Summary
本稿では、免疫不全歯立マウスの胸膜腔にH2052/484中皮腫細胞を移植することにより、ヒト胸膜中皮腫の直交マウスモデルの生成について説明する。胸腔内腫瘍の発症の縦方向モニタリングを非侵襲的マルチモーダル[18F]-2-フルオロ-2-デオキシ-D-グルコース陽電子放射断層撮影およびコンピュータ断層撮影法によって評価した。
Abstract
悪性胸膜中皮腫(MPM)は、肺、心臓、胸腔を覆う中皮に生じる稀で攻撃的な腫瘍である。MPMの開発は主にアスベストに関連しています。治療は、中央値の生存平均が診断時から9〜18ヶ月であるので、わずかな生存期間のみを提供する。したがって、より効果的な治療法を特定する必要があります。新しい治療標的を記述するほとんどのデータは、インビトロ実験から得られ、生体内前臨床モデルで信頼性の高い検証を行う必要があります。本稿では、ヒトMPM細胞株H2052/484を免疫不全アチミックマウスの胸膜腔に注入した後に得られた、そのような信頼性の高いMPMオルソトピックモデルの1つについて説明する。オルソトピック部位での移植は、自然な生体内環境での腫瘍の進行を研究することを可能にする。陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)臨床[18F]-2-フルオロ-2-デオキシ-D-グルコース([18F]FDG)ラジオトレーサを用いた分子イメージングは、MPMを有する患者を検査するための診断方法である。従って、[18F]FDG-PET/CTは、H2052/484オルソトピックモデルの疾患進行を縦方向にモニタリングするために使用された。この技術は、腫瘍の発達を非侵襲的に監視することができ、必要な動物の数を有意に減少させることができるので、高い3R電位(Rは動物の数を誘発し、痛みや不快感を軽減するRefine、および代替を伴うReplace動物実験)を有する。
このモデルは高い発達率を示し、急速な腫瘍の成長は費用効率がよく、急速な臨床翻訳を可能にする。このオルソトピック異種移植片MPMモデルを使用することにより、研究者は治療介入に続く信頼性の高いMPMモデルの生物学的応答を評価することができる。
Introduction
悪性胸膜中皮腫(MPM)は、アスベスト繊維1、2、3への曝露に最も頻繁に関連する癌である。ほとんどの西洋諸国4、5、6でアスベストが禁止されているが、MPMの発生率は依然として7、8増加している。近年、カーボンナノチューブへのマウスの暴露は、ヒト9、10において重大な健康リスクをもたらす可能性があることを示唆している。このデータは、これらの製品への曝露が、悪性中皮腫への進行の基礎である慢性炎症および分子変化(例えば、腫瘍抑制経路の喪失)を誘発する可能性があることを示唆している。現在、マルチウォールカーボンナノチューブはナノテクノロジーの最も重要な製品の一つであり、複合材料、エネルギー貯蔵材料、医薬品、エレクトロニクス、環境修復材料など様々な製品にますます取り入れされています。
MPMは予後不良の癌であり、ほとんどの患者は現在の治療モダリティ11の有効性が限られているため診断後2年以内に死亡する。MPMの治療の選択は癌の段階に依存する。ほとんどの初期段階のMPM(ステージ1およびおそらくいくつかのステージ2または3の腫瘍)において、臨床アプローチは、放射線療法および化学療法12に関連する腫瘍の外科的切除を含むマルチモーダル療法である。シスプラチンおよびペメトレキセドとの併用化学療法は、進行した局所侵襲性疾患と診断されたほとんどの患者の治療のために示される、それは外科的切除に適さない、または治療手術の候補ではない13、14である。したがって、MPM患者に対してより効果的な治療法を開発することが急務である。しかし、MPMの臨床関連性を反映する生体内動物モデルで検証されたものはほとんどありません。いくつかのマウスMPMモデルが開発されているが、それらのほとんどは、MPM腫瘍微小環境15、16、17、18の複雑な側面を忠実に再現していない。マウスにおけるアスベスト誘発MPMの使用、遺伝子操作されたMPMマウスモデル、またはマウスMPM細胞株の同系移植モデルは、基本的な表現型および機能的な違いによって制限され、その結果、新しい発見をクリニックに翻訳することが不十分である。他の前臨床マウスMPMモデルは、主に免疫不全マウスにおけるヒト細胞株の皮下または腹膜異種移植片に依存する。これらのモデルは、基本的なデータを監視し、提供することが容易であるが、これらの異種移植片の微小環境は、これらの前臨床試験の大部分の翻訳力を損なうヒト腫瘍に匹敵するものではない17、19。逆に、オルソトピック異種移植片は、元の腫瘍部位16に見られるものと同様の微小環境に囲まれている患者腫瘍行動および治療への応答をよりよく反映する。
[18F]FDG-PET/CTによる分子イメージングは、MPM20、21を有する患者における疾患の進行を縦方向に監視する選択方法である。したがって、この非侵襲的イメージング法に頼る上で、臨床試験16、22への前臨床試験の翻訳を大いに促進する。さらに、各動物は時間の経過に応じて独自の制御を表すので、必要な動物の数を減らすのに役立ちます。
本稿では、ヒトMPM細胞株H2052/484をアチミックマウスの胸膜腔に注入した後に得られた信頼性の高いオルソトピック異種移植片MPMモデルを提示する。[18F]FDG-PET/CTイメージングと組み合わせることで、このモデルは、ヒトMPMの新しい診断戦略および治療の機能的および機械的効果を研究するための貴重で再現可能な方法である。
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Protocol
以下に記載されているすべての手順は、制度的な動物のケアと使用委員会とスイスのジュネーブの獣医国家事務所によって承認されました(認可GE/106/16)。MPM細胞株H2052/484が確立され、コリンDJおよびら23の記事に詳述されているように当研究室で特徴づけられた。簡単に説明すると、H2052/484細胞株は、NCI-H2052(ATCC)細胞を免疫不全ヌードマウスに静脈内注射した後に得られた胸部腫瘍から確立した。
1. 実験計画
- 統計的な電力計算 (http://powerandsamplesize.com/Calculators/ など) を使用して、実験に従って必要なマウスの数を決定します。
- 移植の少なくとも1週間前に、8~10週齢の無病女性ヌードマウスFoxn1nu nu/nuを購入し、少なくとも1週間は特定の病原体フリー(SPF)環境に収納してください。
2. 移植のための細胞の調製
- 各マウスに 1 x 106個のセルを注入する場合に必要な H2052/484 セルの数を計算します (手順 1.1)。マウスへの注射は注射器サンプリングを伴うように余分な数の細胞を準備する。
- 10%(v/v)胎児ウシ血清(FBS)、100単位/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地中のMPM H2052/484細胞株を、5%CO2で37°Cの組織培養インキュベーターで培養する。
- 約80%の合流(15cmペトリ皿当たり約7x106細胞)への移植のための培養細胞。
- 移植前に約1時間、細胞を調製する。
- 媒体を廃棄し、カルシウムとマグネシウムを含まない滅菌PBSで細胞を洗浄し(15cmペトリ皿あたり10mL)、0.05%トリプシン-2 mM EDTA(15cmペトリ皿あたり2mL)で5分間インキュベートして細胞を剥離します。
- RPMI培地(15cmペトリ皿あたり10mL)で細胞を収集し、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。
- ステップ1.2に従って算出した方法を考慮して注入するマウスの数に対して適切な細胞数を収集する。
- 300 x gで3分間遠心分離し、FBSなしでRPMI培地の10 mLで細胞ペレットを洗浄し、300 x gで3分間再び遠心分離機を行う。
- 各マウスに50μLの体積を注入する必要があるので、FBSを使用せずに適切な量のRPMI培地の細胞を50μLあたり1 x 106セルの濃度に再スレドします。
3. 腫瘍細胞移植
- 着床の前に、消毒剤ですべての表面を噴霧することにより、層流フード内の麻酔システムと手術領域を準備します。麻酔システムを含む層流フード内の無菌または消毒された供給を調製し、マウスの体温を維持する加熱パッド、ポリビドノンヨウ素溶液、30Gハミルトンシリンジ(例えば、705RNシリンジ、30 G針20mm-ポイントスタイル4)、無菌ガーゼと綿棒、無菌使い捨てメスと手術器具、無菌マイクロピペットとチップ。
- 閉じ込められたフローフード内のマイクロ絶縁SPFケージを保持し、移植速度に応じてマウスを次々に麻酔します。移植期間は、実験技術者の場合、約5〜10分です。
- マウスを麻酔する最初に4~5%のイソフルランを誘導する。その後、3%のイソフルランで移植しながら、加熱パッド上の麻酔下で維持します。マウスによる右反射の喪失によって麻酔の深さを決定する。
- マウスが麻酔されたら、鎮痛薬/術後の痛み止めとして皮下0.05mg/kgブプレノルフィンを注入する。
- マウスを右側(右横デキュビタス)のヒーティングパッドに置きます。
- ポリビドネヨウ素溶液で手術領域をきれいにし、皮膚の5ミリメートルの切開を行い、肋骨を露出させるために鈍いはさみで周囲の脂肪と筋肉をクリアします。
- FBSを含まないRPMI培地の50μLあたり1 x 106細胞の濃度で細胞懸濁液を均質化し、ハミルトンシリンジで懸濁液の50μLをロードする。気泡を避け、細胞の非オルソトピック移植を避けるために70%アルコールで針を拭きます。各注射の前に細胞懸濁液を均質化する。
- 30°の角度と肋間筋肉のすぐ下に2〜3ミリメートルの深さで6番目と7番目の肋骨の間の胸膜腔にゆっくりと細胞を注入します。肋骨のすぐ下に針を置いて肺に注射しないようにしてください。針は筋肉を通して透明で見える必要があります(図1A)。
- 3~4本の吸収性縫合糸で傷口を閉じます。
- マウスが目を覚ますまで、温かい環境で保管します。
- 翌日、ブプレノルフィン注射を繰り返す。実験計画と承認に従ってマウスを監視します。
4. [18F]FDG-PET/CTイメージング
注:以下に説明するすべての手順は、地元の動物住宅およびイメージング施設によって承認されなければなりません。放射性物質が輸入、保存、および地域の放射線安全規則(例えば、ストックソリューション活動、シールドフード処理)に従って処理されていることを確認してください。SPF条件は、動物を層流フードで操作し、SPF互換スキャナーベッドにロードすることで維持できます(図1B、C)。
- H2052/484細胞の移植後7日目から、PET/CTイメージングを行う腫瘍発生を週1回監視する。各動物は、時間の経過に関する独自の制御を表します。
- 利用可能な場合は、マウスをイメージング施設ハウジングに輸送するか、施設の近くに保管して、イメージング前に動物の苦痛を避けてください。
- バックグラウンド信号を低減する[18 F]FDG-PET/CTの前に12-16時間の高速マウス。動物の取り扱いが[18F]FDG-PET/CT スキャンに与える影響を説明した Fueger24を参照してください。
- 現地の規則に従ってマウスベッドを除染し、保管する。
- RVを計算できるように、放射能線量測定、注射、PETスキャンのすべての時間を記録します。
- 褐色脂肪組織(BAT)代謝を低下させる[18F]FDGの注射前に30分間30°Cで事前に温かいマウス。例えば、加熱室で、加熱パッドを使用するか、または赤外線ランプを使用して、事前に暖かい。
- 用量キャリブレータを用いて1mLインスリン注射器中の生理液中の150〜200μLの原液から[18F]FDGの3〜4 MBq用量を調製する。インスリン注射器は、ほとんど死んだ容積を有するという利点があり、注射後の残りの活性の測定を避けることができた。
- ステップ3.3に記載のアイソフルランでマウスを麻酔する。マウスの重量を量り、静脈内に注射する 3–4 MBq [18F]FDG.レトロ軌道注入は、迅速かつ容易であり、腹腔内注射の問題や遅延取り込みを回避するので、選択の方法です。
- 注射後、マウスはステップ3.5で開始された暖かい条件の下でケージ内で45分間目を覚まし続ける。[18F]FDG 取り込みの持続時間は 1 時間です。通常、15分は、ベッドにマウスをロードし、PETの前にCTを行うために十分です。
- ステップ3.3で説明したように、イソフルランでマウスを麻酔し、スキャナーベッドにロードする(図1B)。
- ベッドをスキャナーに移し、動物を肺を中心としたCTスキャンに移します。74 mm (1.6倍の倍率、トライアンフ取得の例) の視野を使用して、360° 回転中に 80 kVp、160 μA、1024 突起でスキャンを取得します (図 1C)。
- ベッドをPETサブシステムに移動し、[18F]FDG注入後1時間15分間取得を開始します。PET/CTシステムのほとんどで、ベッドをCTからPETに自動的に移動して、FOVを同じ領域の中心に保つことができます。
- イメージングチャンバーからマウスを取り出し、ケージ内で回復できるようにします。
- マウスは、現地の規則に従って放射性崩壊専用の領域に保管してください。
5.[18F]FDG-PET/CTスキャンの解析
- 512のマトリックスと0.144 mmのボクセルサイズ(フィルタリングバックプロジェクション-FBPアルゴリズム、組み込みソフトウェア)で上記の条件で実行されたCTスキャンを再構築します。順序付けられたサブセット期待最大 3 Dimension-OSEM3D アルゴリズムの 20 回の反復を使用して PET スキャンを再構築します。ファントムシリンダーをスキャンして、Bq/mLの画像をキャリブレーションします。組み込みのソフトウェア ソリューションに従って、CT スキャンと PET スキャンを自動的に共同登録します。
- 分析ソフトウェアを使用して肺の体積を分析する (材料の表). )
- [データを開く]アイコンをクリックして、CT データを参照として読み込みます (Ref)。次に、[データの追加] アイコンをクリックして、PET データを入力 (Inp1) として読み込みます。
- CT と PET のカラー スケール(「WL」)を調整して、画像をコントラストして目視検査します。
- ドロップダウンメニューから[3D ROIツール]を選択し、[ROIの追加]をクリックして、ファイルに「肺」という名前を付けます。セグメンテーションアルゴリズムをクリック |近傍しきい値:[入力]を[背景] として定義し、[イメージ] を[参照]として定義します。マウスの肺密度の値 (通常は -800 および -300 HU) に従ってMinとMaxを入力します。vtkアイコンをクリックして 3D レンダリングされた肺を検査し、[テーブル アイコンの表示] をクリックして生成されたテーブル内のボリュームを取得します。
- 最大標準取り込み値(SUVmax)を抽出することにより、[18F]FDGの腫瘍の取り込みを分析します。
- ドロップダウンメニューから「算術演算」を選択してBq/mLでキャリブレーションされたPET画像をSUVに変換し、スカラー乗算とinp1を選択済みとして使用し、スカラーはBq/mLから次のように計算されたSUV係数に変換します: SUV = (Bq/mL)/(注入線量(Bq)/体重(g))。
- ドロップダウンメニューから[3D ROIツール]を選択し、[ROIの追加]をクリックして、ファイルに腫瘍という名前を付けます。3D ペイント モードをクリックする |球.[2D のみ] のチェックを外します。形状のサイズを調整し、腫瘍を囲む。たとえば、心臓からの干渉信号を含めないようにしてください。[テーブル アイコンの表示] をクリックして生成されたテーブルの SUVmax 値を取得します。
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Representative Results
H2052/484 オルソトピックモデル
培養癌細胞の胸腔内注射によるオルソトピックMPMモデル、特にH2052/484細胞は比較的セットアップが容易である。上記の異なるステップは、適度な細胞培養知識を必要とし、手術ステップは適度に訓練された動物実験者にアクセス可能です。ヌードマウスおよび細胞は、移植の結果を最大化するために無菌条件下で操作されるべきである。短い麻酔と最小限の手術を伴うこのプロトコルに注意深く従うことで、異なるMPM細胞株を注射した266匹のマウスのうち1匹の死亡に遭遇しました。腫瘍細胞の気胸または肺中移植は、記載されているように慎重に注射されたこれらの266匹のマウスの間で観察されなかった。具体的には、H2052/484細胞株のオルソトピック腫瘍発生率は、注射されたマウスの93.8%が腫瘍を発症してから高い(n=118)。H2052/484腫瘍は、注射後14日からPET/CTイメージングにより検出することができ、かつ我々のエンドポイント基準に従った実験の中央値持続時間は、代表実験21で31日であった。この他の研究21で説明したように、腫瘍は胸腔内に局在し、肺、胸筋、大動脈弓または下大静脈に自由に分布または付着した。転移が見つかりませんでした。
[18F]FDG-PET/CTイメージングによるMPMモニタリング
オルソトピックMPMは、広く使用されている放射線トレーサー[18F]FDGとのPET/CTイメージングを組み合わせて毎週モニタリングした。縦断解剖CTスキャンは、MPM開発が肺の形態に及ぼす影響を可視化することを可能にした。CTスキャンでの高度に対照的な肺の自動セグメンテーションは、周囲の組織と比較して密度が低いため簡単です。3D レンダリングは、腫瘍の局在化の概要を示し、肺の縦方向の体積を抽出することができます (図 2A)。CTによる肺容積測定は、胸腔内(ipl)H2052/484腫瘍を有するマウスのMPM注射後に時間の経過とともに有意に減少した(図2B)。実際、MPM腫瘍は胸膜腔内で増殖し、肺に圧力を与え、体積を減少させる。相関分析は、肺容積が0.8の決定係数R2を有するモニタリング時と逆相関していることを実証した(図2C)。全体として、これらのデータは、このMPMモデルの開発を監視するためのCTスキャンの信頼性を示しています。
CTと組み合わせることで、[18F]FDG-PETスキャンはMPM腫瘍の代謝状態に関する追加かつ貴重な情報を提供する。CT スキャンと PET スキャン画像を自分で解釈するのは複雑な場合がありますが、特に初期の時点では、両方のモダリティを組み合わせることで診断にさらに堅牢性が得られます。実際、代表的な縦方向[18F]FDG-PET/CT モニタリングは、ipl H2052/484腫瘍を有するマウスの10日から44日の間に行われ、移植後2週間で腫瘍が区別し始めていることを示している(図3A)。この例では、胸腔の周囲および心臓の大血管(白い矢印)に沿って位置する腫瘍の成長と[18F]FDGの熱心さを強調する。[18F]腫瘍におけるFDG取り込みは、CTスキャンの助けを借りて腫瘍上に描かれたROI中のSUVmaxを抽出することによって定量化し、かつグルコース代謝の有意な時間依存性の増加を示す(図3B)。相関分析は、SUVmaxが0.7の決定係数R2を有するモニタリング時と正に相関していることを実証した(図3C)。これらのデータは、H2052/484オルソトピック腫瘍の運命を監視するための[18F]FDG-PETスキャンの信頼性を示しています。最後に、肺容積および[18F]FDGアビディティは、それぞれ、CTおよびPETによって分析され、MPM直交トピック腫瘍の発症を研究するためにこれらの測定の強度を支持する0.6のR2と相関する(図4)。
図1:ヌードマウスのオルソトピック異種移植片モデル(A)プロトコルセクションで説明されているように、ヒトMPM細胞の左胸膜腔への胸腔内(ipl)注射。(B,C)マウスは麻酔され、層流フードでPET/CTベッドにロードされ、スキャナーに移されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CTによって監視されたオルソトピックH2052/484 MPMモデルの腫瘍増殖。(A)H2052/484 MPM ipl腫瘍の代表的な3D再構成と、移植後数日の様々な時間における肺容積(Vp)への影響を示す。白い矢印はMPM ipl腫瘍の位置を示す。(B)肺容積の代表的な経時経過を示すヴァイオリンプロット(VL)、n=6。Tukeyの多重比較統計を用した一方向ANOVA検定が示されています。文字は、それぞれ D10、D16、D23、D29、D36、および D44 を示す a、 b、 c、 d、 e、f、f を持つモデル間の有意な差を示します。対応する p 値: x, p < 0.05;xx, p < 0.01;xxx, p < 0.001;xxxx, p < 0.0001.(C) ipl MPMの発達に関連する肺容積の減少と注射後の時間との相関線形回帰は、太い色の線としてプロットされ、関連する SD は黒い破線としてプロットされます。グラフと統計解析は、ソフトウェアを用いて行いました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ipl MPMモデルの腫瘍代謝に続いて[18F]FDG-microPET/CT(A)MPM ipl腫瘍を示す代表的なPET/CTスキャン。PET/CT画像は、[18F]FDG-avid腫瘍を含む胸部領域の軸方向スライスを示し、CT(グレースケール)は解剖学的情報を提供し、PET(較正擬色スケール)は高い腫瘍および器官グルコース使用率の位置および強度を示す。注射後の日数が示されます。CT: CT 中間ウィンドウ;[18F]FDG-PET/CT: PET スキャンと CT スキャンの融合画像。白い矢印はMPM ipl腫瘍を示す。L =肺、H=心臓、BAT=褐色脂肪組織。(B)MPM代謝に連結されたSUVマックスの代表的な時間経過を示すヴァイオリンプロット、n=6。Tukeyの多重比較統計を用した一方向ANOVA検定が示されています。文字は、それぞれ D10、D16、D23、D29、D36、および D44 を示す a、 b、 c、 d、 e、f、f を持つモデル間の有意な差を示します。対応する p 値: x, p < 0.05;xx, p < 0.01;xxx, p < 0.001;xxxx, p < 0.0001.(C) ipl MPM腫瘍におけるSUVマックスの増加と注射後の時間との相関線形回帰は、太い色の線としてプロットされ、関連する SD は黒い破線としてプロットされます。グラフと統計解析は、ソフトウェアを用いて行いました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:肺容積および代謝腫瘍活性によって監視されるMPM現像との相関。太い色の線としてプロットされた線形回帰として表示されるSUVの最大体積(VL)と、関連するSDを破線の黒線として表示する。グラフと統計解析は、ソフトウェアを用いて行いました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本論文では、アチミックマウスの胸膜腔に注入されたMPM H2052/484細胞のオリジナルオルソトピックモデルと、小型動物PET/CTイメージングによるモニタリング方法について述べている。このモデルは適度な動物の扱いおよび外科の技術と実施することができ、非常によい発達率を表示する。これは、未治療のマウスで約10週間の大きな実験ウィンドウと注射後2週間で腫瘍の非侵襲的な縦方向検出を可能にします。
オルソトピックモデルは、腫瘍の初期環境に直接生きている細胞または組織の移植に依存する。広く使用されている皮下または腹腔内MPMモデルと胸腔内モデルの主な違いは、その微小環境にあります。実際、腫瘍の微小環境には、癌細胞25に加えて複数の間質細胞型(線維芽細胞、白血球、マクロファージ)が含まれる。これらの間質細胞は、腫瘍増殖を調節する腫瘍微小環境に寄与する増殖因子およびサイトカインを分泌する。腫瘍微小環境は、正接異種移植片が皮下125とは異なる治療に対して異なる反応を起げることを示唆する解剖学的部位によって異なる。したがって、オルソトピック異種移植片はMPM患者に見られるものと同等の微小環境で囲まれているため、その行動および治療への応答は臨床状況17、19をよりよく反映すべきである。
癌研究における多くの前臨床モデルは、ヒト異種移植片の成功を確実にするために免疫不全マウスを意味する。ヌードマウスは成熟胸腺を有せず、腫瘍微小環境の重要な部分を欠いている26.ヌードマウスは成熟胸腺を有せず、その結果、T細胞に欠乏しているが、それらは成熟リンパ球B、好中球、単球およびマクロファージを、より寛容で非常に欠損性の高いSCIDマウス26とは対照的に、彼らの胸膜微小環境に提示する。MPM開発の初期段階では、制御性T細胞は重要な抑制的役割を有する。しかし、より高度な段階では、好中球やマクロファージを含む骨髄細胞がTreg細胞に取って代わる。この機能において、制御T細胞の抑制的役割は、MPM開発23、27の初期段階でのみ重要である。したがって、完全な免疫応答を含む研究(例えば、T応答を含む免疫療法)は、ここで提示されるモデルでは研究できないが、我々は、このオルソトピックモデルがMPMの新しい治療法または新しい診断ツールを評価するためにすべての関心を維持することを仮定する。
方法論的観点では、胸腔内MPM腫瘍の発達を最大化するために留意する重要なステップがあります。マウスモデルを確立する前に、指数関数的に増殖する細胞(細胞株に応じて80%未満の結合力)にアクセスし、8〜10ヶ月間順応したマウスにアクセスできます。実際、若い小さなマウスを注射することは困難であり、外所注射を引き起こし、生存を変化させる可能性があります。移植手順では、標準的な手術の予防措置を取る必要があり、特に動物の死につながる可能性のある出血を避けるために切開する場合は、鈍いはさみを使用する必要があります。注射器の選択(例えば、ここで説明するモデル)およびここで提示されるプロトコルは、胸腔内注射(30°角度、2〜3mmの深さ)を確保するために腫瘍細胞を含む小容量の培地の精密かつ穏やかな注入を可能にする。
オルソトピックMPMモデルの縦方向モニタリングは、技術をイメージングすることによってのみ非侵襲的に行うことができる。PET/CTは、MPMを診断するための臨床現場での推奨方法であり、その結果、この研究20、21で使用されている。広く使用されている光学イメージングと比較して、PET/CTイメージングは放射性化合物の使用を伴うため、安全性、放射線トレーサーのロジスティクスおよびそのコスト28のためにセットアップがより繊細です。それにもかかわらず、PET/CTイメージングは腫瘍細胞の遺伝子改変に依存せず、高解像度の断層、解剖学的、分子情報を提供します。光学イメージングもPET/CTよりも高速ですが、本稿で紹介するイメージングシステムには3マウスベッドと約20匹のマウスを含み、収集された情報を考慮すると合理的なスループットです。高可用性臨床ラジオトレーサー[18F]FDGの使用は、この技術29で行われる研究に高い翻訳力を保証する。[18F]FDG-PETスキャンの読み取り値と分析は、周囲の心臓および褐色脂肪組織の取り込みが高いため、ある程度の経験を必要とするかもしれないが、CTとの組み合わせは診断を洗練させる。[18F]FDG PET/CT実験中に、マウスの絶食および温暖化だけでなく、1時間の[18F]FDGの取り込み時間を行うことは、既に説明したようにPETコントラストに大きく影響を与えるスキャン条件であるため、腫瘍の可視化を著しく高めることができる。他の臨床的に使用される放射線トレーサーを含む前臨床直体モデルに関するさらなる研究[18F]フルオロチミジン(FLT)または[18F]フルオロソニダゾール(FMISO)は、それぞれ増殖および低酸素を監視し、このような信頼性の高い直視MPMモデル29に関するより多くの情報を提供することができる。
最後に、非侵襲的イメージングと組み合わせたこの関連翻訳モデルは、3R概念に完全に沿ったものであり、Rは動物の数を誘発し、Refineは痛みや不快感を軽減し、Rは代替22を用いた動物実験を軽減する。実際、同じ動物のセット内で、治療のフォローアップと応答を非侵襲的に監視し、実験全体を通して縦方向の測定を可能にし、実験ごとに必要な動物の数を減らすことができます。また、各動物が経時に対する独自の制御を表すように、非侵襲的イメージングはまた、信頼性の高いデータ16を得るために必要な動物の数を減少させる統計的パワーを非常に増加させる。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、リーグ・ジュネーブ・コントル・ル・ガン(V.S.-B.へ)とジュネーブ・ローザンヌ大学病院バイオメディカルイメージングセンター(CIBM)(D.J.C.、O.B.、S.G.へ)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
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