Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio come implementare ed eseguire registrazioni di fotometria multifibra, come correggere gli artefatti indipendenti dal calcio e considerazioni importanti per l'imaging di fotometria a doppio colore.
Abstract
Registrare l'attività di un gruppo di neuroni in un animale liberamente mobile è un'impresa impegnativa. Inoltre, poiché il cervello viene sezionato in sottogruppi funzionali sempre più piccoli, diventa fondamentale registrare da proiezioni e/o sottopopolazioni geneticamente definite di neuroni. La fotometria in fibra è un approccio accessibile e potente in grado di superare queste sfide. Combinando metodologie ottiche e genetiche, l'attività neurale può essere misurata in strutture cerebrali profonde esprimendo indicatori di calcio codificati geneticamente, che traducono l'attività neurale in un segnale ottico che può essere facilmente misurato. Il protocollo attuale descrive in dettaglio i componenti di un sistema di fotometria multifibra, come accedere alle strutture cerebrali profonde per fornire e raccogliere la luce, un metodo per tenere conto degli artefatti di movimento e come elaborare e analizzare i segnali fluorescenti. Il protocollo descrive in dettaglio le considerazioni sperimentali quando si esegue l'imaging a singolo e doppio colore, da fibre ottiche impiantate singole o multiple.
Introduction
La capacità di correlare le risposte neurali con aspetti specifici del comportamento di un animale è fondamentale per comprendere il ruolo che un particolare gruppo di neuroni svolge nel dirigere o rispondere a un'azione o uno stimolo. Data la complessità del comportamento animale, con la miriade di stati interni e stimoli esterni che possono influenzare anche le azioni più semplici, la registrazione di un segnale con risoluzione a prova singola dota i ricercatori degli strumenti necessari per superare questi Limitazioni.
La fotometria in fibra è diventata la tecnica di scelta per molti ricercatori nel campo delle neuroscienze dei sistemi a causa della sua relativa semplicità rispetto ad altre tecniche di registrazione in vivo, il suo elevato rapporto segnale-rumore e la capacità di registrare in una varietà di paradigmi comportamentali1,2,3,4,5,6,7,8. A differenza dei metodi elettrofisiologici tradizionali, la fotometria è l'approccio ottico più comunemente usato in combinazione con indicatori di calcio codificati geneticamente (GECI, la serie GCaMP)9. I CCIi cambiano la loro capacità di fluorescenza in base al fatto che siano legati o meno al calcio. Poiché la concentrazione interna di calcio nei neuroni è molto strettamente regolata e i canali di calcio legati alla tensione si aprono quando un neurone attiva un potenziale d'azione, aumenta la concentrazione interna di calcio, che si traduce in aumenti transitori capacità di un GECI di fluorescenza, può essere un buon proxy per la cottura neuronale9.
Con la fotometria in fibra, la luce di eccitazione viene diretta lungo una sottile fibra ottica multimodale nel cervello e un segnale di emissione viene raccolto attraverso la stessa fibra. Poiché queste fibre ottiche sono leggere e pieghevoli, un animale può muoversi in gran parte senza ostacoli, rendendo questa tecnica compatibile con una vasta gamma di test comportamentali e condizioni. Alcune condizioni, come i movimenti rapidi o la flessione del cavo patch in fibra ottica oltre il raggio in cui può mantenere la riflessione interna totale, possono introdurre artefatti del segnale. Per disambiguare il segnale dal rumore, possiamo sfruttare una proprietà di GCaMP nota come "punto isosbestico". In breve, con GCaMP, mentre la lunghezza d'onda della luce di eccitazione viene spostata a sinistra, la sua emissione nello stato legato al calcio diminuisce e l'emissione nello stato non legato al calcio aumenta marginalmente. Il punto in cui l'intensità relativa di queste due emissioni è uguale è definita punto isosbestico. Quando GCaMP è eccitato a questo punto, la sua emissione non è influenzata da cambiamenti nelle concentrazioni interne di calcio, e la varianza nel segnale è più spesso dovuta all'attenuazione del segnale da sovraccarico del cavo patch in fibra ottica o movimento del tessuto neurale rispetto alla fibra impiantata.
L'elettrofisiologia a unità singola è ancora il gold standard per le registrazioni in vivo liberamente in movimento grazie alla sua risoluzione a cella singola e a picco singolo. Tuttavia, può essere difficile individuare l'identità molecolare delle cellule registrate e l'analisi post-hoc può essere abbastanza laboriosa. Mentre la fotometria in fibra non ha la risoluzione a cella singola, permette ai ricercatori di porre domande impossibili da affrontare con tecniche tradizionali. Combinando strategie virali con animali transgenici, l'espressione delle GeCI può essere diretta a tipi neuronali geneticamente definiti per registrare l'attività neurale definita dalla popolazione o dalla proiezione, che può essere eseguita monitorando il segnale di calcio direttamente all'assone terminali10,11. Inoltre, impiantando più cannule in fibra ottica, è possibile monitorare contemporaneamente l'attività neurale da diverse regioni e percorsi del cervello nello stesso animale12,13.
In questo manoscritto, descriviamo una tecnica per la fotometria singola e multifibra, come correggere artefatti indipendenti dal calcio e dettagliamo come eseguire registrazioni mono e doppio colore. Forniamo anche esempi dei tipi di domande che consente di porre e dei loro livelli crescenti di complessità (vedere Figura 1). La configurazione della fotometria in fibra per le registrazioni multifibra descritte in questo protocollo può essere costruita utilizzando un elenco di materiali trovati allhttps://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figura 2).
È essenziale che il sistema sia equipaggiato sia per lunghezze d'onda di eccitazione di 410 e 470 nm per l'emissione di fluorescenza indipendente dal calcio e dal calcio da GCaMP6 o le sue varianti. Per le configurazioni personalizzate o se non c'è nessun software disponibile per eseguire il sistema, il programma open source gratuito Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) può essere utilizzato. In alternativa, la fotometria in fibra può essere eseguita attraverso MATLAB (ad esempio, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 o un altro linguaggio di programmazione14. Il software e l'hardware del sistema dovrebbero consentire la manipolazione di entrambi i LED da 410 nm e 470 nm e della telecamera, l'estrazione di immagini(Figura 2)e il calcolo dell'intensità media fluorescente nelle regioni di interesse (ROI) disegnate intorno alle fibre le immagini. L'output deve essere una tabella dei valori di intensità media registrati con i LED da 470 nm e 410 nm di ogni fibra nel cavo del cerotto. Quando si eseguono esperimenti multifibra, 400 m di fibre in bundle possono limitare il movimento dei topi. In questi casi, si consiglia di utilizzare cavi di patch da 200 m, che offrono maggiore flessibilità. Può anche essere possibile utilizzare cavi fittizi più piccoli durante l'allenamento dei topi.
È fondamentale essere in grado di estrarre i punti temporali per gli eventi di interesse durante l'acquisizione della fotometria in fibra. Se il sistema non fornisce facilmente un sistema integrato per integrare i TTL per eventi specifici, una strategia alternativa consiste nell'assegnare un timestamp ai singoli punti temporali registrati per allinearsi a orari ed eventi specifici durante l'esperimento. Il timestamp può essere fatto utilizzando l'orologio del computer.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con i Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California, San Diego, e la Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dall'Université Laval Animal Protection comitato.
1. Allineamento del percorso ottico tra la telecamera CMOS (semiconduttore di ossido di metallo complementare) e il cavo patch individuale o ramificato
- Allenta tutte le viti sul traduttore a 5 assi (11, Figura 2B).
- Vite nel cavo patch (12, Figura 2B) all'adattatore [SMA (sotto-inminiatura A) o FC (connettore in fibra ottica)] che è apposto al traduttore a 5 assi.
- Accendere la luce di eccitazione 470 nm (1, Figura 2B) a bassa potenza (100 W) e posizionare la punta del patchcord che punta a un vetrino di plastica autofluorescente. Questo non ha alcuna influenza sulle registrazioni future, ma è esclusivamente per visualizzare il processo di allineamento.
- Registrare dalla fotocamera CMOS (13, Figura 2B) in modalità live. Aumentare il guadagno o regolare la tabella di ricerca (LUT) fino a quando l'immagine non è completamente nera. Il punto è quello di essere in grado di vedere un'immagine al punto focale dell'obiettivo (10, Figura 2B).
- Far avanzare il traduttore a 5 assi verso l'obiettivo, assicurando che la luce da 470 nm sia centrata sulla fibra all'estremità SMA o FC del cavo patch, fino a quando un'immagine non può essere risolta sulla fotocamera.
- Regolare gli assi X e Y fino a quando l'immagine non viene centrata e ben risolta.
- Visualizzate la luce emessa dall'estremità ferrule del cavo patch. Dovrebbe apparire come un cerchio isotropico. Se si utilizza un cavo di patch di ramificazione, la quantità di luce emessa alle estremità ferrule di ogni cavo di patch dovrebbe essere simile. Se il cerchio non è isotropico o la luce emessa non è uguale, regolare il traduttore a 5 assi nell'asse X-Y.
2. Impostazione di ROI intorno alle fibre per la misurazione dell'intensità media fluorescente
- Accendere tutte le luci di eccitazione per visualizzare meglio le fibre. Regolare il guadagno della fotocamera in modo che nessun pixel sia saturo e sia presente un'immagine chiara delle fibre.
- Registrare dal vivo o scattare un'immagine preliminare.
- Disegnare ROI intorno alle fibre e tenerli per la misurazione dei valori di intensità media durante le registrazioni (Figura 2A).
- Per registrazioni multiple in fibra, verificare l'indipendenza nei segnali.
- Record dal vivo da tutte le fibre.
- Puntare una fibra verso una fonte di luce e toccare con un dito. Le fluttuazioni molto grandi dovrebbero verificarsi esclusivamente in quel canale (perdita accettabile 1:1000).
- Se i segnali non sono indipendenti, ridisegnare i ROI più conservativi e ripetere il test di indipendenza.
- Per etichettare e tenere traccia di quale ROI corrisponde a quale fibra, nastro colorato o smalto può essere applicato alla fine delle fibre. Scatta una foto prima dell'inizio di qualsiasi esperimento come promemoria secondario.
3. Impostazione dell'arena di registrazione
- Appendere il cavo di patch sopra l'arena utilizzando supporti, morsetti o supporti.
- Assicurarsi che l'animale possa muoversi liberamente in tutta l'arena, disinibito dalla lunghezza della fibra.
- Se viene utilizzata una scatola operante o un campo aperto, assicurarsi che il cavo di patch sarà in grado di raggiungere l'animale con una flessione minima. Se questo richiede un colpo naso, assicurarsi che ci sia abbastanza spazio in testa per evitare la flessione della fibra. Evitare qualsiasi flessione o torsione eccessiva del cavo patch.
4. Registrazioni in vivo
NOTA: La procedura di impianto di cannula in fibra ottica per esperimenti di fotometria in fibra è identica alla procedura di optogenetica come descritto in Sparta et al15. Si consiglia di utilizzare cemento dentale (vedi Tabella dei materiali), che fornisce robusto ancoraggio della testata all'osso del cranio. Il cemento dentale sarà particolarmente utile nei casi in cui non è possibile utilizzare viti di ancoraggio.
- Ispezionare visivamente l'estremità distale delle fibre del cavo patch ad occhio e con un microscopio a minifibra. Se la superficie delle fibre è graffiata, rifinire le fibre utilizzando la lucidatura della fibra / pellicola di lamiera con grinta fine (1 m e 0,3 m).
- Pulire le estremità distese del cavo patch con 70% di etanolo e un applicatore di punta di cotone.
- Pulire le cannule in fibra ottica utilizzando il 70% di etanolo e un applicatore a punta di cotone.
- Collegare l'estremità ferrule del cavo patch alla fibra impiantata utilizzando un manicotto diviso in ceramica coperto con un tubo di strizzacervelli nero. Durante la connessione, assicurarsi che la manica sia stretta, altrimenti utilizzare una nuova manica.
NOTA: Ci sarà una grande quantità di perdita di segnale se c'è spazio tra il cordone del cerotto e l'impianto, e le registrazioni non funzioneranno. - Lasciare che l'animale si riprenda per alcuni minuti prima dell'inizio dei test comportamentali.
- Avviare la registrazione del segnale ottico ed eseguire l'esperimento.
- Durante la registrazione, tieni d'occhio la traccia dal vivo per garantire registrazioni di qualità. Si prevede che il segnale diminuisca rapidamente in funzione del tempo nei primi 2 min di registrazione. Questo effetto è causato dal decadimento LED mediato dal calore, per cui l'aumento di calore aumenta la resistenza dell'elemento ottico.
- Se si verifica un salto nel segnale che supera la cinetica on/off di GCaMP, questo è spesso un'indicazione che la manica non è abbastanza stretta e lo spazio tra il cavo patch e l'impianto sta cambiando. In questo caso, interrompere l'esperimento e ricollegare l'animale utilizzando una nuova manica.
5. Analisi dei dati di fotometria in fibra
NOTA: Questo è un metodo per l'analisi dei dati che funziona bene per la maggior parte delle registrazioni. Tuttavia, è possibile implementare approcci alternativi. Codice di esempio per l'analisi dei dati è disponibile qui: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.
- Estrarre i valori di intensità di fluorescenza registrati da 470 nm (Int470) e 410 nm(Int410) LED, corrispondenti a ogni singola fibra.
- Ammorbidire ogni segnale utilizzando un algoritmo della media mobile (Figura 3A).
- Eseguire la correzione della linea di base di ogni segnale (Figura 3A e 3B) utilizzando l'algoritmo adattivo appesantito reppesantito penalmente Penalmente Penalized Least Squares (airPLS) (https://github.com/zmzhang/airPLS) per rimuovere la pendenza e la bassa frequenza fluttuazioni dei segnali.
- Standardizzare ogni segnale utilizzando il valore medio e la deviazione standard (Figura 3C):
- Utilizzando la regressione lineare robusta non negativa, adattare i segnali daInt410 a z(Figura3D) alla funzione di regressione:
- Utilizzare i parametri della regressione lineare (a, b) per trovare nuovi valori di zInt410 montato su zInt470 (fitInt410, Figura 3D,E):
- Utilizzare i parametri della regressione lineare (a, b) per trovare nuovi valori di zInt410 montato su zInt470 (fitInt410, Figura 3D,E):
- Calcolare il valore dF/F normalizzato (z dF/F) (Figura 3F):
6. Registrazioni simultanee a doppio colore
- Aggiungere al sistema di fotometria un LED di 560 nm per eccitare il sensore di calcio fluorescente rosso e specchi e filtri dicromatici appropriati (vedi Kim et al., 2016 per una descrizione dettagliata)12.
- Aggiungere una barra di divisione dell'immagine tra l'obiettivo e la fotocamera CMOS per separare le lunghezze d'onda di emissione verde e rossa (vedere Figura 5). Lo splitter di immagini formerà due immagini speculari sul sensore della fotocamera, corrispondenti ai segnali rossi e verdi (ad esempio, un cavo patch con 3 rami creerà un'immagine con 6 fibre).
- Disegna ROI intorno a tutte le fibre in entrambi i colori come descritto sopra. Assicurarsi di identificare chiaramente ogni ROI con la fibra e il canale corrispondenti (verde e rosso) (Figura 4A).
- Attivare l'eccitazione simultanea con 470 nm e 560 nm LED e alternarli con 410 nm LED (Figura 5A).
7. Doppia analisi dei dati a colori
- Seguire i passaggi nella Sezione 5 per trovare fitInt410 per il segnale Int470 e calcolare z dF/F.
- Poiché il punto isosortico per i GERI con spostamento rosso è generalmente sconosciuto, il segnale registrato con LED di 410 nm nel canale verde può essere utilizzato per la correzione del movimento su entrambi i canali. Seguire i passaggi nella Sezione 5 per trovare fitInt410 per il segnale Int560 e calcolare z dF/F.
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Representative Results
Correlazioni neurali delle risposte comportamentali possono variare a seconda di una varietà di fattori. In questo esempio, abbiamo usato la fotometria in fibra in vivo per misurare l'attività dei terminali assoni dall'area ipotalamica laterale (LHA) che terminano nell'habenula laterale (LHb). I topi selvatici sono stati iniettati con un virus adeno-associato (AAV) codifica GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) nella LHA e una fibra ottica è stata impiantata con la punta immediatamente sopra la LHb (Figura 4A). L'espressione GCaMP6s si trova nei corpi cellulari del LHA e nei loro terminali assoni che si proiettano sulla LHb, dove è possibile registrare il segnale di calcio. L'attivazione del percorso LHA-LHb favorisce l'elusione passiva nel test di preferenza in tempo reale suggerendo che questa via trasmette segnali avversi16. I topi sono stati poi collegati al sistema di fotometria in fibra, collocato in un'arena aperta per 6 min ed esposti a 1 sec di velo amola aversive ogni 60 sec. La fluorescenza misurata è notevolmente aumentata in concomitanza con la somministrazione di poggiamenti d'aria (Figura 4B-C). Nei topi che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP), non è stato rilevato alcun cambiamento nel segnale durante la somministrazione di poggiatori d'aria (Figura 4C). A seguito di test comportamentali, il sito di iniezione nel LHA e il posizionamento della fibra sopra l'LHb sono stati confermati istologicamente (Figura 4A).
Figura 1: Strategie e approcci per l'espressione GECI con specificità anatomica e di tipo cellulare. (A) Un virus virale adeno-associato (AAV) codifica GCaMP6 (AAV-GCaMP6) viene iniettato in una regione del cervello di interesse. La fibra ottica può essere impiantata cronicamente con la punta posta sopra i corpi cellulari (1) o sopra i terminali assoni (2). Per l'espressione selettiva in una popolazione neuronale geneticamente definita, un AAV dipendente dal crem (ad esempio, AAV-DIO-GCaMP6) può essere iniettato in topi transgenici che esprimono la crema ricombinante in una specifica popolazione neuronale. (B) Per l'imaging a doppio colore del calcio, in questo esempio un AAV-GCaMP6 viene iniettato in una regione di interesse del cervello e un AAV dipendente dal crem che codifica un GECI con spostamento rosso (ad esempio, jrGECO1a; AAV-DIO-jrGECO1a) viene iniettato in una popolazione neuronale geneticamente definita in una regione cerebrale bersaglio. La fibra ottica viene impiantata per l'imaging simultaneo del segnale di calcio dei terminali assoni (fluorescenza verde) e dei corpi cellulari (fluorescenza rossa). (C) Per una strategia virale intersezazionale, un vettore virale con proprietà di trasporto retrogrado (come retroAAV17) che codifica la ricombinante cre (retroAAV-cre) viene iniettato nella regione del cervello di destinazione insieme a un AAV-DIO-GCaMP6s iniettato in la regione cerebrale sporche nello stesso topo. Le cannule in fibra ottica vengono impiantate sopra i corpi cellulari per una robusta registrazione del segnale dipendente dal calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema di fotometria in fibra. (A) La luce di eccitazione di due LED (410 nm e 470 nm) passa attraverso una serie di filtri e specchi dicroci e produce un punto di eccitazione alla distanza di lavoro dell'obiettivo 20x. La luce passa attraverso un singolo cavo patch o fibre in bundle (per registrazioni multiple del sito) che sono collegati alle cannule impiantate. La fluorescenza emessa viene raccolta dalle stesse fibre, filtrata e proiettata su un sensore della fotocamera CMOS. Nelle immagini catturate, l'intensità media della fluorescenza viene registrata ai ROI di ogni fibra. Per acquisire simultaneamente segnali da entrambi i LED da 410 nm e 470 nm, viene implementato un multiplexing di divisione temporale (diagramma in basso a destra). (B) Immagine del nostro sistema di fotometria su misura e dei suoi componenti: (1) Fibra al LED 465 nm, (2) Fibra al LED 405 nm, (3) Collimators, (4) filtro passabanda 470 nm, (5) 410 nm filtro passabanda, (6) filtro passabanda 535 nm, (7) Lente della metropolitana, (8) con cubo con passaggio lungo 425 specchio dicroico, (9) Cubo con longpass 495 specchio dicroico, (10) obiettivo 20x, (11) traduttore a 5 assi, (12) Cavo mono o patch in fibra di bundle, (13) fotocamera CMOS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi dei dati di fotometria in fibra. (A) Intensità fluorescenti media smussata (Int) registrate da 470 nm (linea blu superiore) e 410 nm (linea viola inferiore) lunghezze d'onda di eccitazione. Le linee nere sono linee di base trovate utilizzando l'algoritmo airPLS. (B) Cambiamenti di intensità relativi nei segnali dopo la correzione della linea di base. (C) Standardizzati 470 nm e 410 nm segnali (zInt470, top; zInt410, bottom). (D) Adattamento lineare robusto non negativo di 470 nm e 410 nm segnali. (E) Allineamento della traccia da Int410 a Int470 in base all'adattamento. (F) Corretto e normalizzato cambiamento dipendente dal calcio nella fluorescenza (z dF/F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi. (A) Diagramma della procedura sperimentale. Un AAV-GCaMP6 viene iniettato nel LHA dei topi e 4 settimane dopo, una cannula in fibra ottica viene impiantata sopra il LHb per la registrazione del segnale terminale axon. Rientro sono immagini confocali rappresentative dell'espressione GCaMP6s nei corpi cellulari dei neuroni LHA (a sinistra) e loro terminali assoni proiettando alla LHb (a destra). (B) Traccia rappresentativa del segnale di calcio nei vespe d'aria (barre verticali tratteggiate) misurati dai terminali assoni LHA proiettati da LHb misurati da un mouse che esprime GCaMP6. (C) Trama peri-evento della risposta media del calcio agli eventi airpuff. La linea verde spessa rappresenta la media e le regioni ombreggiate di verde rappresentano l'errore standard della media (SEM, pannello sinistro) e il segnale misurato prima e dopo un airpuff (3 topi, 15 eventi). (D,E) Stesse misurazioni di (B,C) per i topi che esprimono GFP (2 topi, 10 eventi). Le barre della scala sono 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Schematico della fotometria in fibra a doppio colore. (A) Un LED aggiuntivo da 560 nm, i filtri appropriati e gli specchi dicrotice e uno barra di divisione dell'immagine prima che il sensore della fotocamera venisse aggiunto alla configurazione originale. (B) Componenti del sistema di fotometria: (1) Fibra al LED 560 nm, (2) Fibra al LED 465 nm, (3) Fibra al LED 405 nm, (4) Collimatori, (5) 560 nm filtro passabanda, (6) 470 nm filtro passabanda, (7) 410 nm filtro passabanda, (8) con passo lungo 495 dichroic specchio , (9) Cubo con vinco dicroico 425, cubo (10) con specchio dicromatico 493/574, (11) obiettivo 20x, (12) traduttore a 5 assi, (13) cavo patch mono o fibra in bundle, (14) divisore immagine, (15) fotocamera CMOS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La fotometria in fibra è un approccio accessibile che consente ai ricercatori di registrare la dinamica del calcio sfuso da popolazioni neuronali definite in animali liberamente in movimento. Questo metodo può essere combinato con una vasta gamma di test comportamentali, tra cui attività "movimento pesante" come test di nuoto forzato2, paura-condizionamento18, interazioni sociali1,4, e altri7, 8,19,20. Questo permette ai ricercatori di osservare quali comportamenti o stimoli unità attività in una particolare popolazione neurale o viceversa.
Nonostante la sua semplicità di facciata prima, ci sono considerazioni importanti quando si implementa la fotometria in fibra, e il sistema dettagliato in questo protocollo offre diversi vantaggi eludendo le insidie comuni. In primo luogo, sfrutta il fatto che le varianti GCaMP hanno un punto di eccitazione isosbestica indipendente dal calcio intorno a 410 nm21 e multixing di divisione temporale per correggere i cambiamenti dipendenti dal calcio nei segnali quasi simultaneamente12. Quando i neuroni che esprimono GCaMP sono eccitati con una lunghezza d'onda di 410 nm, l'intensità di emissione di GCaMP è indipendente dal suo legame al calcio e si comporta essenzialmente come una GFP a bassa efficienza. Il multiplexing a divisione temporale utilizza nella stessa registrazione le lunghezze d'onda di eccitazione indipendente dal calcio di 410 nm e 470 nm. Il segnale registrato con la lunghezza d'onda di eccitazione di 410 nm viene utilizzato come controllo per il movimento indipendente dal calcio e i cambiamenti degli artefatti nell'intensità della fluorescenza. Si possono concepire strategie alternative che non includono usi simultanei di eccitazione isoscanica di GCaMP. Ad esempio, è possibile preparare due coorti di animali, una che esprime gFP e l'altra che esprime GCaMP2. Tuttavia, questo non è un controllo perfetto, in quanto è tra gli animali ed è più difficile identificare se una data risposta in un dato animale fosse un artefatto. In secondo luogo, la configurazione della fotometria in fibra descritta consente ai ricercatori di misurare l'attività in diversi percorsi contemporaneamente, aprendo la porta a domande riguardanti la propagazione del segnale in tutto il cervello. In terzo luogo, la registrazione a due colori consente una maggiore flessibilità per sezionare percorsi diversi nella stessa regione del cervello combinando GECI verdi e rossi (Figura 1).
Con le registrazioni di fotometria in fibra, la fluorescenza a bassissima emissione deve essere registrata attraverso il rumore di fondo. Pertanto, è fondamentale garantire la massima raccolta della fluorescenza emessa dai GECI. In primo luogo, quando si sviluppa una strategia virale si deve considerare che la registrazione dai terminali può essere difficile, perché i terminali assoni nel campo di registrazione possono essere sparse. Per risolvere questo problema, si può concepire una strategia virale intersesecale alternativa che consenta l'espressione di GCaMP in una regione di interesse e di cannula di fibra ottica impiantate sopra i corpi cellulari, dove può essere più robusta la fluorescenza misurato22,23,24. Un altro fattore che può avere un impatto negativo sul rapporto segnale-rumore è la qualità della cannula in fibra ottica e del cavo patch. Per gli impianti, è preferibile il ferrule in acciaio inossidabile, perché la zirconia è altamente autofluorescente e aumenterà il segnale di fondo. È essenziale utilizzare le cannule in fibra ottica di altissima qualità con connettori terminali ben lucidati e alte velocità di trasmissione (>85% di trasmissione). Eventuali difetti nelle fibre porteranno ad una diminuzione del rapporto segnale-rumore. Il cavo patch in fibra ottica dovrebbe essere di alta qualità pure. I fornitori producono fibre specificamente progettate per la fotometria in fibra, in cui l'autofluorescenza è ridotta al minimo possibile. I cavi patch su misura spesso non raggiungono l'efficienza necessaria. È anche importante ottimizzare l'allineamento del percorso ottico per ottenere un'immagine con tutte le fibre ben risolte nel punto focale dell'obiettivo. Inoltre, l'apertura numerica (NA) della fibra deve corrispondere a quella del cavo patch così come l'obiettivo utilizzato con il sistema. Qualsiasi mancata corrispondenza NA comporterà l'eccitazione o la perdita di luce di emissione. Tutti i passaggi precedenti forniranno segnali chiari dipendenti dal calcio. Tuttavia, è ancora necessaria una correzione del segnale. La maggior parte delle registrazioni hanno una diminuzione esponenziale della fluorescenza a causa dell'autofluorescenza nelle fibre, del decadimento del LED mediato dal calore e del fotosbiancamento. Questa diminuzione varia a seconda delle fibre e dei canali ed è importante rimuoverla in ogni canale separatamente utilizzando l'algoritmo airPLS descritto nella sezione del protocollo. In secondo luogo, si deve tener conto della correzione del movimento. Anche se i segnali GCaMP sembrano alti dove i cambiamenti degli artefatti sembrano privi di significato, è importante correggerlo con segnale indipendente dal calcio. Il grafico con i segnali allineati 410 nm e 470 nm è un riferimento che mostra quali cambiamenti di intensità sono causati da GCaMP e non artefatti.
L'aggiunta di un LED di eccitazione di 560 nm, lenti dicrodiche adeguate e un beamsplitter consente la registrazione simultanea della fluorescenza verde e rossa. Questo apre la possibilità di monitorare l'attività neurale da due popolazioni neuronali geneticamente distinte o di monitorare l'attività pressinaptica dai terminali degli assoni (ad esempio, esprimendo GCaMP6) e l'attività neuronale post-sinaptica (ad esempio, esprimendo jrGECO1a). Quando si implementano registrazioni a doppio colore, è necessario tenere presenti importanti considerazioni. Fotoconversione e fotoattivazione significative sono state segnalate per molte GECI con spostamento rosso, dove l'illuminazione con 405 nm, 488 nm e 560 nm può aumentare la fluorescenza indipendente dal calcio25. L'uso di jrGECO1a e RCaMP1b può ridurre al minimo questo problema26. Un'altra preoccupazione durante l'imaging a due colori è il segnale verde che perde nel canale rosso. Molte strategie possono essere concepite per evitare questo problema. Ad esempio, è possibile intrecciare le tre lunghezze d'onda di eccitazione per eccitare il punto isosbestico del sensore di calcio verde (410 nm), il segnale dipendente dal calcio verde (470 nm) e il sensore di calcio rosso (560 nm) in sequenza. In tal caso, è possibile fare affidamento sul punto isosorico del sensore verde per la correzione del movimento. Infine, quando si esegue l'imaging a doppio colore, è meglio acquisire un segnale più forte dal sensore di calcio rosso (ad esempio, dai somanei cellulari) perché questi hanno emissioni di fluorescenza più deboli rispetto ai sensori verdi.
Sono stati sviluppati nuovi sensori fluorescenti geneticamente codificati per il rilevamento rapido e specifico in vivo del rilascio del neurotrasmettitore22,23,24. Questi sensori emettono fluorescenza verde quando legati con il rispettivo ligando endogeno e possono essere combinati con GECI con spostamento rosso, come jrGECO1a, per il rilevamento simultaneo del rilascio del neurotrasmettitore contemporaneamente ai cambiamenti dell'attività neuronale singole fibre ottiche multiple5,27.
La fotometria in fibra offre una squisita flessibilità per monitorare l'attività neurale negli animali liberamente in movimento attraverso cavi patch in fibra ottica flessibili e leggeri. Tuttavia, non è adatto per situazioni che richiedono il movimento tra i compartimenti, come i test della camera chiaro-scuro. Questo sarà possibile con ulteriori sviluppi nel sistema di fotometria wireless28. Infine, mentre fornisce grandi vantaggi quando si monitora la dinamica neurale da più regioni del cervello, o da popolazioni neurali distinte, il segnale ottenuto in fotometria di fibra è un aggregato di molti neuroni che non possono sparare con la stessa dinamica temporale e non verrà risolto. Tuttavia, fornisce un approccio complementare all'imaging microendoscopico in vivo che risolve il segnale di calcio somatico da decine a centinaia di singoli neuroni29. Infine, durante la registrazione da più fibre in un unico animale, può essere difficile distinguere se il segnale proviene dai terminali o dai soma cellulari. La progettazione accurata degli esperimenti può superare la maggior parte di queste limitazioni. Tuttavia, lo sviluppo di nuovi GECI localizzati esclusivamente ai somadelle cellulari fornirà una maggiore risoluzione durante gli esperimenti di imaging multifibra del calcio.
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Disclosures
Sage Aronson è il CEO e fondatore di Neurophotometrics Ltd., che vende sistemi di fotometria multifibra.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) a C.P. C. P. è un chercheur-Boursier FRSQ. Ringraziamo anche il Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) per la produzione dei vettori virali utilizzati in questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25x36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 - M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
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