Beispiel einzuschließen. Rufen Sie den SUVmax-Wert in der Tabelle ab, die durch Klicken auf das Symbol Tabellensymbol anzeigengeneriert wird.
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Representative Results
Das orthotopische Modell H2052/484
Orthotopische MPM-Modelle durch intrathorakale Injektion von kultivierten Krebszellen, insbesondere H2052/484-Zellen, sind relativ einfach einzurichten. Die oben beschriebenen Schritte erfordern nur bescheidene Zellkulturkenntnisse und die Operationsschritte sind für mäßig ausgebildete Tierexperimentatoren zugänglich. Nackte Mäuse und Zellen sollten unter sterilen Bedingungen manipuliert werden, um das Ergebnis der Implantationen zu maximieren. Durch die sorgfältige Befolgung dieses Protokolls, das eine kurze Anästhesie und minimale Operationen beinhaltet, stießen wir auf nur 1 Tod unter 266 Mäusen, die mit verschiedenen MPM-Zelllinien injiziert wurden. Bei diesen 266 Mäusen wurden keine pneumothorax- oder intrapulmonalen Implantationen von Tumorzellen beobachtet, wie beschrieben. Insbesondere ist die orthotopische Tumorentwicklungsrate der H2052/484-Zelllinie hoch, da 93,8 % der injizierten Mäuse Tumoren entwickelten (n = 118). H2052/484 Tumoren können durch PET/CT-Bildgebung ab 14 Tagen nach der Injektion nachgewiesen werden und die mediane Dauer des Experiments nach unseren Endpunktkriterien betrug 31 Tage in einem repräsentativen Experiment21. Wie wir in dieser anderen Studiebeschrieben 21, die Tumoren wurden in der Brusthöhle lokalisiert, frei verteilt oder an der Lunge befestigt, die Brustmuskeln, der Aortenbogen oder die untere Vena cava. Metastasen wurden nicht gefunden.
MPM-Überwachung durch [18F]FDG-PET/CT-Bildgebung
Orthotopisches MPM wurde wöchentlich durch kombinierte PET/CT-Bildgebung mit dem weit verbreiteten Radiotracer [18F]FDG überwacht, der sich in hochmetabolischen Tumoren ansammelt. Längsschnitt-anatomische CT-Scans ermöglichten die Visualisierung der Auswirkungen der MPM-Entwicklung auf die Morphologie der Lunge. Die automatische Segmentierung stark kontrastierter Lungen auf CT-Scans ist aufgrund ihrer geringen Dichte im Vergleich zu umgebenden Geweben einfach. 3D-Renderings geben einen Überblick über die Lokalisation von Tumoren und Längsvolumen der Lunge können extrahiert werden (Abbildung 2A). Lungenvolumenmessungen nach CT nahmen im Laufe der Zeit nach mPM-Injektion von Mäusen mit intrapleuralen (ipl) H2052/484 Tumoren signifikant ab (Abbildung 2B). Tatsächlich wachsen MPM-Tumoren in der Pleurahöhle und erzeugen Druck auf die Lunge, wodurch ihr Volumen reduziert wird. Korrelationsanalysen zeigten, dass das Lungenvolumen umgekehrt mit dem Zeitpunkt der Überwachung mit einem Bestimmungskoeffizienten R2 von 0,8 korreliert wurde (Abbildung 2C). Insgesamt zeigen diese Daten die Zuverlässigkeit des CT-Scans, um die Entwicklung dieses MPM-Modells zu überwachen.
In Kombination mit CT liefert ein [18F]FDG-PET-Scan zusätzliche und wertvolle Informationen über den Stoffwechselzustand von MPM-Tumoren. Während es manchmal kompliziert sein kann, CT- und PET-Scans von Bildern selbst zu interpretieren, insbesondere zu frühen Zeitpunkten, verleiht eine Kombination beider Modalitäten der Diagnose eine weitere Robustheit. Tatsächlich zeigt die repräsentative Längsschnittüberwachung [18F]FDG-PET/CT, die zwischen 10 Tagen und 44 Tagen einer Maus mit ipl H2052/484 Tumoren durchgeführt wurde, dass Tumore 2 Wochen nach der Transplantation zu unterscheiden beginnen (Abbildung 3A). Dieses Beispiel zeigt das Wachstum und [18F]FDG-Avidität von Tumoren, die sich an der Peripherie der Brusthöhle und entlang der Herz-Großen Gefäße (weiße Pfeile) befinden. [18F] Die FDG-Aufnahme bei Tumoren wurde quantifiziert, indem SUVmax in ROIs, die über Tumoren gezogen wurden, mit Hilfe von CT-Scans extrahiert wurde, und zeigt signifikante zeitabhängige Erhöhungen ihres Glukosestoffwechsels (Abbildung 3B). Korrelationsanalysen zeigten, dass SUVmax positiv mit dem Zeitpunkt der Überwachung mit einem Bestimmungskoeffizienten R2 von 0,7 korreliert waren (Abbildung 3C). Diese Daten zeigen die Zuverlässigkeit von [18F]FDG-PET-Scans zur Überwachung des Schicksals von orthotopischen H2052/484 Tumoren. Schließlich korrelieren die von CT bzw. PET analysierten Lungenvolumina bzw. [18F]FDG-Aviditäten mit einemR2 von 0,6, das die Stärke dieser Messungen unterstützt, um die Entwicklung orthotopischer MPM-Tumoren zu untersuchen (Abbildung 4).
Abbildung 1: Aktmaus orthotopisches Xenograft-Modell. (A) Intrapleurale (ipl) Injektion menschlicher MPM-Zellen in die linke Pleurahöhle, wie im Protokollabschnitt beschrieben. (B,C) Mäuse werden beästhebt und im PET/CT-Bett in eine laminare Durchflusshaube geladen und dann auf den Scanner übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Tumorwachstum des orthotopischen Modells H2052/484 MPM, das von CT überwacht wird. (A) Repräsentative 3D-Rekonstruktionen von CT-Scans, die H2052/484 MPM ipl Tumoren und ihre Wirkung auf das Lungenvolumen (Vp) zu verschiedenen Zeitpunkten in Tagen nach der Implantation zeigen. Weiße Pfeilspitzen zeigen die Position von MPM ipl Tumoren an. (B) Violine Plot zeigt einen repräsentativen Zeitverlauf der Lungenvolumen (VL), n = 6. Einweg-ANOVA-Test mit Denkkeys Mehrfachvergleichsstatistiken wird angezeigt. Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede zwischen Modellen mit a, b, c, d, e, f hin, die d10, D16, D23, D29, D36 und D44 angeben. Entsprechende p-Werte: x, p < 0,05; xx, p < 0,01; xxx, p < 0,001; xxxx, p < 0,0001. (C) Korrelation zwischen der Abnahme des Lungenvolumens im Zusammenhang mit der Ipl-MPM-Entwicklung und der Zeit nach der Injektion. Die lineare Regression wird als dick farbige Linie und zugehörige SD als gestrichelte schwarze Linien dargestellt. Graphen und statistische Analysen wurden mit Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Tumorstoffwechsel des ipl MPM-Modells gefolgt von [18F]FDG-microPET/CT. (A) Repräsentative PET/CT-Scans, die MPM-ipl-Tumoren zeigen. PET/CT-Bilder zeigen transaxiale Scheiben des Brustbereichs, die die [18F]FDG-avid Tumoren enthalten, wobei CT (graue Skala) anatomische Informationen liefert und PET (kalibrierte Pseudo-Farbskala) die Lage und Intensität einer hohen Tumor- und Organglukosenutzung zeigt. Nach der Injektion sind Tage angegeben. CT: CT-Mediastinalfenster; [18F] FDG-PET/CT: verschmolzenes Bild von PET- und CT-Scans. Weiße Pfeilspitzen zeigen MPM ipl Tumoren. L = Lunge, H = Herz, BAT = braunes Fettgewebe. (B) Geigendiagramm mit einem repräsentativen Zeitverlauf des SUVmax, der mit dem MPM-Stoffwechsel verbunden ist, n = 6. Einweg-ANOVA-Test mit Denkkeys Mehrfachvergleichsstatistiken wird angezeigt. Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede zwischen Modellen mit a, b, c, d, e, f hin, die d10, D16, D23, D29, D36 und D44 angeben. Entsprechende p-Werte: x, p < 0,05; xx, p < 0,01; xxx, p < 0,001; xxxx, p < 0,0001. (C) Korrelation zwischen der Erhöhung von SUVmax in ipl MPM Tumoren und Der Zeit nach der Injektion. Die lineare Regression wird als dick farbige Linie und zugehörige SD als gestrichelte schwarze Linien dargestellt. Graphen und statistische Analysen wurden mit Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Korrelation zwischen der MPM-Entwicklung, die durch das Lungenvolumen überwacht wird, und der metabolischen Tumoraktivität. Korrelation zwischen SUVmax und Lungenvolumen (VL) als lineare Regression dargestellt als eine dicke farbige Linie und verwandte SD als gestrichelte schwarze Linien. Graphen und statistische Analysen wurden mit Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Papier beschreibt ein originales orthotopisches Modell von MPM H2052/484 Zellen, die in die Pleurahöhle athymischer Mäuse injiziert wurden, und eine Methode zur Überwachung durch kleintierische PET/CT-Bildgebung. Dieses Modell kann mit moderaten Tierhandhabungs- und Operationsfähigkeiten implementiert werden und zeigt eine sehr gute Entwicklungsrate. Es ermöglicht ein großes experimentelles Fenster von etwa 10 Wochen bei unbehandelten Mäusen und nicht-invasive Längsnachweis von Tumoren bereits 2 Wochen nach der Injektion.
Orthotopische Modelle basieren auf der Implantation lebender Zellen oder Gewebe direkt in die ursprüngliche Umgebung des Tumors. Der Hauptunterschied zwischen weit verbreiteten subkutanen oder intraperitonealen MPM-Modellen und intrapleuralen Modellen liegt in ihrer Mikroumgebung. Tatsächlich enthält die Mikroumgebung von Tumoren neben Krebszellen25mehrere stromale Zelltypen (Fibroblasten, Leukozyten, Makrophagen). Diese Stromalzellen sezernieren Wachstumsfaktoren und Zytokine, die zur Tumormikroumgebung beitragen, die das Tumorwachstum modulieren. Die Tumormikroumgebung variiert mit der anatomischen Stelle, was darauf hindeutet, dass ein orthotopisches Xenograft sich entwickeln und anders auf eine Behandlung reagieren wird als eine subkutane25. Da orthotopische Xenografts mit einer vergleichbaren Mikroumgebung wie bei MPM-Patienten umgeben sind, sollten ihr Verhalten und ihr Ansprechen auf die Behandlung die klinische Situation besser widerspiegeln17,19.
Viele präklinische Modelle in der Krebsforschung implizieren immundefizienten Mäusen, um den Erfolg des menschlichen Xenograftzungzuführens zu gewährleisten. Nackte Mäuse besitzen keinen reifen Thymus und es fehlt ein lebenswichtiger Teil der Tumormikroumgebung26. Obwohl nackte Mäuse keinen reifen Thymus besitzen und folglich einen Mangel an T-Zellen haben, präsentieren sie reife Lymphozyten B, Neutrophile, Monozyten und Makrophagen in ihre pleurale Mikroumgebung im Gegensatz zu freizügigeren und stark defizitären SCID-Mäusen26. In den frühen Stadien der MPM-Entwicklung spielen regulatorische T-Zellen eine wichtige unterdrückende Rolle. Jedoch, in fortgeschritteneren Stadien, myeloische Zellen einschließlich Neutrophile und Makrophagen ersetzen Treg-Zellen; in dieser Funktion ist die unterdrückende Rolle regulatorischer T-Zellen nur in frühen Stadien der MPM-Entwicklung23,27wichtig. Obwohl Studien mit einer vollständigen Immunantwort (z. B. Immuntherapien mit einer T-Antwort) in dem hier vorgestellten Modell nicht untersucht werden können, postulieren wir, dass dieses orthotopische Modell sein gesamtes Interesse an der Bewertung neuer Behandlungen oder neuer Diagnoseinstrumente von MPM behält.
Aus methodischer Sicht gibt es kritische Schritte zu beachten, um die Entwicklung von intrapleuralen MPM-Tumoren zu maximieren. Vor der Etablierung von Mäusemodellen haben Sie Zugang zu exponentiell wachsenden Zellen (weniger als 80% Konfluenz, abhängig von Zelllinien) und zu 8 bis 10 Monaten akklimatisierenden Mäusen. Tatsächlich ist die Injektion jüngerer kleiner Mäuse schwierig und kann zu ektopischen Injektionen führen und das Überleben verändern. Während des Implantationsvorgangs sollten Standard-Chirurgie-Vorkehrungen getroffen werden, und stumpfe Schere sollte vor allem beim Einschneiden verwendet werden, um Blutungen zu vermeiden, die zum Tod von Tieren führen können. Die Wahl der Spritze (z. B. das hier beschriebene Modell) und das hier vorgestellte Protokoll ermöglichen eine präzise und schonende Injektion eines kleinen Volumens mittelhaltiger Tumorzellen, um eine intrapleurale Injektion (30° Winkel, 2–3 mm Tiefe) zu gewährleisten.
Die Längsüberwachung orthotopter MPM-Modelle kann nur nicht-invasiv durch bildgebende Technik durchgeführt werden. PET/CT ist die empfohlene Methode in der klinischen Praxis zur Diagnose von MPM und wurde daher in dieser Studie20,21verwendet. Im Vergleich zur weit verbreiteten optischen Bildgebung beinhaltet die PET/CT-Bildgebung die Verwendung radioaktiver Verbindungen und ist daher aufgrund der Sicherheit, der Logistik von Radiotracern und derkosten28empfindlicher einzurichten. Dennoch stützt sich die PET/CT-Bildgebung nicht auf die genetische Veränderung von Tumorzellen und liefert hochauflösende tomographische, anatomische und molekulare Informationen. Optische Bildgebung ist auch schneller als PET/ CT, aber das in diesem Artikel vorgestellte Bildgebungssystem beinhaltet ein Bett mit 3 Mäusen und etwa 20 Mäuse können pro Tag gescannt werden, was unter Berücksichtigung der gesammelten Informationen einen angemessenen Durchsatz darstellt. Die Verwendung des hochverfügbaren klinischen Radiotracers [18F]FDG rechtfertigt eine hohe Translationskraft für die Forschung, die mit dieser Technik durchgeführt wurde29. Obwohl [18F]FDG-PET-Scan-Messungen und -Analysen aufgrund der hohen Aufnahme in umgebenden Herz- und braunen Fettgeweben einige Erfahrung erfordern könnten, verfeinert seine Kombination mit CT die Diagnose. Während [18F]FDG PET/CT-Experimenten können Fasten- und Erwärmungsmäuse sowie die Durchführung einer Aufnahmezeit von [18F]FDG von 1 h die Visualisierung von Tumoren deutlich verbessern, da Scanbedingungen PET-Kontraste stark beeinflussen, wie bereits beschrieben24. Weitere Studien an präklinischen orthotopischen Modellen mit anderen klinisch verwendeten Radiotracern wie [18F]Fluorothymidin (FLT) oder [18F]Fluoromisonidazol (FMISO), die Proliferation bzw. Hypoxie überwacht, könnten mehr Informationen über solche zuverlässigen orthotopischen MPM-Modelle29liefern.
Schließlich entspricht dieses relevante Translationsmodell in Kombination mit nicht-invasiver Bildgebung perfekt dem 3R-Konzept: Die Anzahl der Tiere, Refine zur Linderung von Schmerzen und Beschwerden und Replace Tierexperimente mit Alternativen22. Tatsächlich können innerhalb derselben Gruppe von Tieren die therapeutische Nachbeobachtung und Reaktion nicht-invasiv überwacht werden, was Längsmessungen während der Experimente ermöglicht, wodurch die Anzahl der pro Versuch benötigten Tiere reduziert wird. Da jedes Tier seine eigene Kontrolle im Laufe der Zeit darstellt, erhöht die nichtinvasive Bildgebung auch die statistische Leistung, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere reduziert wird, um zuverlässige Daten zu erhalten16.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Ligue Genevoise contre le Cancer (zu V.S.-B.) und vom Center for Biomedical Imaging (CIBM) der Universitäten und Krankenhäuser von Genf und Lausanne (nach D.J.C., O.B. und S.G.) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
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