Summary

מולטי-סיב פונסה להקליט פעילות עצבית בבעלי חיים הנעים באופן חופשי

Published: October 20, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה מפרט כיצד ליישם ולבצע הקלטות מרובות סיבים, כיצד לתקן את הפריטים שאינם תלויים בסידן, ושיקולים חשובים עבור הדמיה צבעונית כפולה.

Abstract

הקלטת הפעילות של קבוצת נוירונים בחיה הנעה בחופשיות היא משימה מאתגרת. יתר על כן, כמו המוח הוא גזור קבוצות קטנות יותר תפקודית פונקציונלי, הוא הופך להיות הראשון להקליט מן התחזיות ו/או המוגדרים גנטית תת אוכלוסיות של נוירונים. בדרך-אגב, מדובר בגישה הנגישה ורבת עוצמה היכולה להתגבר על האתגרים הללו. על-ידי שילוב מתודולוגיות אופטיות וגנטיות, ניתן למדוד את הפעילות העצבית במבני מוח עמוקים על-ידי הבעת הבעת מחווני סידן מקודדים גנטית, אשר מתרגמים את הפעילות העצבית לאות אופטי שניתן למדוד בקלות. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הרכיבים של מערכת מרובת סיבים מולטי-סיב, כיצד לגשת למבני מוח עמוקים כדי לספק ולאסוף אור, שיטה לחשבון ממצאים התנועה, וכיצד לעבד ולנתח אותות פלורסנט. הפרוטוקול מפרט שיקולים ניסיוניים בעת ביצוע דימות צבע יחיד וכפול, מסיבים אופטיים בודדים או מרובים.

Introduction

היכולת להתאים תגובות עצביות עם היבטים ספציפיים של התנהגות בעל חיים הוא קריטי כדי להבין את התפקיד קבוצה מסוימת של נוירונים משחק בבימוי או להגיב לפעולה או גירוי. בהתחשב במורכבות של התנהגות בעלי חיים, עם מספר רב של מדינות פנימיות וגירויים חיצוניים שיכולים להשפיע אפילו על הפשוטה ביותר של הפעולות, הקלטת אות עם החלטה חד משפט החוקרים עם הכלים הדרושים כדי להתגבר על אלה גבלות.

סיבים פואביל הפך להיות טכניקה של בחירה עבור חוקרים רבים בתחום של מערכות מדעי המוח בגלל הפשטות היחסית שלה לעומת אחרים בטכניקות הקלטה vivo, היחס הגבוה שלה האות לרעש, ואת היכולת להקליט במגוון של , תבניות התנהגותיות1,2,3.4,5,6,7,8 שלא כמו שיטות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות, פוגינסה היא הגישה האופטית הנפוצה ביותר בשילוב עם אינדיקטורים הסידן מקודד גנטית (הסמארה, סדרת GCaMP)9. הסמתים משנים את יכולתם לעבור בהתבסס על השאלה אם הם קשורים לסידן. בגלל הריכוז הפנימי של הסידן בנוירונים הוא מוסדר מאוד בחוזקה וערוצי סידן מגודרת לפתוח כאשר תא העצב יורה פוטנציאל פעולה, עליות חולף בריכוז הסידן הפנימי, אשר התוצאה עליות ארעי ב יכולת של הסמא לקרינה פלואורסצנטית, יכול להיות פרוקסי טוב לירי עצבי9.

עם מילוי סיבים אופטיים, אור העירור מכוון למטה, סיב אופטי רב-מצבי במצב למוח, ואות פליטה נאסף בחזרה דרך אותו סיבים. בגלל סיבים אופטיים אלה הם קלים משקל, בעלי חיים יכולים לנוע במידה רבה ללא הפריע, מה שהופך את הטכניקה הזאת תואם עם מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות ותנאים. תנאים מסוימים, כגון תנועות מהירות או כיפוף של כבל טלאי סיבים אופטיים מעבר לרדיוס שבו הוא יכול לשמור על השתקפות פנימית מוחלטת, יכול להציג ממצאים האות. כדי לאותת מתוך רעש, נוכל לנצל את הרכוש של GCaMP המכונה “נקודת isosbestic”. בקצרה, עם GCaMP, כמו אורך הגל של האור עירור הוא העביר שמאלה, הפליטה שלה במצב הסידן מאוגד פוחתת ואת הפליטה במצב הסידן מאוגד מגדיל במעט. הנקודה שבה האינטנסיביות היחסית של שתי הפליטות הללו שוות הוא כינה את נקודת isosbestic. כאשר GCaMP הוא נרגש בשלב זה, הפליטה שלה אינו מושפע על ידי שינויים בריכוזי סידן פנימיים, ושונות באות הוא בדרך כלל בשל הנחתה של האות מפני כיפוף יתר של כבל טלאי סיבים אופטיים או תנועה של רקמות עצביות ביחס לסיבים המושתל.

אלקטרופיזיולוגיה של יחידה בודדת היא עדיין תקן זהב עבור בחופשיות-נע הקלטות vivo בשל התא היחיד שלה ברמת ספייק רזולוציה. עם זאת, זה יכול להיות קשה לאתר את הזהות המולקולרית של התאים המוקלטת, וניתוח שלאחר-הוק יכול להיות מפרך למדי. בעוד הסיבים האופטיים אין ברזולוציה של תא יחיד, זה מאפשר לחוקרים לשאול שאלות בלתי אפשרי לטפל בטכניקות מסורתיות. שילוב של אסטרטגיות ויראליות עם בעלי חיים טרנסגניים, הביטוי של הסמפור יכול להיות מופנה לטיפוסים עצביים מוגדרים גנטית להקליט פעילות עצבית או הגדרת הקרנה, אשר ניתן לבצע על ידי ניטור אותות סידן ישירות באקסון טרמינל10,11. יתר על כן, על ידי שתילת הצינורית סיבים אופטיים מרובים, ניתן לנטר בו את הפעילות העצבית ממספר אזורי המוח ומסלולים באותה חיה12,13.

בכתב יד זה, אנו מתארים טכניקה עבור ליחיד ורב סיבים מרובה, כיצד לתקן את הפריטים עצמאיים סידן, ופרטים כיצד לבצע הקלטות מונו וצבע כפול. כמו כן, אנו מספקים דוגמאות לסוגי השאלות שהוא מאפשר לאדם לשאול ולרמות הגדלות של מורכבות (ראה איור 1). ההתקנה סיבים photometry עבור הקלטות multi-סיבים המפורטים בפרוטוקול זה ניתן לבנות באמצעות רשימה של חומרים שנמצאו ב https://sites.google.com/view/multifp/hardware (איור 2).

זה חיוני כי המערכת יהיה מצויד הן 410 ננומטר ו 470 אורכי גל הריגוש ננומטר עבור סידן עצמאית ו סידן התלות של הקרינה מGCaMP6 או המשתנים שלה. עבור הגדרות מותאמות אישית או אם אין תוכנה זמינה להפעלת המערכת, ניתן להשתמש בתוכנת קוד פתוח בונסאי (http://www.open-ephys.org/bonsai/) בחינם. לחילופין, ניתן להפעיל את הסיבים האופטיים באמצעות MATLAB (למשל, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 או שפת תכנות אחרת14. התוכנה והחומרה של המערכת צריך לאפשר מניפולציה הן 410 nm ו 470 נוריות ננומטר והמצלמה, הפקת תמונות (איור 2), וחישוב של עוצמת פלורסנט מתכוון באזורי העניין (rois) שצויר סביב הסיבים על התמונות. הפלט צריך להיות טבלה של ערכי עוצמה ממוצע שנרשמו עם 470 ננומטר ו 410 Led ננומטר מכל סיבים בכבל התיקון. בעת ביצוע ניסויים רב סיבים, 400 יקרומטר סיבים כרוכות עשוי להגביל את התנועה של עכברים. במקרים כאלה, מומלץ להשתמש במיתרי התיקון של 200 יקרומטר, המספקים גמישות רבה יותר. ייתכן גם שניתן יהיה להשתמש בכבלי דמה קטנים יותר במהלך אימון של עכברים.

זה חיוני כדי להיות מסוגל לחלץ נקודות זמן לאירועים של עניין במהלך רכישת סיבים photometry. אם המערכת אינה מספקת בקלות מערכת מובנית לשילוב TTLs עבור אירועים ספציפיים, אסטרטגיה חלופית היא להקצות חותמת זמן לנקודות זמן בודדות שנרשמו כדי להתיישר עם זמנים ואירועים ספציפיים במהלך הניסוי. ניתן לבצע הטבעה בזמן באמצעות שעון המחשב.

Protocol

כל הניסויים נעשו בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ובוועדות השימוש של אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו, והמדריך הקנדי לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ואושרו על ידי הגנת אוניברסיטת לאוול בעלי חיים וועדה. 1. יישור הנתיב האופטי בין מצלמת ה-CMOS (מוליך למחצה משלים מתכתי) לבין כבל הת…

Representative Results

ההתנהגות העצבית של תגובות התנהגותיות יכולה להשתנות בהתאם למגוון גורמים. בדוגמה זו, השתמשנו vivo סיבים למדוד את הפעילות של מסופי אקסון מן האזור ההיפותלמי לרוחב (lha) כי לסיים habenula לרוחב (lha). עכברים סוג פראי הוזרקו עם וירוס הקשורים adeno (AAV) קידוד GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) ב LHA ו סיבים אופטיים הושתל עם הטיפ מיד…

Discussion

הסיבים האופטיים היא גישה נגישה המאפשרת לחוקרים להקליט בכמויות גדולות-סידן דינמיקה מתוך אוכלוסיות נוירואליות מוגדרות בעלי חיים הנעים בחופשיות. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות, כולל משימות “תנועה כבד” כגון בדיקות לשחות כפויה2, פחד מיזוג18</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענק ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (NSERC: RGPIN-2017-06131) כדי סי C. P הוא משמש FRSQ שבצ בורסייר. אנו מודים גם Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) לייצור וקטורים ויראליים המשמשים במחקר זה.

Materials

1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long Thorlabs SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long Thorlabs SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long Thorlabs SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs M59L01
12.7 mm Optical Post Thorlabs TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder Thorlabs PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube Thorlabs KPS101
20x objective Thorlabs RMS20X #10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs CM1-DCH/M #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED Doric Lenses CLED_405 #2 in Figure 2
410 nm bandpass filter Thorlabs FB410-10 #5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED Doric Lenses CLED_465 #1 in Figure 2
470 nm bandpass filter Thorlabs FB470-10 #4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter Semrock FF01-560/14-25 #5 in Figure 5
560 nm LED Doric Lenses CLED_560 #1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount Thorlabs K5X1 #11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet Thorlabs AC254-035-A-ML #7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator Thorlabs AD11F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator Thorlabs AD127-F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard Thorlabs MB1824
Clamping Fork Thorlabs CF125
Cube connector Thorlabs CM1-CC
Dual 493/574 dichroic Semrock FF493/574-Di01-25×36 #10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6 Semrock FF01-535/22-25 #6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels Thorlabs XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining Thorlabs SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder Thorlabs SM1QP #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light Thorlabs F671SMA-405 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light Thorlabs F240SMA-532 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter Semrock FF01-520/35-25 In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera Thorlabs DCC3260M #13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter Neurophotometrics SPLIT #14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff Thorlabs DMLP425R #8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff Semrock FF495-Di03 #9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement C&B
M8 – M8 cable Doric Lenses Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter Semrock FF01-600/37-25 In light beam splitter
T7 LabJack LabJack
T-cube LED Driver Thorlabs LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 Thorlabs CAB-DCU-T3

References

  1. Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
  2. Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
  3. Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
  4. Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
  5. de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
  6. Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
  7. Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
  8. González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
  9. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  10. Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
  11. Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
  12. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
  13. Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
  14. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
  15. Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
  16. Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
  17. Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  18. Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
  19. Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
  20. Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
  21. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
  22. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  23. Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
  24. Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
  25. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
  26. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  27. Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
  28. Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
  29. Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).

Play Video

Cite This Article
Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. J. Vis. Exp. (152), e60278, doi:10.3791/60278 (2019).

View Video