Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat

doi: 10.3791/60274 Published: October 29, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschrijven we een methode voor het leveren van geneesmiddelen aan het centrale zenuwstelsel van de rat door het implanteren van een katheter in de lumbale intrathecale ruimte van de wervelkolom. We richten ons op de levering van antisense oligonucleotiden, hoewel deze methode ook geschikt is voor de levering van andere therapeutische modaliteiten.

Abstract

De bloed-hersen barrière (BBB) is een belangrijke verdediging tegen de ingang van potentieel toxische of pathogene agentia uit het bloed in het centrale zenuwstelsel (CNS). Echter, het bestaan ervan ook drastisch verlaagt de toegankelijkheid van systemisch toegediende therapeutische middelen naar het CZS. Een methode om dit te overwinnen, is om te injecteren die agenten rechtstreeks in de cerebrospinale vloeistof (CSF), dus het omzeilen van de BBB. Dit kan worden gedaan via implantatie van een katheter voor continue infusie met behulp van een osmotische pomp, of voor een enkele bolus afgifte. In dit artikel beschrijven we een chirurgisch protocol voor de levering van CNS-targeting antisense oligonucleotiden (ASOs) via een katheter die rechtstreeks in de Cauda equina-ruimte van de volwassen rat wervelkolom wordt geïmplanteerd. Als representatieve resultaten tonen we de werkzaamheid van een enkele bolus ASO intrathecale (IT) injectie via dit catheterisatie systeem bij het kloppen van het doelwit RNA in verschillende regio's van de rat CNS. De procedure is veilig, effectief en vereist geen dure apparatuur of chirurgische hulpmiddelen. De hier beschreven techniek kan ook worden aangepast om geneesmiddelen in andere modaliteiten te leveren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het vasculaire systeem van het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft zich ontwikkeld als een kritische regulator van homeostase, beheersing van het verkeer van moleculen, leveren van voedingsstoffen en het wegwerken van afval. Dit systeem is ook de eerste verdedigingslinie tegen aanvallen van externe pathogenen, dankzij een dichte verdeling van krappe knooppunten langs de wanden van de endotheelcellen. Deze strakke knooppunten vormen één aspect van de bloed-hersen barrière (BBB). Terwijl de BBB toelaat het transport van moleculen die nodig zijn om te voldoen aan voedings-en energiebehoeften (bijv., ionen, glucose), het ook selectief beperkt de passage van pathogenen evenals giftige chemicaliën1,2,3.

Ironisch genoeg is dezelfde beschermende functie van de BBB die de passage van pathogenen en giftige chemicaliën beperkt, ook het belangrijkste obstakel voor ons vermogen om gemakkelijk toegang te krijgen tot het CZS met therapeutische behandelingen na systemische toediening aan het organisme2, 4,5. Deze rol van de BBB heeft de ontwikkeling van een overvloed aan nieuwe drug distributietechnologieën en benaderingen6.

Een manier om dit obstakel te overwinnen is om de drugs rechtstreeks in de cerebrospinale vloeistof (CSF) die voortdurend perfuses zowel de hersenen en het ruggenmerg7,8,9,10injecteren. In dit artikel beschrijven we een methode om met succes agenten in de lumbale intrathecale ruimte te leveren door het inwendige uiteinde van de katheter volledig in de Cauda equina-ruimte van de rat-wervelkolom te plaatsen. Een beschrijving van deze procedure werd eerder gepubliceerd door Mazur et al. elders11.

Het protocol is zeer effectief en produceert een groter dan 90% slagingspercentage van antisense oligonucleotide (ASO) levering aan het CZS bij beoordeling door kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) analyse van doel gen knockdown8. De procedure veroorzaakt een minimaal ongemak voor de dieren, aangezien 100% van de ratten de operatie overleeft en minimale zwelling rond de chirurgische wond vertoont en geen tekenen van nood (bijv. hyperactiviteit, uitdroging, cirkelen, verlies van balans, verminderde voedselinname, en Dehydratie) tijdens post-op observatie. Een ander voordeel van de hier beschreven methode is dat het geen dure apparatuur of speciale gereedschappen vereist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle in vivo procedures werden uitgevoerd onder het Biogen institutioneel Dierengebruiks-en zorg Comité (IACUC) goedgekeurde protocollen die de richtlijnen volgen die zijn uiteengezet door de National Institutes of Health Guide van de Verenigde Staten voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. voorbereiding van materiaal en instrumenten

  1. Bereid de speciale gids cannulas.
    1. Gebruik een roterende tool met een afgesneden wiel (of een scherpe zaag) om de twee uiteinden van een 19 G-naald af te snijden, wat resulteert in een ~ 1,5 − 2 cm lange geleidecanule (Figuur 1AIII). Gebruik het slijpwiel van het roterende gereedschap om de twee uiteinden glad te strijken.
      Opmerking: als alternatief, premade en steriele gids canules kunnen worden gekocht bij een commerciële leverancier (tabel van materialen).
  2. Bereid de katheter/draad assemblage.
    1. Snijd een 8 cm lang stuk PE-10 tubing (polyethyleen buizen, diameter 0,011 inch) als de intrathecale katheter dienen. Maak een merkteken 2 cm van het ene uiteinde met een ethanol bestendige marker pen. Snijd een 11 cm lange gliderite draad van roestvrijstaal draad met polytetrafluorethyleen coating. Plaats de gliderite-draad (Figuur 1AII) in het lumen van de PE-10-katheter (Figuur 1AI).
      Opmerking: voor elk dier is een katheter/draad assemblage set (afbeelding 1AV) nodig. Als alternatief kunnen katheters en gliderite draden worden gekocht bij een commerciële leverancier (tabel van materialen).
  3. Voorbereiden van levering katheter assemblage.
    1. Snijd een stukje PE-50 katheter (5 − 10 cm, polyethyleen buizen, diameter 0,023 inch) (Figuur 1bi). Aan één uiteinde van de PE50 katheter een 23 G slang adapter invoegen (Figuur 1BIV). Dit uiteinde wordt tijdens de operatie aangesloten op een spuit van 100 μL (tafel van materialen). Plaats een gemodificeerde 30 G naald met naaf afgesneden (Figuur 1biii) in een ongeveer 0,5 cm stuk PE-10 slang (Figuur 1bii) en verbind de PE-10 slang met het andere uiteinde van de katheter.
    2. De 30 G naald einde van de levering katheter assemblage (Figuur 1bv) zal worden aangesloten op het distale uiteinde van de geïmplanteerde PE-10 katheter in de rat tijdens de operatie.
      Opmerking: als alternatief kan de leverings katheter assemblage (afbeelding 1bv) worden gekocht bij een commerciële leverancier (tabel met materialen).
  4. Bereid de geleidecanule-naald assemblage (Figuur 1AVI) door een geleidecanule (Figuur 1AIII) over het uiteinde van een naald van 23 G te plaatsen.
  5. Steriliseren alle chirurgische instrumenten, waaronder de geleidecanule en de draad/katheter sets met behulp van een ethyleenoxide sterilisator voor 12 h.
    Opmerking: alle chirurgische instrumenten behalve de katheter kunnen worden autoclaved; katheter zal smelten op hoge temperatuur.

2. chirurgie voorbereiding

Opmerking: deze procedure wordt routinematig uitgevoerd op mannelijke en vrouwelijke Sprague Dawley ratten met lichaamsgewicht tussen 200 g en 400 g. Er worden twee ratten per kooi ondergebracht onder een licht/donkere cyclus van 12 uur met gratis toegang tot voedsel en water.

  1. Gewicht een rat en plaats het in een Isofluraan kamer voor het opwekken van anesthesie (1 − 5% Isofluraan in O2, getitreerd tot effect).
    Opmerking: de rat wordt vervolgens voortdurend verdoving met Isofluraan om diepe anesthesie via een neuskegel gedurende de hele procedure te handhaven. Een alternatieve anesthesie methode (bv. toediening van ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg) kan worden gebruikt zoals goedgekeurd door het IACUC.
  2. Wanneer de rat niet reageert op een teen knijpen, scheren haar terug van de staart naar de caudal thoracale wervelkolom en plaats de geschoren rat op de een steriele plaat gelegd bovenop een verwarmingskussen.
  3. Plaats een conische centrifugebuis van 50 ml onder de buik van de rat om de wervelkolom in het lumbale gebied te buigen (Figuur 2a) en breng oogheelkundige zalf aan op de ogen.
  4. Injecteer aanhoudende afgifte buprenorfine (1,0 mg/kg; Tabel met materialen) subcutaan bij de rat. Reinig de blootgestelde huid met afwisselend Povidon en alcohol Scrubs en herhaal dit drie keer.
    Opmerking: een alternatieve pijnverlichting kan worden gebruikt zoals goedgekeurd door het IACUC-protocol.
  5. Draperen het dier met een steriele transparante draperen die is fenestrated over de operatieplaats.

3. chirurgie

  1. Met de rat ondersteund door de 50 mL conische buis, Identificeer de twee natuurlijke putten tussen spieren boven het bekken (pijlen in Figuur 2A). Met één hand die die putten vasthoudt, gebruik de andere hand om zachtjes de wervelkolom van caudal naar rostrale migratoire richting te drukken en de eerste grote inkeping tussen wervels te vinden en dit is de tussen wervel ruimte tussen S1 en L6 wervels (Figuur 2B ).
  2. Verplaats een licht rozet om de volgende inspringing te bepalen, de tussen wervel ruimte tussen de L5 en L6 wervels en de injectieplaats (* in Figuur 2A). Gebruik een scalpel om een incisie niet meer dan 2 cm lang in de huid langs de middenlijn van rostrale migratoire naar caudal te maken, zodat de injectieplaats zich in het midden van de incisie bevindt (gestippelde lijn in Figuur 2a).
  3. Gebruik dissectie schaar om het bindweefsel te ontleden om de spierlaag te visualiseren. Maak vervolgens een incisie van 1 cm in de spier capsule onmiddellijk lateraal aan het ruggengraat proces van de L6 lumbale wervel.
    Opmerking: de botten van de L6 lumbale wervel kunnen op dit moment worden gevisualiseerd.
  4. Positioneer de geleidecanule-naald assemblage in de buurt van het voorste deel van de 6e lumbale wervel en duw het in de tussen wervel ruimte langs het voorste deel van de 6e wervel, zodat het uiteinde van de naald door het Ruggenmergkanaal dringt. Duw de geleidecanule op zijn plaats langs de naald en verwijder de 23 G naald die alleen de geleidecanule op zijn plaats laat staan.
    Opmerking: het is handig om de botte Tang te gebruiken om het rugproces van de L6 lumbale wervel te lokaliseren voordat u de naald insteekt. In het algemeen, CSF vloeistof kan worden gezien het invoeren van de naald hub (deze vloeistof kan worden getint met een vleugje bloed, maar dit geeft niet aan dat schade is gedaan of dat de naald niet correct is geplaatst). De auteurs hebben niet gezien grote hoeveelheid bloed of ernstige bloeden tijdens deze procedure. Als dit gebeurt, moet een dierenarts worden gecontacteerd om de juiste behandeling te bepalen en als de dieren moeten worden geëerd.
  5. Plaats de katheter-draad assemblage in de geleidecanule. Hoek naar beneden de katheter-draad assemblage op ongeveer een 45 ° hoek naar het Ruggenmergkanaal en forceer het einde ongeveer 0,3 cm in het Ruggenmergkanaal.
  6. Verwijder de geleidecanule en laat de katheter met de gliderite draad op zijn plaats. Verwijder de gliderite-draad ongeveer 2,5 cm van de intrathecale punt van de katheter en trek de katheter in het wervelkanaal totdat het 2 cm-teken zich bij de ingang van het kanaal bevindt (alleen zichtbaar onder de spier), zoals weergegeven in Figuur 1bvi.
    Opmerking: de ingevoegde katheter moet rostraal in de subarachnoïde ruimte worden verlengd. Succesvolle plaatsing moet het mogelijk maken voor vrij verkeer van de katheter in die ruimte.
  7. Volledig terugtrekken de gliderite draad, en CSF kan worden gezien het invoeren van de geïmplanteerde katheter.
  8. Verbind de lever katheter assemblage met het distale uiteinde van de geïmplanteerde katheter via de 30 G naald uiteinde (Figuur 1BV, VI).
  9. Laad 60 μL steriele zoutoplossing in een spuit van 100 μL (spoel spuit). Plaats een bolus van 30 μL van de teststof (bv. ASO-oplossing) in een tweede spuit (injectiespuit).
  10. Sluit de spoel spuit (geladen met zoutoplossing) aan op het uiteinde van de slang adapter van de katheter assemblage (Figuur 1bv). Injecteer 20 μL steriele zoutoplossing in de intrathecale ruimte (spuien vóór de injectie).
  11. Sluit de injectiespuit (geladen met teststof) aan op het uiteinde van de slang adapter van de katheter assemblage (Figuur 1bv). Injecteer 30 μL teststof in de intrathecale ruimte van meer dan 30 sec.
    Opmerking: het routinematige injectievolume ASO is 30 μL om een goede terugslag in het ruggenmerg en in de cortex te bereiken. Er is gemeld dat de injectievolumes kunnen invloed hebben op samengestelde distributie12, hoewel verschillende injectievolumes niet zijn getest. Indien een andere verbinding of volume wordt gebruikt, moeten de veiligheid en de werkzaamheid empirisch worden bepaald.
  12. Herhaal stap 3,10 en spoel de katheter met een andere 40 μL steriele zoutoplossing (na het spuien). Vervolgens loskoppelen van de levering katheter vergadering van de geïmplanteerde katheter.
    Opmerking: de pre en post-Injection Flush wordt gedacht om lokale vastlegging van de verbindingen te verminderen en verbeteren van hun distributie naar de rostrale migratoire structuren12.
  13. Aseptisch knippen en verwarmen van de geïmplanteerde katheter: plaats een paar steriele dissectie Tang in een kraal sterilisator totdat ze erg heet zijn en klem de slang vervolgens met het hete uiteinde van de Tang aan.
    Opmerking: deze actie smelt de katheter. Zo wordt het gat in de buis ingestort en alle zijden aan elkaar kleven, de slang op aseptische wijze afdichten en vervolgens in de subcutane ruimte worden geplaatst.
  14. Gebruik absorbabel monofilament hechtingen om de resterende hitte dichte katheter aan het bindweefsel te beveiligen. Gebruik vervolgens niet-absorbabele monofilament hechtingen om de huid te sluiten over de beveiligde, met hitte verzegelde katheter.
    Opmerking: wond clips kunnen ook worden gebruikt zoals goedgekeurd door het IACUC-protocol. De techniek is compatibel met herhaalde injecties al is het alleen gebruikt voor eenmalige injecties in onze handen. De haalbaarheid van herhaalde injecties moet met de goedkeuring van het IACUC empirisch worden geëvalueerd.
  15. Gebruik gaas en zoutoplossing om elk bloed van de huid te wassen en laat het dier zich herstellen van de anesthesie in een verwarmde incubator tot het mobiel is, waarna het terugkeert naar zijn huis kooi (twee ratten per kooi).
    Opmerking: bij het uitvoeren van operaties op meerdere ratten op dezelfde dag, schoon gereedschap met behulp van water om bloed te verwijderen en opnieuw te steriliseren met behulp van een verwarmde droge kraal sterilisator (voor ten minste 20 s, met tijd om te koelen) tussen dieren. Elke 5 dieren wordt een nieuwe set instrumenten gebruikt.
  16. Bewaak de dieren dagelijks gedurende ten minste 3 dagen na de operatie en blijf de dieren wekelijks volgen na het herstellen van een operatie volgens het IACUC-protocol.
    Opmerking: als er complicaties optreden (urineretentie, incisie infecties, neurologische aandoening zoals inbeslagneming of verlamming), moet een dierenarts worden gecontacteerd om de juiste behandeling te bepalen en als dieren moeten worden geëuseerd. Als de aanhoudende afgifte buprenorfine niet wordt gebruikt, dient pijnbestrijding dagelijks na de operatie te worden gegeven volgens het IACUC-protocol.

4. evaluatie van weefsel specifieke knockdown na injectie

  1. Twee weken na de bolusinjectie van Aso's, verzamel verschillende hersengebieden (d.w.z. cerebrale cortex, striatum en cerebellum), evenals verschillende segmenten van het ruggenmerg (d.w.z. baarmoederhals, thoracale en lumbale). Extractie van totaal weefsel RNA met behulp van een commerciële RNA-extractie-Kit en uitvoeren van cDNA synthese reactie zoals eerder beschreven13.
    Opmerking: standaard reagentia werden gebruikt voor qPCR met de volgende assays: Rat Malat1 en rat GAPDH. De relatieve transcriptie niveaus werden berekend met behulp van de 2-δδCT - methode (CT = drempel cyclus).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Met behulp van de hier beschreven methode hebben we twee groepen volwassen vrouwelijke ratten geïnjecteerd (250 − 300 g; n = 10/groep) met ofwel een enkele bolus fosfaat-gebufferde zoutoplossing PBS of 300 μg ASO gericht op de lange non-coding (Linc) RNA Malat1; in ons lab gebruiken we routinematig de Malat1 ASO als een gereedschaps verbinding, omdat Malat1 alomtegenwoordig en op hoog niveau in alle weefsels14wordt uitgedrukt, inclusief de hersenen en het ruggenmerg. De Malat1 ASO werkt via een RNaseH1 gemedieerd mechanisme15 dat het RNA degradeert, wat leidt tot knockdown (KD). In het hier beschreven experiment verzamelen we verschillende hersengebieden (d.w.z. cerebrale cortex, striatum en cerebellum), evenals het lumbale segment van het ruggenmerg, twee weken na de bevalling van de ASO. RNA uit elk van de verzamelde regio's werd vervolgens geëxtraheerd en geanalyseerd via qPCR, om de niveaus van expressie van het Malat1-RNA te beoordelen.

Wanneer de geteste agent een ASO is, raden we aan om: 1) altijd meerdere regio's van het CZS te verzamelen, om de werkzaamheid van ASO te vergelijken; 2) gezien de technische complexiteit van de chirurgische methode, raden we aan om een positieve controlegroep op te nemen, waarbij een verbinding met gevestigde farmacokinetische en farmacodynamische eigenschappen (d.w.z. Malat1 ASO in ons laboratorium) parallel aan de teststof wordt getest; Dit zal informatie verschaffen over de effectiviteit van de operaties, mochten er onverwachte of onverklaonbare resultaten worden behaald (bijv. gebrek aan of onvoldoende RNA-regulering).

In het hier beschreven experiment hebben we heel goed KD verkregen in alle verzamelde regio's, zoals weergegeven in Figuur 3. We hebben echter een zekere mate van regionale variabiliteit in acht nemen met het ruggenmerg dat het hoogste percentage KD toont (cerebrale cortex = 87% KD, striatum = 77% KD, cerebellum = 74% KD, ruggenmerg = 94% KD). We hebben niet toegang tot in vivo knockdown efficiëntie eerder dan 2 weken na de operatie. In onze ervaringen met verschillende ASOs, hebben we een significante knock-down van de doel genen ontdekt tot 6 − 8 weken na de operatie (gegevens worden niet weergegeven). Er moet een tijd-cursus studie worden uitgevoerd als de precieze tijdafhankelijke knockdown-efficiëntie van een bepaalde ASO van belang is.

Figure 1
Figuur 1: aangepast materiaal en katheter sets gebruikt in intrathecale injecties. A) de katheter/draad assemblage (v) wordt gemaakt door het inbrengen van gliderite draad (II) in het lumen van de PE-10 katheter (i). De canule/naald assemblage (VI) wordt gemaakt door een naald van 23 G in het lumen van de geleidecanule (III) te plaatsen. B) de lever katheter assemblage (v) wordt gemaakt door een slang adapter aan te sluiten op het ene uiteinde van de pe-50 katheter en de snede 30 G naald in het andere uiteinde aan te sluiten met behulp van een stukje PE-10 katheter (II) als adapter. Tijdens de operatie, de 30 G naald uiteinde van de levering katheter assemblage (v) is aangesloten op de bovenkant van de geïmplanteerde katheter (VI), na het andere uiteinde van de geïmplanteerde katheter wordt ingebracht in de intrathecale ruimte van het dier. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: identificatie van de injectieplaats en incisie lijn. (A) met de buik van de rat, ondersteund door een conische buis van 50 ml, zijn de twee putjes tussen de spieren boven het bekken gemakkelijk te zien (pijlen). B) met één hand met de putten, gebruik de andere hand om de wervelkolom zachtjes te drukken en te voelen en de tussen wervel ruimte tussen de L5 en L6 wervels te vinden, d.w.z. de injectieplaats (* in paneel A). De stippellijn in paneel A toont de incisie lijn met de injectieplaats in het midden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: een enkelvoudige bolusinjectie van ASOs vermindert de rat Malat1 in vivo. We injecteerde een enkele bolus van PBS of 300 μg Malat1 ASO; twee weken na de operatie hebben we verschillende regio's van het CZS verzameld en de uitdrukkings niveaus van Malat1 RNA gekwantificeerd. We verkregen goede KD van Malat1 RNA in alle regio's geanalyseerd, met enige variabiliteit tussen regio's (cerebrale cortex = 87% KD, striatum = 77% KD, cerebellum = 74% KD, ruggenmerg = 94% KD; foutbalken = ± SEM). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het huidige artikel toont een krachtige methode om therapeutische agenten rechtstreeks in de rat CNS. In theorie kan een vergelijkbare techniek ook worden uitgevoerd bij muizen, maar vanwege de kleinere grootte kan de methode uitdagender zijn. Daarom, onze groep voert intracerebroventriculaire (ICV) injecties in muizen voor het CZS drug delivery, die dezelfde doelen bereiken via een andere toedieningsroute. Deze methode is beschreven in een andere studie16.

Het voordeel van de hier beschreven methode is dat het geen dure apparatuur of speciale gereedschappen vereist. We raden aan om de katheter/draad assemblage voor te bereiden in afbeelding 1A van tevoren. Men moet minstens zo veel katheter/draad assemblages voorbereiden als er ratten in de studie zijn, hoewel we voorstellen om een aantal extra katheter/draad assemblages voor te bereiden in het geval sommige zijn beschadigd of moeten worden vervangen tijdens de operatie.

Zodra de techniek wordt beheerst, vereist de hele beschreven procedure ongeveer 25 minuten per rat, waardoor veel ratten binnen één dag kunnen worden behandeld. Als één persoon de operatie op de eerste Rat uitvoert, en een tweede persoon doet chirurgische voorbereiding op de volgende rat, twee ratten kunnen worden verwerkt op hetzelfde moment te verminderen per dier tijd. Voor een bedreven operator is er nog een kleine kans dat de naald de epidurale ruimte bereikt in plaats van de subarachnoïde ruimte. Observatie van CSF-terugstroming is een goede indicatie van de juiste naaldpositie, maar het is niet perfect. We raden aan om een doelbetrokkenheids test zoals de RNA-knock-outanalyse zoals beschreven in de resultaat sessie te laten uitvoeren om de juiste afgifte van de teststof te bevestigen.

Het opzetten van technieken zoals die hier beschreven, is cruciaal voor de ontwikkeling van een robuuste pre-klinische onderzoek pijpleiding die kan ontwikkelen CNS-targeting therapieën. Inderdaad, het leveren van ASOs als een therapeutische interventie is een methode die momenteel wordt onderzocht voor de behandeling van vele aandoeningen van het CZS17,18,19,20. Nusinersen, een ASO-based behandeling voor patiënten met spinale musculaire atrofie (SMA), werd onlangs in verschillende markten wereldwijd goedgekeurd en toonde de toepasbaarheid van deze methode ook aan pediatrische patiënten21,22, 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs zijn alle medewerkers van Biogen, Inc. of ionis Pharmaceuticals. De auteurs ontvangen de antisense oligonucleotiden beschreven in het artikel van ionis Pharmaceuticals.

Acknowledgments

We willen ionis Pharmaceuticals bedanken voor het leveren van de ASOs zoals beschreven in het artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture 3M 1020
70% ethanol Decon Laboratories, Inc 8416-160Z
Alcohol swab sticks Dynarex NO 1204
BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip BD 1ml TB Luer-Lok tip BD 302830
BD Intramedic PE Tubing BD Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Tubing BD Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic PE Tubing Adapters BD 23 gauge intramedic luer stub adaper BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G BD BD 305128
Buprenorphine Sustained Release-lab ZooPharm Prescription required
Ethylene oxide sterilizer Andersen Sterilizer INC. AN 74i, gas sterilizer AN 74i
Guide cannula BD 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle BD 305186
Hamilton syringe 100ul Hamilton company Hamilton syringe 100ul
Hot bead Sterilizer Fine Science Tools STERILIZER MODELNO FST 250
Ophthalmic ointment Dechra veterranery product 17033-211-38
Pocket Pro Pet Trimmer Braintree Scientific CLP-9931 B
Povidone scrub PDI S48050
Saline Baxter Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml FE1306G
Scalpel Feather disposable scalpel No. 10
Small animal heating pad K&H Manufacturing Model # 1060
Stylet Wire McMaster-Carr 1749T14 LH-36233780
Surgery Towel drape Dynarex 4410
Surgical scissors and forceps FST and Fisher Scientific
Sutures Ethicon 4-0 or 5-0
Tool to make the Guide cannular Grainger Rotary tool (Dremel) 14H446 (Mfr: EZ456)
EZ lock cut off Wheel 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
Grinding Wheel, Aluminum Oxide 38EY44 (Mfr: EZ541GR)
EZ lock Mandrel 1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
Diamond wheel floor Tile 3DRN4 (Mfr: EZ545)
Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure
Dosing catheter system SAI Infusion Systems RIDC-01
Guide cannula SAI Infusion Systems RIDC-GCA
Internal Catheters SAI Infusion Systems RIDC-INC
Stylet Wire SAI Infusion Systems RIDC-STY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 5-23 (2005).
  2. Greene, C., Campbell, M. Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules. Tissue Barriers. 4, (1), e1138017 (2016).
  3. Daneman, R., Engelhardt, B. Brain barriers in health and disease. Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16, (1), 1-13 (2004).
  5. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Research Reviews. 64, (2), 328-363 (2010).
  6. Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. Recent advances in delivery through the blood-brain barrier. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14, (9), 1148-1160 (2014).
  7. Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. A new look at cerebrospinal fluid circulation. Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).
  8. Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor. Neuron. 12, (4), 805-810 (1994).
  9. Wahlestedt, C., et al. Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions. Nature. 363, (6426), 260-263 (1993).
  10. Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science. 259, (5094), 528-531 (1993).
  11. Mazur, C., et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).
  12. Wolf, D. A., et al. Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, (2), e85311 (2016).
  13. Becker, L. A., et al. Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice. Nature. 544, (7650), 367-371 (2017).
  14. Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions. RNA Biology. 14, (12), 1705-1714 (2017).
  15. Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metabolism. 27, (4), 714-739 (2018).
  16. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
  17. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. Journal of Clinical Investigation. 128, (8), 3558-3567 (2018).
  18. Schoch, K. M., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases. Neuron. 94, (6), 1056-1070 (2017).
  19. Lane, R. M., et al. Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease. Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).
  20. Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Antisense oligonucleotides in neurological disorders. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
  21. Haché, M., et al. Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience. Journal of Child Neurology. 31, (7), 899-906 (2016).
  22. Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy. Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).
  23. Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Nusinersen for spinal muscular atrophy. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Mazur, C., Luo, Y., Sun, L., Zhang, M., McCampbell, A., Tomassy, G. S. Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System. J. Vis. Exp. (152), e60274, doi:10.3791/60274 (2019).More

Chen, Y., Mazur, C., Luo, Y., Sun, L., Zhang, M., McCampbell, A., Tomassy, G. S. Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System. J. Vis. Exp. (152), e60274, doi:10.3791/60274 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter