ラット中枢神経系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの子宮内送達
Summary
ここでは、脊椎の腰部内腔にカテーテルを移植してラット中枢神経系に薬物を送出する方法について説明する。私たちはアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に焦点を当てていますが、この方法は他の治療モダリティの送達にも適しています。
Abstract
血液脳関門(BBB)は、血液から中枢神経系(CNS)への潜在的に有毒または病原性物質の入り口に対する重要な防御である。しかしながら、その存在はまた、CNSに全身的に投与された治療薬のアクセシビリティを劇的に低下する。これを克服する1つの方法は、これらの薬剤を脳脊髄液(CSF)に直接注入し、したがってBBBをバイパスすることです。これは浸透ポンプを使用して連続的な注入のためのカテーテルの注入によって、または単一のボーラスの配達のために行うことができる。本稿では、成人ラット脊椎のカウダ平ーナ空間に直接移植されたカテーテルを介してCNS標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を送達するための外科的プロトコルについて説明する。代表的な結果として、ラットCNSの異なる領域で標的RNAをノックダウンするこのカテーテル法を介した単一のボーラスASO内皮(IT)注射の有効性を示す。プロシージャは安全で、有効であり、高価な装置または外科用具を要求しない。ここで説明する技術は、他のモダリティでも薬物を送出するように適合させることができる。
Introduction
中枢神経系(CNS)の血管系は、恒常性の重要な調節体として進化し、分子のトラフィックを制御し、栄養素を供給し、廃棄物を取り除いた。このシステムはまた、内皮細胞の壁に沿って密な接合部の密集した分布のおかげで、外部病原体の攻撃からの防御の最初のラインです。これらのタイトな接合部は、血液脳関門(BBB)の1つの側面を構成する。BBBは、栄養素とエネルギー要求(例えば、イオン、グルコース)を満たすために必要な分子の輸送を可能にする一方で、それはまた、有害化学物質1、2、3と同様に病原体の通過を選択的に制限する。
皮肉なことに、病原体や有毒化学物質の通過を制限するBBBの同じ保護機能も、生物2への全身投与後に治療治療を受けてCNSに容易にアクセスする能力の大きな障害である。 4、5.BBBのこの役割は、新しい薬剤流通技術の多くの開発を促し、アプローチ6.
この障害を克服する1つの方法は、脳と脊髄7、8、9、10の両方を連続的に浸透させる脳脊髄液(CSF)に薬物を直接注入することです。本稿では、カテーテルの内端をラット脊椎のカウダ平名空間に完全に配置することにより、腰部内腔に薬剤を正常に送り込む方法について説明する。この手順の説明は、以前に Mazur et al.11. .
このプロトコルは非常に有効であり、標的遺伝子ノックダウン8の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析によって評価された場合、CNSへのアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)送達の90%以上の成功率を生成する。この処置は、ラットの100%が手術を生き延び、外科的創傷の周りに最小限の腫脹を示し、苦痛の兆候を示さない(例えば、多動、脱水、循環、バランスの喪失、食物摂取量の減少、および脱水)、オペ後の観察中。ここで説明する方法のもう一つの利点は、高価な機器や特別なツールを必要としないということです。
Protocol
すべての生体内の手順は、実験動物のケアと使用のための米国国立衛生研究所ガイドが定めるガイドラインに従うバイオジェン制度動物使用ケア委員会(IACUC)承認プロトコルの下で行われました。 1. 材料および器具の準備 特別ガイドカニューレを準備します。 カットオフホイール(または鋭い鋸)を備えたロータリーツールを使用して19G針の両端を切り取り、…
Representative Results
ここで説明する方法を用いて、リン酸緩衝生理食塩水PBSの単一ボーラスまたは長い非コーディング(linc)RNA Malat1を標的とするASOの300μgを用いて成体メスラットの2つのグループ(250−300g;n=10/グループ)を注入した。私たちの研究室では、Malat1が脳と脊髄を含むすべての組織14でユビキタスかつ高レベルで表現されているため、Malat1 ASOをツールコンパウン?…
Discussion
本論文は、ラットCNSに直接治療薬を送り込む強力な方法を示す。理論的には、マウスでも同様の技術を行うことができますが、サイズが小さいため、この方法はより困難になる可能性があります。したがって、我々のグループは、CNS薬物送達のためのマウスにおける血管膜内血管内注射(ICV)を行い、異なる投与経路を通じて同じ目標に達する。その方法は、別の研究16に記載…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この記事に記載されているASOを提供してくれたIonis製薬に感謝します。
Materials
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | ||
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | ||
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | ||
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) | |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) | |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E | 120V 1.2A |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | ||
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | ||
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i | |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 | |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | ||
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | ||
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | ||
| Povidone scrub | PDI | S48050 | ||
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G | |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 | |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | ||
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 | |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | ||
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | |||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | ||
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) | 1.5” diameter, Pk5 |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | 1.5”, Pk2 | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | |||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | 1.5” diameter | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | |||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | ||||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | ||
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | ||
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | ||
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
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Cite This Article
Chen, Y., Mazur, C., Luo, Y., Sun, L., Zhang, M., McCampbell, A., Tomassy, G. S. Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System. J. Vis. Exp. (152), e60274, doi:10.3791/60274 (2019).